Część 1 Przewlekła choroba nerek i starzenie się różnicują materiał kostny i mikroarchitekturę u myszy C57Bl/6

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Przewlekła choroba nerek i starzenie się w różny sposób zmniejszają materiał kostny i mikroarchitekturę u myszy C57Bl/6

Chelsea M. Heveran1, Charles Schurman2,*, Claire Acevedo3, Eric W. Livingston4, Danielle Howe5, Eric G. Schaible6, Heather Hunt7, Adam Rauff8, Eve Donnelly7,#, R. Dana Carpenter9, Moshe Levi10, Anthony Lau5, Ted Bateman4 , Tamara Alliston2,*, Karen B. King11, Virginia L. Ferguson1

1 Wydział Inżynierii Mechanicznej, University of Colorado, Boulder, CO

2Klinika Chirurgii Ortopedycznej, University of California, San Francisco, CA

3 Wydział Inżynierii Mechanicznej, University of Utah, Salt Lake City, UT

4 Wydział Inżynierii Biomedycznej, University of North Carolina, Chapel Hill, NC

5 Wydział Inżynierii Biomedycznej, The College of New Jersey, Ewing, NJ

6Zaawansowane źródło światła, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA

7 Wydział Inżynierii Materiałowej, Cornell University, Ithaca, NY

8Wydział Bioinżynierii, University of Colorado, Denver, CO

9 Wydział Inżynierii Mechanicznej, University of Colorado, Denver, CO

10 Wydział Biochemii oraz Biologii Molekularnej i Komórkowej, Georgetown University, Washington DC

11Department of Orthopaedics, University of Colorado School of Medicine, Aurora, CO *University of California Berkeley – University of California San Francisco Graduate Program in Bioengineering, San Francisco, CA

# Wydział Badań, Szpital Chirurgii Specjalnej, Nowy Jork, NY

Cistanche może pomóc w chorobie nerek

Abstrakcyjny

Przewlekła choroba nerek (PChN) jest częstą chorobą związaną ze starzeniem się i zwiększa ryzyko złamań tylko w podeszłym wieku. Starzenie się i PChN w różny sposób zaburzają obrót kostny i mineralizację. Stawiamy więc hipotezę, że utrata jakości kości byłaby największa w przypadku połączenia zaawansowanego wieku i PChN. Oceniliśmy kość młodych dorosłych (6 miesięcy), w średnim wieku (18 miesięcy) i starych (24 miesiące) samców myszy C57Bl/6 trzy miesiące po 5/6 nefrektomii, aby wywołać CKD lub zabiegi pozorowane. PChN nasilała ubytki mikroarchitektury korowej i beleczkowej związane ze starzeniem się. Zarówno starzenie się, jak i PChN powodowały cieńszą, bardziej porowatą korę i mniejszą liczbę cieńszych beleczek. Jakość materiału kostnego również uległa obniżeniu w przypadku PChN, a te zmiany w materiale kostnym różniły się od zmian spowodowanych wiekiem. Starzenie zmniejszało wytrzymałość i moduł na zginanie całej kości, moduł nanowgniecenia w skali mikrometrowej oraz naprężenia tkanki i kolagenu w skali nanometrowej (rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS)). W przeciwieństwie do tego, PChN ograniczała pracę do złamań i zmienności modułu i składu tkanki kostnej (spektroskopia Ramana) oraz zwiększała procentowe odkształcenie kolagenu. Zwiększone obciążenie kolagenem było związane z utratą wytrzymałości w CKD. Ponadto luki osteocytów stały się mniejsze, rzadsze i bardziej nieuporządkowane wraz z wiekiem u myszy pozorowanych, jednak te związane z wiekiem zmiany nie były wyraźnie obserwowane w CKD. Jednak w przypadku PChN większe luki dodatnio korelowały ze zwiększonym poziomem fosforanów w surowicy, co sugeruje, że osteocyty odgrywają rolę w ogólnoustrojowej homeostazie mineralnej. Praca ta pokazuje, że PChN obniża jakość kości, w tym mikroarchitekturę i właściwości materiału kostnego, oraz że utrata jakości kości z wiekiem jest potęgowana przez PChN. Odkrycia te mogą pomóc pogodzić, dlaczego masa kostna nie pozwala konsekwentnie przewidywać złamań w populacji z PChN, a także dlaczego starsze osoby z PChN są narażone na wysokie ryzyko kruchości.

