Część 1: Echinakozyd indukuje apoptotyczną śmierć komórek rakowych poprzez hamowanie enzymu odkażającego pulę nukleotydów MTh1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Abstrakcyjny:Hamowanie enzymu MTH1 odkażającego pulę nukleotydów powoduje rozległe uszkodzenia oksydacyjne DNA i apoptozę w komórkach rakowych, a zatem może być stosowane jako strategia przeciwnowotworowa. Ponieważ produkty naturalne są bogatym źródłem chemikaliów medycznych, w niniejszym badaniu wykorzystaliśmy reakcję enzymatyczną katalizowaną przez MTH1-jako wysokoprzepustową próbę przesiewową in vitro w celu poszukiwania naturalnych związków zdolnych do hamowania MTH1.Echinakozyd, związek pochodzący z roślin leczniczychCistanchei Echinacea, skutecznie hamowały aktywność katalityczną MTH1 w teście in vitro. Leczenie różnych ludzkich linii komórkowych raka za pomocąEchinakozydspowodował znaczny wzrost poziomu komórkowego utlenionej guaniny (8-oksoguaniny), podczas gdy poziom reaktywnych form tlenu w komórkach pozostał niezmieniony, co wskazuje, żeEchinakozydhamował również aktywność komórkowego MTH1. W konsekwencji leczenie echinakozydem wywołało natychmiastowy i dramatyczny wzrost markerów uszkodzenia DNA i regulację w górę inhibitora G1/S-CDK p21, po której nastąpiła znaczna apoptotyczna śmierć komórki i zatrzymanie cyklu komórkowego w komórkach nowotworowych, ale nie w komórkach nienowotworowych. Podsumowując, badania te zidentyfikowały naturalny związek jako inhibitor MTH1 i sugerują, że produkty naturalne mogą być ważnym źródłem środków przeciwnowotworowych.

Słowa kluczowe: Echinakozyd, MTH1, 8-oxoG, uszkodzenie DNA, apoptoza, zatrzymanie cyklu komórkowego

Cistancheekstrakt maprzeciwnowotworowyKorzyści zdrowotne

Kliknij tutaj, aby przejść do części 2

Wstęp

Pula komórkowych i mitochondrialnych trifosforanów nukleozydów (NTP) i trifosforanów deoksynukleozydów (dNTP) jest istotnym celem różnych reaktywnych form tlenu (ROS).1–3 Ponieważ specyficzność polimeraz DNA jest mniej niż doskonała, 4,5 utlenione dNTP mogą być włączone do nowo zsyntetyzowanego DNA, aby spowodować aberracje genetyczne, jeśli nie zostaną utrwalone.6 Na przykład główna utleniona zasada w puli nukleotydów, 8-oksoguanina (8-oksoG), może tworzyć pary zasad z cytozyną i adeniną. Po wstawieniu do przeciwnej adeniny podczas replikacji DNA, może potencjalnie spowodować transwersję T:A =G:C,7 która jest jedną z najczęstszych mutacji występujących w ludzkich nowotworach.8,9 Chociaż większość utlenionych wolnych dNTPs są usuwane przez enzymy odkażające pulę nukleotydów, badania przeprowadzone w przeszłości wykazały, że pula nukleotydów jest nadal ważnym źródłem utlenionych zasad w cząsteczkach DNA i istotnym czynnikiem oksydacyjnych uszkodzeń DNA.3,10 najważniejszy enzym do odkażania nukleotydów 15 Niemniej jednak, nawet pod nadzorem enzymów odkażających pulę nukleotydów, znaczna część utlenionych dNTP jest włączana do DNA, a zasady w cząsteczkach DNA mogą być również utleniane bezpośrednio przez ROS. Glikozylazy DNA, takie jak OGG1 i MUTYH, oraz procesy naprawy DNA, w tym naprawa przez wycinanie zasad (BER) i naprawa niedopasowań (MMR), w celu naprawy problematycznych zasad w cząsteczkach DNA.10,16,17 BER a nd MMR normalnie naprawia wiele utlenionych zasad w DNA dziennie, a zatem odgrywa ważną rolę w ochronie integralności i stabilności genomu.

