Część 1: Bioaktywne związki z Ephedra Fragilis: optymalizacja ekstrakcji, charakterystyka chemiczna, działanie przeciwutleniające i antyglikacyjne

Po więcej informacji. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakcyjny: Metodologia powierzchni odpowiedzi (RSM) z projektem Box-Behnken (BBD) została wykorzystana do optymalizacji ekstrakcji związków bioaktywnych z Ephedra fragilis. Wyniki sugerują, że ekstrakcja 61,93 procent etanolu w 44,43 stopnia przez 15,84 h była najlepszym rozwiązaniem dla tej kombinacji zmiennych. Surowy ekstrakt etanolowy (CEE) otrzymany w optymalnych warunkach ekstrakcji sekwencyjnie frakcjonowano rozpuszczalnikami o rosnącej polarności. Zawartość całkowitego fenolu (TP) i całkowitego flawonoidu (TF) orazprzeciwutleniaczi zmierzono aktywność antyglikacji. Profil fitochemiczny odcisku palca frakcji o najwyższej aktywności scharakteryzowano za pomocą RP-HPLC. Frakcja octanu etylu (EAF) miała najwyższą zawartość TP i TF oraz wykazywała najsilniejsze działanie antyoksydacyjne i antyglikacyjne. Wyniki analizy korelacji Pearsona wykazały, że zawartość TP i TF była wysoce istotnie skorelowana z aktywnością antyoksydacyjną i antyglikacyjną. W sumie w EAF E. fragilis zidentyfikowano sześć związków, w tym cztery kwasy fenolowe i dwa flawonoidy. Ponadto analiza dokowania molekularnego wykazała również możliwy związek między zidentyfikowanymi związkami bioaktywnymi a mechanizmami ich działania. Nasze wyniki sugerują nowe dowody na działanie antyoksydacyjne i antyglikacyjne związków bioaktywnych E. fragilis, które mogą być stosowane w leczeniu i zapobieganiu powikłaniom związanym ze starzeniem się i glikacją.

Słowa kluczowe: Ephedra fragilis; metodologia powierzchni odpowiedzi; konstrukcja Box-Behnken; związki bioaktywne; RP-HPLC; działanie antyoksydacyjne i antyglikacyjne

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej o produktach

1. Wstęp

Ciągła ekspozycja na agresorów z różnych źródeł może prowadzić do wzrostuwolne rodnikiprodukcja w ludzkim ciele, przekraczająca jego zdolność do ich regulowania, a z czasem przyczynia się do rozwoju kilku chorób związanych ze stresem oksydacyjnym, w tym starzenia się i cukrzycy[1]. Stąd,przeciwutleniaczesuplementacja może pomóc w utrzymaniu optymalnego układu biologicznego poprzez usuwanie nadmiernych stężeń wolnych rodników [2]. Wykazano, że w procesie glikacji biorą udział wolne rodniki. Glikacja, spontaniczna nieenzymatyczna reakcja między dostępnymi grupami aminowymi reszt aminokwasowych w białkach a cukrami redukującymi, zachodzi w większym stopniu w okresie starzenia i hiperglikemii, powodując wytwarzanie i akumulację zaawansowanych produktów końcowych glikacji (AGE) 3]. Oprócz tego, że zakłóca działanie białek i zmienia ich funkcjonalność, AGE mogą również

angażować się z receptorem dla AGE (RAGE), wieloligandowym receptorem powierzchniowym 45 KDa należącym do nadrodziny immunoglobulin [4] i aktywować kilka dalszych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, którym towarzyszy wzrost produkcji wolnych rodników, które przyczyniają się do powikłań patologicznych na cukrzycę [5].

Powszechnie wiadomo, że przeciwutleniacze i cząsteczki zmiataczy wolnych rodników są dobrymi obrońcami przed tymi procesami [6]. Stosowanie roślin leczniczych w zapobieganiu i równoważeniu chorób związanych ze stresem oksydacyjnym to stara tradycja medyczna. Ostatnio wiele badań wykazało, że metabolity wtórne, takie jak garbniki, kwasy fenolowe i flawonoidy o podwójnym potencjale antyoksydacyjnym i antyglikacyjnym, są bardziej skuteczne w leczeniu cukrzycy [7]. Dlatego bardzo interesujące jest zidentyfikowanie nowych źródeł fitochemikaliów, które skutecznie wymiatają wolne rodniki i redukują glikację nieenzymatyczną.