Słowa kluczowe: PChN; starzenie się; jakość kości; kruchość kości; kolagen

1. Wstęp

Przewlekła choroba nerek (PChN) dotyka około 23–36 procent starszej populacji i wiąże się ze zwiększonym ryzykiem złamań i śmiertelności związanej ze złamaniami (1,2). Chociaż utrata masy kostnej (mierzona absorpcjometrią rentgenowską o podwójnej energii) przewiduje przyszłe złamania na wszystkich etapach PChN, osoby starsze z niską masą kostną i PChN są bardziej narażone na złamania w porównaniu do osób z niską masą kostną i zdrową nerką funkcja (3). Ryzyko złamań kości jest na ogół zwiększone w przypadku PChN w porównaniu z samym starzeniem się (4,5). Na przykład w trzyletnim badaniu u osób w wieku 40-65 lat z CKD od umiarkowanego do schyłkowego częstość występowania złamań zwiększyła się o 1,7-5,1 razy w porównaniu z grupą kontrolną w tym samym wieku, podczas gdy u osób w wieku 65+ PChN nadal zwiększała częstość występowania złamań. złamania 1,8 – 4,3 razy w porównaniu z grupą kontrolną (4).

mikroarchitektury kości beleczkowej (10, 13), podczas gdy inne nie zgłaszają zmian w porównaniu z kontrolą (9). Chociaż badania te różnią się pod względem gatunku i szczepu gryzoni, metody wywoływania PChN i mierzonych wyników, te wcześniejsze prace dostarczają istotnych dowodów na to, że PChN wpływa na jakość kości.

Pozostaje kilka kluczowych pytań o to, w jaki sposób jakość kości jest obniżana przez PChN, w jakim stopniu obniżona jakość kości jest spowodowana defektami fazy mineralnej i organicznej, a także jak zmiany jakości kości wpływają na utratę twardości tkanki kostnej. Warto zauważyć, że chociaż kilka badań wykazało zmiany w sieciowaniu kolagenu i dojrzałości tkanek (tj. czas od powstania kości) w PChN, nie wiadomo, czy interakcje włókien kolagenowych w nanoskali podczas obciążenia mechanicznego są zmieniane przez PChN i czy te zmiany w nanomechanice wpływają na całość -wytrzymałość kości (11, 12). Mówiąc szerzej, nie doniesiono jeszcze o ocenie zmian jakości i mechaniki kości w odpowiedzi na PChN od skali nano do skali długości całej kości.

Rola osteocytów w wpływaniu na jakość kości w PChN i starzeniu się jest również niepewna. Komórki te zachowują się nienormalnie przez znaczne podwyższenie ekspresji FGF23 na wczesnym etapie progresji CKD (7, 14). Ostocyt jest niezbędny do utrzymania jakości materiału kostnego i regulacji odporności na złamanie kości (15-17). Zdrowie osteocytów jest częściowo wskazywane przez morfologię lakunarną. Morfologia lakunarnych osteocytów jest zmieniona, gdy osteocyt uczestniczy w homeostazie mineralnej, jak w okresie laktacji (18, 19) i hipofosfatemii sprzężonej z chromosomem X (20). Geometrie lakunarne mogą również stać się mniejsze, rzadsze i bardziej nieuporządkowane zarówno wraz ze starzeniem się, jak i nieużywaniem (21–23). Zmiany w morfologii lakunarnej osteocytów w przebiegu PChN mogą potencjalnie wpływać na odkształcenia tkanki kostnej, integralność strukturalną i mechanowrażliwość osteocytów (24). Nie wiadomo jeszcze, czy PChN wpływa na morfologię lakunarnych osteocytów i czy związek ten może się zmieniać wraz z wiekiem.

Chociaż bardziej powszechne populacje PChN obejmują osoby starsze, łączny wpływ starzenia się i PChN na jakość kości nie został jeszcze zbadany. Wcześniejsze prace wykazały, że starzenie się zmniejsza moduł, wytrzymałość i pracę przy zginaniu całej kości (25), odporność na złamania (26), mikroarchitekturę korową i gąbczastą kości (27–29) oraz zwiększa zawartość minerałów i dojrzałość (30, 31). Te zmiany w kości wraz ze starzeniem się są mylące i występują w wielu skalach długości, przy czym mechanika całej kości ma wpływ na zmiany materiału tkanki kostnej, a także struktury. Na związane z wiekiem zmiany w materiale kostnym i objętości kości częściowo wpływają odpowiednio zmniejszony obrót tkanki kostnej (tj. wyższa dojrzałość tkanki) i ujemny bilans w jednostce wielokomórkowej kości (30,32). Takie zmiany związane z wiekiem kontrastują z nieprawidłowym obrotem kostnym i mineralizacją, które często występują w PChN. Utrata mikroarchitektury wiąże się z ujemnym bilansem, który jest oczekiwany wraz z wiekiem i może wystąpić w PChN (9, 10, 13). Jednak dojrzałość tkanek wzrasta wraz z wiekiem i zmniejsza się w kontekście przewlekłej choroby nerek o dużej rotacji. Istnieją znaczne luki w zrozumieniu podstaw kruchości kości w PChN, a także tego, jak starzenie się i PChN w połączeniu obniżają jakość kości i odporność na złamania. Wyjaśnienie łącznego wpływu starzenia się i PChN na jakość kości wypełniłoby te luki w wiedzy.