W komórkach, które znajdują się pod zwiększonym stresem oksydacyjnym, zwiększone wbudowywanie utlenionych nukleotydów do DNA może przeciążyć zdolność komórki do naprawy i wywołać odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR).18 Trwała sygnalizacja DDR prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego, przedwczesnego starzenia się komórek lubapoptoza, ustanawiając w ten sposób barierę dla nowotworzenia.19 Jednak chociaż komórki nowotworowe wykazują znacznie zwiększone napięcie oksydacyjne i generują potencjalnie śmiertelny ładunek utlenionych nukleotydów,20 mogą przetrwać starzenie się związane z DDR lubapoptoza.21 Wiele badań wykazało, że MTH1, skutecznie usuwając niebezpiecznie obfite 8-oxodGTP i 2-OH-dATP w komórkach nowotworowych, odgrywa kluczową rolę w rozwoju raka.22 stwierdzono nadekspresję w różnych typach nowotworów,23–25 i stężenia 8-oxoG, a zakres zmian oksydacyjnych DNA był niższy w guzach niż w otaczających je prawidłowych tkankach.26–28 Funkcjonalnie nadekspresja MTH1 znacznie się zmniejszyła. liczba mutacji DNA obserwowanych w embrionalnych fibroblastach myszy z niedoborem MMR10 i umożliwiła komórkom przezwyciężenie przedwczesnego starzenia się i apoptozy komórek wywołanych przez onkogenny Ras;29 podczas gdy supresja MTH1 zapobiegała rozwojowi raka u myszy z niedoborem OGG1-30 i promowała DDR indukowane przez ROS i starzenie się komórek w komórkach transformowanych Ras.3,29,31 Tak więc, chociaż MTH1 odgrywa ochronną rolę, zapobiegając mutacjom indukowanym przez ROS w zdrowych komórkach, badania te wykazały, że MTH1 jest szczególnie wymagany do pojawienia się i przeżycia komórek rakowych. Ostatnie badania dostarczyły więcej dowodów na poparcie roli MTH1 w rozwoju raka.31-34 Tłumienie MTH1 przez RNAi lub inhibitory drobnocząsteczkowe w różnych liniach komórek nowotworowych spowodowało znaczne zwiększenie wbudowywania 8-oksod G do genomowego DNA , co prowadzi do rozległych uszkodzeń DNA, apoptotycznej śmierci komórek i zmniejszenia przeżywalności komórek rakowych.32,33 W badaniach ksenograftów na myszach hamowanie MTH1 skutecznie hamowało wzrost eksplantów nowotworowych. Co ważne, tłumienie MTH1 nie wpłynęło na wzrost i przeżycie normalnych komórek, prawdopodobnie dlatego, że normalne komórki mają niższy ROS, a zatem są mniej zależne od MTH1 pod względem przeżycia.32,33 Te odkrycia sugerują, że hamowanie MTH1 jest obiecującą nową strategią walki z rakiem.

Produkty naturalne są bogatym źródłem związków leczniczych.35 Wiele nowoczesnych środków terapeutycznych, w tym leków przeciwnowotworowych, wywodzi się z preparatów ziołowych lub roślinnych.36-39 Mimo to proponuje się, aby wiele tradycyjnych ziół posiadało różne właściwości terapeutyczne. do scharakteryzowania, głównie ze względu na trudności w kontrolowaniu ich składu, aby jednoznacznie określić ich skuteczność i mechanizmy działania.40 Potrzebne są nowe podejścia, które pozwolą na wykrywanie związków aktywnych i analizę mechanizmów molekularnych. W związku z tym wysokowydajne badania przesiewowe in vitro ukierunkowane na cel mogą być pomocne w znajdowaniu mechanistycznie zdefiniowanych związków leczniczych z zasobów naturalnych. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy reakcję enzymatyczną katalizowaną przez MTH1-jako wysokoprzepustowy test in vitro w celu poszukiwania naturalnych związków, które mogą hamować MTH1. Co zaskakujące, pokaz ujawnił, żeEchinakozyd, naturalny produkt, który jest najlepiej znany ze swojej silnej aktywności przeciwutleniającej, jest zdolny do hamowania MTH1.