Ephedra fragilis należy do rodzaju Ephedra (rodzina Ephedracea), który obejmuje ponad 60 gatunków rosnących w warunkach pustynnych i półpustynnych na obu półkulach na sześciu kontynentach [8]. Od ponad 5000 lat wiele gatunków z rodzaju Ephedra jest powszechnie stosowanych w tradycyjnej medycynie chińskiej (TCM) w leczeniu wielu chorób; przeprowadzono kilka badań opisujących ich liczne korzyści zdrowotne, takie jak przeciwzapalne [9, przeciwinwazyjne, antyangiogenne, [10], przeciwbakteryjne, antyproliferacyjne, proapoptotyczne [11], neuroprotekcyjne [12], hepatoprotekcyjne i anty -właściwości utleniające [13]. Flawonoidy, alkaloidy, kwasy fenolowe i inne związki w roślinach Ephedra zostały uznane za główne składniki fitochemiczne tych właściwości farmakologicznych [14]. W przemyśle farmaceutycznym wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (RP-HPLC) jest szeroko stosowana jako metoda analityczna do wykrywania i identyfikacji związków chemicznych w oparciu o ich różne właściwości hydrofobowe, chociaż w literaturze opisano niewiele badań dotyczących analizy chemicznej Gatunki efedry.

Proces ekstrakcji tych związków bioaktywnych z różnych źródeł roślinnych jest pierwszym ważnym etapem ich analizy jakościowej i ilościowej [15]. Różne czynniki, a mianowicie. metoda ekstrakcji, rodzaj i stężenie rozpuszczalnika, temperatura, czas i inne mogą znacząco wpływać na skład i szybkość ekstrakcji tych związków [16]. Dlatego konieczna jest optymalizacja procesów ekstrakcji, aby uzyskać wysoką zawartość roślinnych związków aktywnych. Oryginalnie opracowana w latach 50. XX wieku przez Boxa i Wilsona metodologia powierzchni odpowiedzi (RSM) jest obecnie najczęściej używanym narzędziem do wykonywania, ulepszania i optymalizacji takich procesów, w których niezależne czynniki mają łączny wpływ na pożądaną odpowiedź. Jednym z najczęściej wybieranych przez badaczy projektów w RSM jest projekt Boxa-Behnkena (BBD), ponieważ wymaga ograniczonej próby, a zatem stanowi alternatywę, która pozwala uniknąć długotrwałych eksperymentów i zmniejsza koszty [17-19].

Do chwili obecnej w literaturze nie ma badań dotyczących optymalizacji ekstrakcji związków bioaktywnych E. fragilis. W związku z tym badanie to miało na celu optymalizację ekstrakcji całkowitej zawartości fenoli (TP) i flawonoidów (TF) z E.fragilis poprzez zastosowanie BBD. Surowy ekstrakt etanolowy (CEE) otrzymany w optymalnych warunkach ekstrakcji był sekwencyjnie frakcjonowany rozpuszczalnikami o rosnącej polarności, a ich działanie przeciwutleniające i antyglikacyjne badano za pomocą różnych testów in vitro. Na koniec przeprowadziliśmy analizę in silico, aby lepiej zrozumieć mechanizmy, dzięki którym związki bioaktywne w EAE, zidentyfikowane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą (RP-HPLC), wiążą się z BSA i RAGE jako białkami docelowymi.