Celem tego badania było zbadanie połączonego wpływu starzenia się i PChN na jakość kości, od skali nano do całej długości kości, w chirurgicznym modelu PChN u starzejących się myszy. Postawiliśmy hipotezę, że zarówno PChN, jak i starzenie się obniżają jakość kości, ale te dwa czynniki w różny sposób wpływają negatywnie na właściwości materiału tkanki kostnej. Następnie postawiliśmy hipotezę, że połączone skutki podeszłego wieku i PChN są najbardziej szkodliwe dla jakości kości. Aby ocenić te hipotezy, oceniliśmy jakość kości, w tym mikroarchitekturę korową i beleczkową oraz właściwości materiału korowego kości, u młodych dorosłych poprzez stare myszy z CKD wywołaną 5/6 nefrektomią (5/6 Nx) lub operacjami pozorowanymi.

O cistanche

2. Metody

2.1 Model zwierzęcy i przygotowanie próbki

Samce myszy C57Bl/6 uzyskano z kolonii National Institute on Aging w wieku 3, 15 i 21 miesięcy. Myszy utrzymywano w cyklu 12-h światło / 12-h ciemność, trzymane pojedynczo w klatkach z poliwęglanu ze standardową ściółką, karmione karmą Harlan Teklad 2920X i miały swobodny dostęp do wody. W każdym z trzech grup wiekowych myszy losowo przydzielono do grup z CKD lub pozorowaną. Grupa z PChN przeszła dwuetapową nefrektomię. Procedury te zostały opisane wcześniej (33). Pokrótce, dostęp do lewej nerki uzyskano przez nacięcie w linii środkowej, usunięto torebkę, aby uniknąć uszkodzenia moczowodu i nadnerczy, a następnie usunięto. Tydzień później usunięto torebkę z prawej nerki, a górny i dolny biegun częściowo wycięto, aby uzyskać zmniejszenie objętości nerek o 2/3. Grupa kontrolna otrzymała zabiegi pozorowane (tj. nacięcie w linii środkowej bez uszkodzenia nerek) w tym samym czasie. Podczas procedur myszy znieczulano 1,5% izofluranem. Po tych zabiegach i przed wyzdrowieniem podawano pooperacyjną dawkę buprenorfiny (0,5 mg/kg), a także co 12 godzin przez kolejne dwa dni. Myszy uśmiercono po trzech miesiącach za pomocą CO2 i zwichnięcia szyjki macicy. W punkcie końcowym badania myszy miały 6 (młody dorosły; Pozorowane: n=6, PChN: n=7), 18 (w średnim wieku; Pozorowane: n=8; PChN: n { {25}}) i 24 (stare; pozorowane: n=8; PChN: n=8) miesięcy. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Use and Care Committee na University of Colorado Denver.

Do analizy jakości kości zarezerwowano lewą kość udową, piszczelową, kość ramienną, promień i kość łokciową. Lewą kość piszczelową konserwowano w 70 procentach etanolu w 4 stopniach C. Wszystkie pozostałe kości owinięto gazą zwilżoną fosforanem i przechowywano w temperaturze -20 stopni C do czasu analizy.

2.2 Chemia surowicy i moczu

Analizy biochemiczne surowicy przeprowadzono na krwi i moczu pobranym w punkcie końcowym badania. Stężenie mocznika w surowicy i moczu, jak również stężenia fosforanów, wapnia i PTH w surowicy mierzono zgodnie z zaleceniami producenta (odpowiednio BioAssays Systems i Immunotropics).

2,3 mikroCT

Oceniono mikroarchitekturę kości korowej środkowej części kości udowej i beleczkowej proksymalnej kości piszczelowej za pomocą mikroCT dla wszystkich badanych myszy (μCT, Scanco 80, Scanco AG, Basserdorf, Szwajcaria). Przed skanowaniem kości udowe rozmrażano przez noc w 4 stopniach C. Skanowanie przeprowadzono przy rozmiarze woksela 10 µm, postępując zgodnie z metodami akwizycji i analizy opisanymi wcześniej (10). Parametry korowe obejmowały objętość kości/całkowitą objętość (BV/TV), powierzchnię kości/obszar całkowity (BA/TA), porowatość korową (Ct.Po), grubość kory (Ct.Th), całkowitą gęstość mineralną (TMD), moment bezwładności wokół osi przyśrodkowo-bocznej (IML), odległość między środkiem ciężkości a powierzchnią kości w kierunku przednio-tylnym (C) oraz biegunowy moment bezwładności (pMOI) (34). Parametry beleczkowania obejmowały liczbę beleczek beleczkowych (Tb.N), rozstaw beleczkowania (Tb.Sp), grubość beleczkowania (Tb.Th), objętość kości (BV), objętość całkowitą (TV), objętość kości / objętość całkowitą (BV/TV), wolumetryczna gęstość mineralna kości (vBMD) i gęstość łączności (Conn.D). Po mikroCT kości udowe ponownie owinięto w gazę zwilżoną fosforanem i przechowywano w temperaturze -20 stopni C do późniejszej charakterystyki mechanicznej całej kości.

2.4 Właściwości mechaniczne i materiałowe całej kości

Po wykonaniu microCT lewe kości udowe przeszły trzypunktowe zgięcie (system testowania materiałów Insight II, ogniwo obciążnikowe 250 N, MTS Systems Corporation, Eden Prairie MN). Kości udowe usunięto z gazy zwilżonej solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i przetestowano pod kątem uszkodzenia przy szybkości ugięcia 5 mm/min na niestandardowym kowadle o rozpiętości 8 mm. Krzywe obciążenia-przemieszczenia zostały przeanalizowane pod kątem właściwości mechanicznych, w tym sztywności, obciążenia maksymalnego, przemieszczenia przy maksymalnym obciążeniu, energii przy maksymalnym obciążeniu, obciążenia przy plastyczności, przemieszczenia przy plastyczności, energii przy plastyczności, przemieszczenia po plastyczności, obciążenia przy zerwaniu, przemieszczenia przy zerwaniu, i energia przy złamaniu. Granica plastyczności została zdefiniowana jako przecięcie siecznej linii narysowanej z 10-procentowym zmniejszeniem nachylenia od początkowej sztywności stycznej i krzywej obciążenie-przemieszczenie. Używając IML i C z µCT, oszacowaliśmy właściwości materiału, w tym moduł zginania, granicę plastyczności, naprężenie ostateczne i wytrzymałość na podstawie danych zginania trzypunktowego przy użyciu standardowych równań zginania wiązki, zastosowanych do kości udowej myszy (35).

2.5 Analiza metodą elementów skończonych sztywności proksymalnej kości piszczelowej

Aby zbadać mechaniczne zachowanie kości, zastosowano modelowanie obliczeniowe metodą elementów skończonych (FE) do symulacji osiowego ściskania proksymalnej kości piszczelowej w każdym modelu. Proksymalną kość piszczelową wybrano, ponieważ kość piszczelowa jest strukturą nośną u myszy i jest częstym miejscem analizy właściwości kości za pomocą mikroCT. Dane obrazu MicroCT proksymalnej kości piszczelowej (kości korowej i gąbczastej) wyeksportowano jako 16-bitowe wycinki obrazu DICOM w celu dalszej segmentacji i konstrukcji modeli elementów skończonych dla danego pacjenta. Dane obrazu DICOM zostały zaimportowane do pakietu Mimics Innovation Suite 18 (Materialise, Leuven Belgium) w celu przetwarzania obrazu i segmentacji w celu stworzenia odpowiedniego modelu FE dla tego samego proksymalnego obszaru kości piszczelowej analizowanej za pomocą microCT. Tkanka kostna została oddzielona od innych tkanek na obrazie przy użyciu progu segmentacji 313 mg/cm3 (36,37). Po segmentacji regionu kości wyeksportowano specyficzną dla pacjenta siatkę FE, która zawierała zarówno przedział korowy, jak i beleczkowy. W modelu FE wykorzystano sześciokątną siatkę FE z izotropowym rozmiarem elementu 10 µm.