2. Wyniki i dyskusja

2.1. Dopasowanie modeli

RSM with a BBD was applied to investigate the effect of ethanol concentration (%, Xj), temperature(°C, X2), and time (h, X3)on the extraction yield of TP and TF from E. fragilis. The results of 15 trials after the BBD are given in Table 1. Analysis of variance(ANOVA)(Table 2) indicates that the models were significant as evidenced by F and p-values. The coefficient of multiple determinations (R')of the models were 0.9935 and 0.9939 for TP and TF, respectively, suggesting that only 0.65 and 0.61%of the total variations are not explained by the models. A comparable value of adjusted R2 to R2 represents an excellent statistical model. As given in Table 2, the adjusted R2(0.9818 and 0.983 for TP and TF contents, respectively) is close to R2, which means that the insignificant terms were not included in the models. Moreover, predicted R2(0.9012 and 0.9338 for TP and TF contents, respectively) is in reasonable agreement with adjusted R2 and confirms that the models are highly significant. The"fitness" of the models was also confirmed using the lack of fit test The insignificant p-value for lack of fit (p >{{0}}.05) dla dwóch odpowiedzi wskazuje przydatność modeli do dokładnego przewidywania zmienności wyników [20]. Dobra precyzja jest opisywana jako stosunek sygnału do szumu większy niż 4, co uważa się za pożądane [21]. Wartości odpowiedniej precyzji wynoszą odpowiednio 29,4772 i 28,729 dla zawartości TP i TF, wykazując odpowiedni sygnał. Jednocześnie mniejsze wartości współczynnika zmienności (procent CV) (odpowiednio 1,52 i 0,4246 procent dla zawartości TP i TF) wskazują na lepszą precyzję i wiarygodność wartości eksperymentalnych. Dla każdego czynnika odpowiedzi dokładnie zbadano wpływ czynników ekstrakcji XI (stężenie etanolu), X2 (temperatura ekstrakcji) i X3 (czas ekstrakcji) (tabela 2). Istotność każdego współczynnika testowano za pomocą wartości F i p, biorąc pod uwagę, że większa wartość F i mniejsza wartość p zawsze prowadziły do ​​bardziej istotnej zgodności między różnymi zmiennymi niezależnymi [22]. Łącznie wyniki te wskazywały, że modele były odtwarzalne i nadawały się do optymalizacji.

2.2. Wpływ zmiennych ekstrakcji na zawartość TP

Jak podano w Tabeli 2, wyniki ANOVA wykazały istotny wpływ liniowy (X i X2), kwadratowy (Xj, X5 i X) oraz interaktywny (X1X i X2X3) na zawartość TP. Wśród nich zawartość TP zależy głównie od X, X3 przy p<0.001 followed="" by="" x1="" and="" x1x,="" at=""><0.01. the="" following="" second-order="" polynomial="" equation="" could="" be="" used="" to="" express="" the="" relationship="" between="" tp="" content="" and="">

Wartość braku dopasowania była nieistotna (wartość F =11.02, wartość p=0.0843), co wskazuje, że model jest dobrze dopasowany z dobrą predykcją (R{ {9}}.9935; Przym. R2=0.9818)(Tabela 2).

Interakcje między stężeniem etanolu a temperaturą ekstrakcji (XjX2) dają bardzo istotne (p<0.01)effect on="" tp="" content="" (table2).="" as="" ethanol="" concentration="" (x1)="" and="" extraction="" temperature="" (x)increase="" in="" the="" range="" of="" 40-61.80%="" and="" 25-44.30°c="" respectively,="" the="" tp="" content="" increases="" rapidly.="" however,="" beyond="" 61.80%and="" 44.30°c,="" tp="" content="" decreases="" slightly(figure="" 1a).="" however,="" the="" interaction="" of="" the="" extraction="" temperature="" and="" extraction="" time="" (x2x3)showed="" a="" highly=""><0.001) effect="" on="" tp="" content="" (table="" 2).="" as="" shown="" in="" figure="" 1b,="" tp="" content="" slightly="" improved="" with="" increasing="" extraction="" temperature="" (x2)and="" extraction="" time="" (x3)up="" to="" 44.37℃c="" and="" 15.77="" h,="" respectively,="" but="" diminished="" slowly="">

Efekty te mogą wynikać z faktu, że związki fenolowe są cząsteczkami polarnymi, które naturalnie występują z glukozydami, co czyni je bardziej rozpuszczalnymi w wodzie [23]. Ponieważ ekstrakcja związków fenolowych jest silnie uzależniona od polarności rozpuszczalnika, mieszanina woda-alkohol jest bardziej efektywna w jej ekstrakcji niż sam alkohol [20]. W odniesieniu do zasady „podobny-rozpuszcza się podobny”, spadek stężenia etanolu prowadzi do wzrostu polarności rozpuszczalnika, co pomaga w rozpuszczaniu TP[15]. Niemniej jednak wysokie stężenie etanolu może wpływać na szybkość ekstrakcji, zapobiegając rozpuszczaniu się związków fenolowych. Podobnie, wzrost temperatury ekstrakcji wzmocnił odzyskiwanie docelowych związków fenolowych przez zmiękczenie tkanek, osłabił integralność ściany komórkowej, zwiększony transfer masy i penetrację rozpuszczalnika do macierzy roślinnej oraz zwiększył zarówno rozpuszczalność, jak i szybkość dyfuzji; jednak temperatury zbyt wysokie dla wydłużonego czasu ekstrakcji mogą zwiększać szanse ich degradacji [23]. Ponadto stwierdzono, że długi okres ekstrakcji potencjalnie wydłuża ekspozycję na tlen i światło, co ostatecznie zwiększa ryzyko powstawania wolnych rodników, które mogą być wymiatane przez związki fenolowe [23]. Dlatego wydłużony czas ekstrakcji nie był pomocny w maksymalizacji wydajności ekstrakcji [24].