Siatki ES wyeksportowane z Mimics zostały zaimportowane do ABAQUS CAE 6.9 w celu przypisania właściwości materiału, zastosowania warunków brzegowych i symulacji osiowego obciążenia mechanicznego. Właściwości materiałowe kości określono jako jednorodne, izotropowe i liniowo elastyczne (moduł Younga, E= 10GPa i współczynnik Poissona, v= 0.3). Aby zasymulować ściskanie osiowe, do węzłów na dolnej powierzchni kości zastosowano ustalony warunek brzegowy, a do węzłów na górna powierzchnia kości. Sztywność strukturalną kości obliczono jako siłę reakcji (N) na zastosowane przemieszczenie.

2.6 Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Deformację włókienek kolagenowych podczas badania jednoosiowego napięcia połączonych kości łokciowych i promieni mierzono za pomocą synchrotronowego rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami (SAXS) na linii wiązki 7.3.3 w Advanced Light Source (LBNL, Berkeley, CA) (38). Kości zabezpieczono klejem i papierem ściernym pomiędzy zaciskami na ich dystalnym i proksymalnym końcu. Testy rozciągania w miejscu przeprowadzono za pomocą stołu do prób rozciągania TST350 (Linkam Scientific Inc.) na uwodnionych próbkach przy szybkości przemieszczania 2,5 µm/s. Podczas badania trzon kości był eksponowany na promieniowanie rentgenowskie 1 0 keV przez 0,1 s co 5 s. Całkowite promieniowanie ograniczono do 30 kGy, aby złagodzić wpływ ekspozycji na działanie mechaniczne (39). Odstęp d kolagenu, reprezentatywny dla powtarzających się regionów przerwy w superstrukturze kolagenu, pojawia się jako wyraźny pik dyfrakcji Bragga we wzorze SAXS. Odkształcenie specyficzne dla kolagenu podczas prób rozciągania mierzono śledząc przesunięcie w pozycjach pików Bragga przy rosnących ilościach obciążenia. Wykorzystując niestandardowy program LabVIEW, ta progresywna zmiana wzorca rozpraszania została przekształcona w odkształcenie włókienek kolagenu przez normalizację do odstępu d przy zerowych obciążeniach, jak omówiono wcześniej (40). Naprężenie tkanki obliczono z sił zarejestrowanych na etapie badania podzielonych przez pomiary pola przekroju testowanych kości. Zsumowane powierzchnie przekrojów kości łokciowej i promieniowej mierzono od środka długości kości łokciowej za pomocą obrazowania odbitego w jasnym polu (Leica DM, obiektyw 20x) i określano ilościowo za pomocą ImageJ (41). Szczepy tkanek całej kości uzyskano za pomocą niestandardowego pakietu Digital Image Correlation (DIC) MATLAB, który śledził i mierzył odległości między siatką punktów nałożonych na próbkę kości podczas testowania. Odkształcenia uzyskane w DIC połączono z naprężeniami na poziomie tkanek, aby wygenerować standardowe krzywe naprężenie-odkształcenie. Z tych krzywych wyekstrahowano liniowy moduł sprężystości, jak również granicę plastyczności i odkształcenie plastyczności określone przez granicę plastyczności przesunięcia 0,2%. Odkształcenie tkanki zostało dopasowane w czasie do odkształceń kolagenu z SAXS przy granicy plastyczności i maksymalnego naprężenia w celu porównania składników przenoszących naprężenia z kością podczas deformacji.

Kontrolowaną analizę kompozytu kość łokciowa/promień podczas próby rozciągania przeprowadzono przez dopasowanie odkształcenia na poziomie tkanki z obrazów z kamery cyfrowej do odkształceń obliczonych na podstawie wzorów rozpraszania promieniowania rentgenowskiego. Cyfrowe filmy były niezależnie sprawdzane przez dwóch przeszkolonych obserwatorów pod kątem złamania i poślizgu tkanki (np. poślizgu między kością łokciową a promieniową). Zdarzenia te zostały następnie dopasowane czasowo do krzywych odkształcenia, a wszystkie dane naprężenie-odkształcenie zostały przycięte do pierwszego pęknięcia. W analizie uwzględniono tylko dane do pierwszego złamania. Próbki wykluczano, jeśli wystąpił poślizg między uchwytami rozciągającymi a kośćmi lub jeśli wystąpił poślizg między promieniem występującym przed pierwszym złamaniem. Próbki wykluczano również, jeśli istniała słaba zgodność między krzywymi odkształcenia tkanki i SAXS, co wskazuje, że plamka wiązki była skupiona na kości łokciowej, ale większość odkształcenia została przeniesiona na promień.