2.3.Wpływ zmiennych ekstrakcji na zawartość TF

Jak widać z Tabeli 2, efekty liniowe X i X3; efekty kwadratowe X i X; a efekt interakcji X1X2 i XjXg wykazał znaczący wpływ na zawartość TF. Spośród wszystkich istotnych czynników TF zależy głównie od X3,X,X,X i X1X2 na p<0.001 followed="" by="" x="" andx1x3="" at=""><0.01. the="" fitted="" second-order="" polynomial="" of="" tf="" content="" is="" as="">

Nieistotna wartość braku dopasowania (wartość F=1,13; wartość p=0,5024) sugerowała, że ​​proponowany model dopasował się do przestrzennego wpływu zmiennych na odpowiedź z dobrym przewidywanie (R2=0.9939; Adj R2= 0.9830) (Tabela 2).

Wygenerowano różne wykresy powierzchni odpowiedzi 3D dla zawartości TF i pokazano na rysunku 1D-F. Efekt interakcji stężenia etanolu i temperatury ekstrakcji (X1X2) wykazał istotny (p<0.001) effect="" on="" tf="" content.="" from="" figure="" 1d,="" tf="" content="" increased="" at="" first="" and="" then="" decreased="" quickly="" with="" the="" rise="" of="" the="" two="" parameters,="" and="" a="" maximum="" tf="" content="" was="" achieved="" when="" ethanol="" concentration="" (xj)="" and="" extraction="" temperature="" (xo)were="" 61.89%="" and="" 44.23°c,="" respectively.="" this="" phenomenon="" is="" similar="" to="" tp,="" which="" might="" also="" be="" attributed="" to="" the="" fact="" that="" a="" rise="" in="" the="" extraction="" temperature,="" the="" solubility,="" extraction="" rate,="" and="" diffusion="" rate="" increase,="" which="" ultimately="" helps="" tf="" to="" dissolve="" insolvent="">

Podobnie, interakcja między stężeniem etanolu a czasem ekstrakcji (XIX3) wykazała podobną korelację (Rysunek 1F). Wydajność ekstrakcji TF stopniowo wzrastała wraz ze wzrostem zarówno stężenia etanolu (Xj), jak i czasu ekstrakcji (X3). W pobliżu punktu środkowego wykresu odpowiedzi (61,89 procent i 15,81 h odpowiednio dla X i X3) wydajność TF osiągnęła najwyższy poziom, ale potem powoli spadała. Zjawisko to najprawdopodobniej wynika z drugiego prawa dyfuzji Ficka, które ujawnia, że ​​ostateczna równowaga pomiędzy stężeniem roztworu w stałej matrycy i rozpuszczalniku zostanie osiągnięta po określonym czasie, co prowadzi do zmniejszenia wydajności ekstrakcji związków docelowych [26] .

2.4. Walidacja zoptymalizowanych warunków

Celem optymalizacji było określenie warunków ekstrakcji, które zapewnią jednocześnie najwyższą zawartość TP i TF. Do przeprowadzenia optymalizacji wykorzystano oprogramowanie do projektowania. BBD zaproponowała, aby optymalne stężenie etanolu, temperatura ekstrakcji i czas wynosiły odpowiednio 61,93 procent, 44,43 stopnia i 15,84 godziny dla ekstrakcji bioaktywnych związków E. fragilis. W tym optymalnym punkcie przewidywane zawartości TP i TF wynosiły odpowiednio 15,335 mg GAE/g sm i 2,972 mg OE/g sm (Tabela 3). Walidację zdolności predykcyjnych modeli przeprowadzono eksperymentalnie w optymalnych warunkach uzyskanych z RSM. Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach w uzyskanych warunkach, a średnie zawartości TP i TF wynosiły odpowiednio 14,98±0,29GAE/g DW i 2,92±00,09 QE/g DW. Wartości eksperymentalne badanych odpowiedzi były porównywalne i zgodne z wartościami przewidywanymi, co potwierdziło, że modele były wystarczające do odzwierciedlenia oczekiwanej optymalizacji.