2.7 Dopasowana do miejsca ocena składu i modułu tkanki kostnej w mikroskali

Po trzypunktowym zgięciu kości udowe odwodniono histologicznie w stopniowanej serii etanolu, oczyszczono w acetonie i zatopiono w PMMA. Osadzone kości zostały przekrojone w środkowej części kości udowej za pomocą wolnoobrotowej piły diamentowej (Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Próbki zmielono na mokro papierem z węglika krzemu (60{{10}} i ziarnistość 1200), a następnie polerowano pastami z tlenku glinu (9, 5, 3, 1, 0,1, 0,05 µm) oraz odzież delikatną Rayon (South Bay Technologies, San Clemente, CA) do końcowego wykończenia 0,05 µm. Próbki poddano działaniu ultradźwięków pomiędzy każdym etapem polerowania.

Spektroskopię Ramana przeprowadzono na mapach obejmujących grubość warstwy korowej za pomocą niestandardowego systemu: systemu mikroskopii konfokalnej Renishaw inVia (Renishaw, Wotton-under-Edge, Gloucestershire, Wielka Brytania) przy użyciu światła laserowego o długości fali 785 nm, które było kierowane przez kable światłowodowe do 5{ Obiektyw {4}}x (NA 0,75) zamontowany na stoliku typu Z z nanowgłębnikiem (TI 950, Hysitron, Minneapolis, MN). Dla każdej lokalizacji zebrano 10 akumulacji 10-sekundowych ekspozycji. Rzędy trzech nacięć rozmieszczonych w odstępach 15 µm rozciągały się co 10 µm przez grubość kory.

Fluorescencyjną linię podstawową odjęto z dopasowaniem wielomianu 11. rzędu i promienie kosmiczne usunięto przy użyciu oprogramowania Renishaw WIRE. Od każdego punktu odjęto referencyjne widmo PMMA przy użyciu niestandardowego kodu MATLAB. Te skorygowane widma analizowano następnie dla proliny (855 cm-1), fosforanu ν1 (961 cm-1) i węglanu ν1 (1071 cm-1). Następnie obliczono proporcje powierzchni dla minerału:macierzy (fosforan:prolina),

węglan: fosforan i krystaliczność (odwrotność połowy szerokości przy pełnej maksymalnej wysokości piku fosforanu v1).

Następnie przeprowadzono nanowgłębienie w miejscach dopasowanych do miejsc ocenianych za pomocą spektroskopii Ramana. Sferyczna końcówka 5 µm wcinała się w kość przy 30 nm/s aż do uzyskania maksymalnej głębokości 500 nm. Głębokość tę utrzymywano przez 120 s, aby umożliwić rozproszenie energii lepkosprężystej. Zmniejszony moduł (Er) został obliczony przy użyciu analizy Olivera-Pharra, biorąc pod uwagę pierwsze 45 procent krzywej odciążania (42,43).

2.8 Wysokosprawna chromatografia cieczowa

Z kości ramiennej wycięto całą tkankę miękką, a szpik kostny usunięto wodą. Humeri były C, a następnie odwirowano w celu odparowania nadmiaru HCl. Przefiltrowane próbki rozcieńczono 1:5 w 10 procentach acetonitrylu i 0.05 procentowym kwasie heptafluoromasłowym (HFBA), załadowanym na odwróconą fazę Gemini-NX C{{7} } (Phenomenex, Torrance, CA) i analizowano pod kątem usieciowania hydroksylizylopirydynoliny (HP), lizylopirydynoliny (LP) i pentozydyny zgodnie z metodami opisanymi przez Bank i wsp. (44). Szczegóły systemu HPLC (model 126, Beckman-Coulter, Fullerton, CA) są szczegółowo opisane w Oren i wsp. (45). Rozdział wiązań sieciujących kolagenu obejmował następujący protokół: 15 min. rozpuszczalnika zawierającego 24 procent metanolu i 00,15 procent HFBA, 10 min. rozpuszczalnika zawierającego 40% metanolu i 0,05% HFBA i 10 min. rozpuszczalnika zawierającego 75% acetonitrylu i 0,1% HFBA. Kolumnę równoważono w 24% metanolu i 0,15% HFBA przez co najmniej 10 min. między próbkami. Piki usieciowania kolagenu mierzono detektorem fluorescencyjnym (FP1520, JASCO; Easton, ML). Długości fali wzbudzenia i emisji wynosiły odpowiednio 295 nm i 400 nm dla HP i LP. Pentozydynę wykryto przy wzbudzeniu 328 nm i emisji 378 nm. Krzywe kalibracyjne generowano ze zmierzonych natężeń pięciu rozcieńczeń kalibratora zawierającego oczyszczone HP i LP (Quidel Corporation) oraz pentozydynę (L. Sayre, Case Western Reserve University, Cleveland, OH).