2.5. Wydajność ekstrakcji i analiza fitochemiczna

Tabela 4 przedstawia wydajność ekstrakcji E.fragilis CEE i jej frakcji. Nasze wyniki wykazały, że wydajność ekstrakcji w różnych frakcjach różni się znacznie od 0,78 do 10,6 procent (w/w). Jak pokazano w tabeli 4, CEE (1{{14} },6 proc. ) miał najwyższy procentowy plon, następnie WF (2,73 proc.), WBF (2,04 proc.), DMF (0,64 proc.) i EAF (0,93 proc.), natomiast HF (0,78 proc.) ) miał najniższą wydajność procentową.

Zawartość TP E. fragilis CEE i jej frakcji określono za pomocą równania regresji krzywej kalibracyjnej (y {{0}}.009x-0.{{ 25}}154; R2=0.9973) i wyrażone w miligramach równoważników kwasu galusowego (GAE) na gram suchej masy (tabela 4). Ogólnie rzecz biorąc, EAF miał najwyższą zawartość TP (32,78±0,49 mg GAE/g DW), a następnie kolejno WBF, DMF i CEE (25,02±1,011,19,21±0,22 i 14,98±0,29 mg GAE/g DW), natomiast WF i HF prezentowały najniższe zawartości (odpowiednio 10,47±0,71 i 8,14±0,17 mg GAE/g DW). Zawartość TF w E. fragilis CEE i jego frakcjach oceniono metodą kolorymetryczną z chlorkiem glinu, stosująckwercetynaas a standard (y=0.0295x+0.0361; R2=0.9986)(Table 4). Similar to the TP content, the same results were observed in the TF content with the highest and lowest content being detected in the EAF(10.50 ± 0.11 mg OE/g of DW)and HF(1.65± 0.13 mg OE/g of DW), respectively. The TF content is arranged as the following sequence: EAF>WBF>DMF> CEE>WF>HF. Co ciekawe, zawartości TP i TF w EAF były 2,18 i 3,59-razy wyższe niż w CEE, co sugeruje, że octan etylu może być odpowiednim rozpuszczalnikiem do zatężania większej ilości dostępnych związków fenolowych i flawonoidów podczas frakcjonowania CEE. Nasze dane dotyczące zawartości TP i TF są zgodne z danymi Yao i in. [27], którzy podają, że EAF uzyskany z rośliny leczniczej Pyrola asarifolia miał najwyższy poziom fenoli i flawonoidów w porównaniu z innymi frakcjami (eter naftowy, n-butanol i woda). W swoich badaniach Bhardwaj i in. [28] również odnotowali podobne wyniki przy użyciu kilku rozpuszczalników o rosnącej polarności (n-heksan, chloroform, octan etylu i n-butanol) w rozszczepianiu rośliny leczniczej Codonopsis clematidea. Według tych autorów, EAF ma najwyższą zawartość TP i TF, daleko za nią plasują się n-butanol, chloroform i heksan. Ta znacząca zmienność wydajności ekstrakcji, składu i czystości związków fenolowych między frakcjami jest prawdopodobnie spowodowana różnicami w polarności składników występujących w materiałach roślinnych, ich budowie chemicznej, stopniu polimeryzacji i ich wzajemnej interakcji [29]. ].

2.6. Aktywność przeciwutleniająca in vitro

2.6.1.DPPH „Działanie oczyszczania

DPPH” jest jednym z niewielu stabilnych wolnych rodników, które są szeroko stosowane do badania potencjału antyoksydacyjnego ekstraktów roślinnych [30]. .

Zbadano zdolność wymiatania CEE/frakcji, a także VC w różnych dawkach na wolnym rodniku DPPH*. Rysunek 2A pokazuje, że wszystkie frakcje wykazywały wyraźną aktywność zmiatania DPPH·w sposób zależny od dawki w zakresie 0,1 do 1 mg/ml. W dawce 1 mg/ml,64,32,44,1{{22} },67,24,86,63,80,95,51,37 i 99,62 procent radykałów DPPH zostało wygaszonych odpowiednio przez CEE, HE, DMF, EAF, WBF, WF i VC. Najniższe IC50 dla zmiatania DPPH"spośród wszystkich frakcji zostało wykazane przez EAF(0.116±{{30}}.015 mg/mL )poprzednio WBF (0,175 ± 0.03 mg/ml), CEE (0,23 ± 0,065 mg/ml) i DMF (0,297 ±0,044 mg/ml).WF i HF wykazały stosunkowo wyższe wartości IC50 (odpowiednio 0,964±0,178 i 1,245±0,105 mg/ml).

Observed differentials in the scavenging activities of the fractions against the DPPH*radical may be assigned to the structural characteristics and the number of phenolic compounds present in each fraction. Similar results were observed in the medicinal plant Liquidambar formosana Hance leaf since the EAF was more effective than the other fractions (dichloromethane, n-butanol, and water fractions)[31]. As a standard molecule, ascorbic acid (VC) displayed the lowest IC50 value (0.039 ±0.009 mg/mL) in comparison to all fractions. The scavenging potential is in decreasing order of VC>EAF> WBF>DMF >CEE>WF>HF.

Wartość IC50 dla zmiatania rodników DPPH była istotnie dodatnio skorelowana z obiema zawartością TP (r=0,963;p<0.01) and="" tf="" content(r=""><0.01)as presented="" in="" table="" 5.="" therefore,="" the="" discovered="" antioxidant="" activity="" suggested="" that="" eaf="" can="" be="" a="" source="" of="" numerous="" natural="" compounds="" with="" antioxidant="" properties="" that="" can="" act="" as="" hydrogen="" donors="" to="" terminate="" the="" process="" of="" oxidation="" by="" converting="" the="" free="" radicals="" to="" their="" stable="">

2.6.2.ABTS· plus Oczyszczanie

Test zmiatania ABTS jest szeroko stosowany jako wskaźnik do informowania i badania zdolności antyoksydacyjnych czystych związków, jak również naturalnych ekstraktów [32,33]. Blaknięcie niebiesko-zielonego koloru chromoforu ABTS* przy 734 w obecności ekstraktu roślinnego może wskazywać na aktywność przeciwutleniającą.

Jak pokazano na Rysunku 2B, krzywa oczyszczania CEE/frakcje na ABTS* plus wykazywała tendencję wzrostową wraz ze wzrostem stężenia. Przy 1 mg/ml, współczynniki usuwania CEE, HF, DMF, WBF, EAF, WF i VC wynosiły 800,31,40,54,88,76, 9{{2{ {22}}}}.11,82,97, 67,36 i 94,90 procent . Spośród wszystkich frakcji, minimalna wartość ICs0 została wykazana przez EAF(0.11{{30}}±0.014 mg/ mL)poprzednio DMF (0.196±0.023 mg/mL),WBF (0.277±0.031 mg/mL), CEE (0,429 ±0,039 mg/mL) i WF (0,654±0,043 mg/mL), podczas gdy HF wykazała najwyższą wartość ICs0 (1,314±0,104 mg/mL). Łącznie to odkrycie było zgodne z odkryciem Kaewseejana i Siriamornpun [29]. Porównanie ze zdolnością hamującą VC (0,025±0,005 mg/ml) wykazało, że aktywność oczyszczająca CEE i jego frakcji była nieco słaba.

Jak przedstawiono w tabeli 5, wysoce istotna korelacja wymiatania rodników ABTS z zawartością TP (r=0.921;p<0.01), and="" a="" significant="" correlation="" with="" tf="" content="" (r=""><0.05), were="" shown.="" this="" finding="" confirms="" the="" results="" obtained="" for="" the="" dpph*scavenging="" assay,="" proving="" the="" capacity="" of="" eaf="" to="" scavenge="" free="">

2.6.3. Aktywność usuwania H2O2

Będąc głównym czynnikiem przyczyniającym się do stresu oksydacyjnego, H2O2 łatwo dyfunduje przez komórki przez błonę jako cząsteczka przekaźnikowa [34]. Podsumowując, sam H2O2 nie jest niebezpieczny [35], ale może reagować z Fe2 poprzez reakcję Fentona i daje początek wysoce reaktywnemu rodnikowi hydroksylowemu (OH*)[36]. W związku z tym jest to najbardziej szkodliwy ROS dla biomolekuł. Dlatego konieczna jest ocena zdolności CCE i jego różnych frakcji do wymiatania H2O2.