Stężenia sieciowania znormalizowano następnie do stężenia kolagenu. Kolagen oszacowano na podstawie stężenia hydroksyproliny w próbce analizowanej pod kątem usieciowania. Porcję próbki analizowanej pod kątem usieciowania rozcieńczono 1:50 i poddano derywatyzacji za pomocą 9-chloromrówczanu fluoronylometylu (46). Następujące roztwory zastosowano w protokole aminokwasowym (1) 20 mM kwas cytrynowy, 5 mM chlorek tetrametyloamoniowy i 00,01% azydek sodu, pH 2,85; (2) 20 mM octan sodu, 5 mM chlorek tetrametyloamoniowy, 0,01% azydek sodu, pH 4,5 i (3) 100% acetonitryl. Profil elucji gradientowej jest następujący: od 0–11,5 min. gradient 75 procent (1) / 25 procent (3) do 60 procent (1)/40 procent (3), po 13 min. przełącz na 64 procent (2) / 36 procent (1), z 13,1 -18 min. gradient od 64 procent (2) / 36 procent (3) do 62 procent (2) / 38 procent (3), a następnie po 18 min. przejście do 25% (2) / 75% (3) do końca przebiegu w 23 min. Kolumnę równoważono w 75% (1) / 25% (3) przez co najmniej 10 min. między próbkami. Piki aminokwasów monitorowano przy wzbudzeniu 254 nm i emisji 630 nm. Krzywa kalibracyjna została wygenerowana z pięciu rozcieńczeń standardu aminokwasowego przygotowanego z hydrolizatu kolagenu (Sigma-Aldrich #A9531, St. Louis, Missouri). Kolagen ma stałe stężenie hydroksyproliny, zatem stężenie hydroksyproliny zostało przekształcone w stężenie kolagenu (285 mol hydroksyproliny na mol kolagenu).

2.9 Pomiar fluorescencyjnych AGEs

Fluorescencyjne AGE w każdej próbce określono za pomocą testu fluorometrycznego, który porównuje masę endogennej fluorescencji tkanki kostnej ze standardem chininy. Alikwotę zhydrolizowanej kości zawieszonej w wewnętrznym standardzie do HPLC rozcieńczono wodą DI do stężenia 1,6 ug kości/ml roztworu. Fluorescencję rozcieńczonego hydrolizatu i seryjnie rozcieńczonego roztworu podstawowego chininy (zapas: 10 ug chininy/ml 0,1 N H2SO4) zmierzono w płytce 96-dołkowej (produkt nr 3370, Corning) za pomocą wielomodowy czytnik mikropłytek (Synergy H1, BioTek) przy wzbudzeniu 360 nm i emisji 460 nm.

Masowe fluorescencyjne AGE normalizowano do zawartości kolagenu w tkance kostnej przy użyciu kolorymetrycznego oznaczenia hydroksyproliny. W skrócie, hydrolizat dalej rozcieńczono do roztworu podstawowego hydroksyproliny w μ/ed (200 μg L-hydroksyproliny/ml 0,001 N HCl). Do rozcieńczonego hydrolizatu dodano chloraminę-T w celu zainicjowania reakcji i roztwory inkubowano przez 20 min. w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano przez dodanie 3,15 M kwasu nadchlorowego i po 5-min. inkubacji w temperaturze pokojowej dodano p-dimetyloaminobenzaldehyd. Następnie roztwór inkubowano w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni przez 20 minut, a następnie ochłodzono w zimnej wodzie w ciemności do temperatury pokojowej. Absorbancję próbek i wzorców mierzono przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Fluorescencyjne AGE podano w jednostkach ng fluorescencji chininy/mg kolagenu.

2. 10 3D lakunarne geometrie osteocytów

Lewa kość piszczelowa została histologicznie odwodniona w stopniowanej serii etanolu i wybarwiona 1% zasadową fuksyną (47). Piszczele następnie oczyszczono acetonem i zatopiono w poli(metylo)metakrylanie (PMMA). Osadzone próbki pocięto poprzecznie 1 mm proksymalnie do połączenia piszczelowo-strzałkowego za pomocą piły wolnoobrotowej (Buehler Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Sekcja gruntowa została przygotowana z sekcji dystalnej o docelowej grubości 200 µm (Exakt 400 CS, Exakt Technologies Inc, Oklahoma City, OK).