Scavenging activities of CEE/fractions, as well as standard antioxidants, were presented in Figure 2C. Notably, all extracts showed a strong scavenging activity on HO, which increased with the increase of sample doses ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Moreover, the H2O2 scavenging potential decreased in the order of EAF> WBF>DMF>CEE>WF>HF i odpowiadająca jej zdolność oczyszczania przy 1,0 mg/ml wyniosły odpowiednio 84,56,75,24, 67,17,56,18, 50,19 i 34,95 procent, co było znacznie niższe niż w przypadku VC (98,03 procent).

Spośród wszystkich frakcji EAF wykazywał najniższą wartość IC50 (ICs0= 0.098±00,013 mg/mL) i był znacząco wyższy niż VC (0,024±0,006 mg/ml). Może to być spowodowane obecnością w EAF wysokiej zawartości związków fenolowych i flawonoidowych, o których powszechnie wiadomo, że odgrywają kluczową rolę jako przeciwutleniacze w układach biologicznych. W naszym ostatnim badaniu wykazaliśmy zdolność EAF z E.fragilis do ochrony Tetrahymena pyriformis przed uszkodzeniem oksydacyjnym wywoływanym przez H2O2- [37].

Nasza analiza danych wykazała, że ​​podobnie jak w przypadku wyników DPPH" i ABTS* plus, odnotowano silną dodatnią korelację wartości ICs0 dla usuwania H2O2 z obu zawartością TP (r=0.926; p<0.01) and="" tf="" content="" (r=""><0.01)(table 5).="" in="" their="" study,="" sroka="" and="" cisowski="" [38]="" reported="" also="" a="" positive="" correlation="" between="" phenolic="" compounds="" with="" ho2-scavenging="" ability.="" according="" to="" these="" authors,="" the="" ho2-scavenging="" depended="" strongly="" on="" the="" number,="" positions,="" and="" the="" model="" of="" substitution="" of="" oh="" bonded="" to="" the="" aromatic="" ring="" of="" phenolic="">

2.6.4. Zmniejszenie mocy

Siła redukująca ekstraktu działa jako wskaźnik jego potencjalnej aktywności antyoksydacyjnej [39, A40]. Potencjał antyoksydacyjny jest szacowany na podstawie zdolności antyoksydantów do redukcji żelaza (Fe3) w chlorku żelazowym do żelaza (Fe2 plus ). Generalnie właściwości redukujące przypisuje się obecności w ekstraktach roślinnych reduktonów, o których wiadomo, że działają poprzez rozrywanie łańcucha wolnych rodników poprzez oddanie atomu wodoru [41].

Figura 2D przedstawia krzywą odpowiedzi na dawkę dla mocy redukującej ekstraktów E. fragilis. Wiadomo, że im wyższa absorbancja przy 700 nm, tym większa zdolność redukcji. W obecnym badaniu CEE i jego pięć frakcji wykazywały znaczną siłę redukującą w sposób zależny od stężenia.

EAF wykazywał maksymalną aktywność przeciwutleniającą (EC{{0}}.136± 0.{{10}}13 mg/mL) w porównaniu z VC (EC{{4 }}.083± 0.005 mg/ml). Tuż za nim znalazły się WBF (EC50=0.180 ± 0,028 mg/ml), DMF (EC50=0.319 ± 0,031 mg/mL), CEE (EC50=0.334±0,029 mg/mL)i WF (EC50=0.398±0.064 mg/mL) HF pozostawał w tyle, wykazując minimalną aktywność mocy redukującej (EC5s0 =0.626±0,068 mg/mL) w porównaniu z innymi frakcjami. Te odkrycia sugerują, że EAF może zawierać różne indywidualne związki, które mają skuteczną i silną aktywność energetyczną. Naukowcy odkryli, że ekstrakty octanu etylu mogą służyć jako silne przeciwutleniacze [42].

Zaobserwowano dodatnią korelację między mocą redukującą a zawartością TP i TF (r=0.975; p<0.01 and="" r="0.987;"><0.01; respectively).these="" correlations="" confirmed="" the="" contribution="" of="" phenolic="" compounds="" in="" the="" reducing="" power="">

2.6.5. Test fosfomolibdenowy

TAC CEE i jego frakcji, a także VC oceniano za pomocą testu fosfo-molibdenowego i wyrażano jako ECs0, które jest stężeniem zapewniającym 0.5 absorbancji. Metoda polegała na redukcji Mo(VI) do Mo(V) przez ekstrakty do postaci zielonego kompleksu fosforan/Mo(V) przy kwaśnym pH z maksymalną absorpcją przy 695 nm [43].

As shown in Figure 2E, the total antioxidant capacity of CCE/fractions and VC correlated well with increasing concentrations in the range of 0.1 to 1 mg/mL.Of the CEE fractions, the ECs0 values ranged from 0.159±0.019 to 0.604±0.073 mg/mL, with a descending order of EAF>WBF> DMF> CEE >WF>HF(p<0.05), which="" indicates="" that="" eaf="" and="" hf="" had="" the="" highest="" and="" lowest="" antioxidant="" activity,="" respectively.="" this="" activity="" could="" be="" due="" to="" the="" presence="" in="" eaf="" of="" various="" phenolic="" compounds="" that="" might="" possess="" antioxidant="" activity.="" vc,="" which="" is="" the="" positive="" control,="" displayed="" the="" lowest="" ec5o="" value="" (0.095±="" 0.008="" mg/ml)="" in="" comparison="" to="" all="">

Zaobserwowano wysoce istotną korelację między całkowitą aktywnością antyoksydacyjną a zawartością TP i TF (r=0,978 dla obu;p<0.01) and="" is="" shown="" as="" presented="" in="">

2.6.6. -System modelowy karoten-linoleinian

W modelu kwasu -karotenowo-linolowego wysoce nienasycone cząsteczki -karotenu ulegają szybkiemu przebarwieniu pod wpływem wolnych rodników linoleinianowych powstających w wyniku utleniania kwasu linolowego [44]. Suplementacja przeciwutleniaczami może zminimalizować utlenianie -karotenu poprzez neutralizację wolnych rodników linoleinianu, a tym samym hamując bielenie -karotenu [45].

Antioxidant activity of CCE/fractions and BHT, as measured by the β-carotene-linoleate model, are shown in Figure 2F. All tested extracts showed concentration-dependent scavenging activity. The EAF, which contained the highest amount of phenolics and flavonoids contents, showed a significant effect in inhibiting β-carotene bleaching, reaching 74.75%at a concentration of 1mg/mL. WBF, CCE, DMF, HF, and WF inhibited the oxidation of β-carotene by 51.61,58.12,50.09,41.39, and 31.66% respectively, at the same concentration. Overall, decreasing antioxidant activity was depicted as EAF> WBF> CEE>DMF>HF>WF.

EAF wykazywał minimalną wartość IC50(IC50=0.127 ± 0.{{10}}42 mg/mL) w porównaniu z BHT (IC { {5}}.049 ± 0.001 mg/ml). WBF. CCE. DME. MY. i HF wykazała stosunkowo wyższe wartości IC0 0.5±0,111 mg/ml, 0,998 ±0,101 mg/ml, 1,073±0,084 mg/ml, 1,402±0,058 mg/ml, oraz 2,209±0,081 mg/ml, odpowiednio.

Zaobserwowano istotną dodatnią korelację między zmiataniem utleniania -karotenu a zawartością obu TP (r= 0.850;p<0.05) and="" tf="" content="" (r=""><0.05)(table 5).="" this="" result="" suggests="" that="" eaf="" may="" contain="" some="" antioxidants="" that="" can="" inhibit="" the="" formation="" of="" hydroperoxide="" and="" stop="" the="" radical-chain="" reaction="">

The involvement of reactive oxygen species (ROS) in several pathological situations has been growing recently. Bioactive compounds are gaining interest thanks to their potent antioxidant activity, but their complexity imposes the development of many methods to evaluate the antioxidant activity and the effectiveness of these chemical compounds. Thus, in this study, CEE and its fractions have been investigated for their antioxidant potential using six assays: DPPH, ABTS, H>O, RP, TAC i -karoten. W związku z tym wykazaliśmy, że silne aktywności przeciwutleniające CEE i jego frakcji wykazywały wyższą aktywność zmiatania, co może być silnie spowodowane ich składem z kwasu fenolowego i flawonoidów, takich jak kwas galusowy, rutyna i kwercetyna.