Obrazowanie odcinków podłoża wykonano w transmisji za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Zeiss LSM 710 ze wzbudzeniem 555 nm, filtrem pasmowym 568–1000 nm i obiektywem olejowo-imersyjnym 40x. Rozdzielczość w kierunkach x, yi z wynosiła odpowiednio 0,447 i 0,493 µm. Pionowe stosy z uzyskano w widocznym zakresie luk osteocytów (50–100 µm głębokości obrazowania). Obrazy 3D luk osteocytów zostały skonstruowane i przeanalizowane pod kątem geometrii lukarnych przy użyciu programu Open Source 3D Osteocyte Lacunae Analysis i MATLAB v17 (21 ). Krótko mówiąc, każdy obraz 2D w stosie Z był automatycznie segmentowany w celu zdefiniowania luk, które następnie zostały zrekonstruowane w 3D. W oparciu o najlepiej dopasowane elipsoidy analizowano luki pod kątem objętości, pola powierzchni, najbliższego środka masy, sferyczności (stosunek najmniejszego do największego promienia lakunarnego, gdzie 1=sfera), span theta (bezwzględna wartość różnicy Wektor 3D opisujący kierunek osi głównej od średniego kierunku wszystkich luk, spłaszczenie (-{24}} doskonale spłaszczone, 1=doskonale spłaszczone) i gęstość liczb lakunarnych (liczba osteocytów/objętość obrazu).

2.11 Analiza danych

Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej. Dla każdej macierzy ze spektroskopii ramanowskiej i nanowycięcia uśredniono tak, że każda kość miała jedną wartość dla każdej miary w mikroskali. Podobnie obliczono odchylenie standardowe dla każdej macierzy w celu oszacowania zmienności przestrzennej tkanki kostnej w mikroskali. Skutki starzenia i PChN, a także ich wzajemne oddziaływanie, zbadano za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA dla wszystkich parametrów. Zmienne zależne zostały przekształcone, jeśli było to konieczne, aby spełnić założenia resztowej normalności i homoskedastyczności. Istotność efektów głównych ustalono apriori na p < 0.05.="" w="" przypadku="" istotnej="" interakcji="" między="" wiekiem="" a="" pchn="" przeprowadzono="" testy="" post="" hoc="" w="" celu="" zbadania="" wpływu="" pchn="" w="" każdym="" wieku.="" w="" tych="" analizach="" post-hoc="" skontrolowano="" błąd="" rodzinny="" przy="" użyciu="" wartości="" alfa="" skorygowanej="" według="" bonferroniego,="" co="" skutkowało="" krytyczną="" wartością="" alfa="" 0.05/="" 3="0.017." wyniki,="" w="" których="" porównania="" efektów="" prostych="" miały="" wartości="" p="" od="" 0,017="" do="" 0,05,="" zinterpretowano="" jako="">

Przeprowadzono regresję liniową, aby sprawdzić, czy pomiary jakości kości w nano-mikroskali pozwalają przewidzieć wytrzymałość mechaniczną całej kości. Ponieważ właściwości mechaniczne całej kości wykazują silną zależność od wieku, ta regresja liniowa obejmowała wiek jako współzmienną. Korelacje Spearmana oceniono również dla geometrii lakunarnych osteocytów i pomiarów z chemii surowicy i moczu, a także dla PTH i pomiarów jakości kości w mikroskali. Istotność dla regresji liniowych i korelacji ustalono na p < 0.05.="" do="" wszystkich="" analiz="" zastosowano="" minitab="">

Wartości odstające zidentyfikowano za pomocą testu Grubbsa (poziom istotności=0.05). Z analiz wapnia i mocznika w surowicy wykluczono kilka wartości odstających. Dla wszystkich analiz mikroarchitektury korowej i beleczkowej, a także analizy FEA wykluczono wartości odstające dla 24-miesiąca pozorowanej terapii pozorowanej i przewlekłej choroby nerek. Jeden punkt odstający został wykluczony z grupy 24-miesięcznej CKD do analizy LP, a jeden punkt odstający został wykluczony z grupy 24-miesięcznej terapii pozorowanej pod względem wytrzymałości, pracy do złamania i przemieszczenia po plastyku. Jeden oddzielny 24-miesiąc odstający element Sham został znaleziony dla odchylenia standardowego modułu nanowgłębienia i odchylenia standardowego krystaliczności.