Echinakozydw cistanche możeantyapoptoza

Materiały i metody

Materiały

Naturalne związki ziołowe zakupiono od Yuanye Biological Technology Co., Szanghaj, Chińska Republika Ludowa. Nazwa, numer katalogowy, numer rejestru Chemical Abstracts Service (CAS) i czystość każdego związku są wymienione w Tabeli S1. Roztwory podstawowe związków przygotowano w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), a roztwory robocze przygotowano w buforze testowym lub pełnej pożywce do hodowli komórkowej. Ten sam roztwór bez badanego związku, ale zawierający taką samą ilość DMSO zastosowano jako kontrolę nośnika. (S)-kryzotynib zakupiono w firmie Selleck Chemicals, Houston, TX, USA.

badanie przesiewowe in vitro

Test enzymatyczny in vitro zastosowany do przeszukiwania naturalnych związków ziołowych był zgodny z procedurami opisanymi przez Gad i wsp.32 W skrócie, seryjne rozcieńczenia poszczególnych związków przygotowano w buforze testowym składającym się z 100 mM Tris- octan (pH 8,0), 40 mM NaCl, 10 mM octan Mg, 0,005% Tween 20 i 1 mM DTT. Następnie dodano 0,5 nM rekombinowanego ludzkiego MTH1 (Abcam, Cambridge, Wielka Brytania), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) i 0,2 U/ml nieorganicznych pirofosfataz (Thermo Fisher Scientific) i płytki inkubowano na wytrząsarka do płytek przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Końcowa objętość reakcji wynosiła 100 µl na płytce 96-dołkowej. Pod koniec reakcji dodano zieleń malachitową (J&K Scientific, Pekin, Chińska Republika Ludowa)41 i płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez kolejne 15 minut. Absorbancję przy 630 nm mierzono czytnikiem mikropłytek BioRad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Wartości stężenia hamującego (IC50) określono za pomocą analizy regresji nieliniowej przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism.

Hodowlę komórkową

Ludzki kostniakomięsak MG-63, rak wątroby SK-HEP-1, rak piersi MCF7, rak jelita grubego SW480, embrionalne linie nerki HEK293 i mysie linie komórkowe fibroblastów NIH/3T3 pochodziły z American Type Culture Collection oraz linię komórkową wątroby L-O2 zakupiono od KenGen Biotech, Nanjing, Chińska Republika Ludowa. Komórki te utrzymywano w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2, zgodnie z instrukcjami podanymi przez dostawców. W przypadku stosowania tych linii komórkowych nie było wymagane oświadczenie etyczne od instytucjonalnej komisji rewizyjnej.

Pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów {{0}}okso Wewnątrzkomórkowe poziomy 8-oxoG mierzono przez barwienie Cy3-awidyną skoniugowaną.42 Łącznie 1×104 komórki zostały wysiane na okrągłe szkiełko nakrywkowe w 12-dołkowych płytkach. Następnego dnia komórki traktowano 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM lub 80 μM echinakozydem przez 5 godzin, 12 godzin lub 24 godziny, a następnie utrwalano lodem -zimny metanol przez 20 minut, a następnie inkubacja w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) z 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) przez 15 minut. Próbki blokowano w TBS 0,1% Triton X-100 i 15% płodową surowicą bydlęcą przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie barwiono awidyną sprzężoną z Cy3- (0,5 ug/ml) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni. Po 3-krotnym przemyciu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 5 minut, szkiełka nakrywkowe zamknięto na szklanych szkiełkach, pożywce montażowej dla owadów z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (Vector Laboratories, Burlingame, CA , USA). Obrazy wykonano i przeanalizowano za pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss LCM 510.

Pomiar wewnątrzkomórkowego poziomu ROS Wewnątrzkomórkowy poziom ROS mierzono za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zestawu komórkowego do oznaczania ROS (Beyotime Biotechnology, Haimen, Chińska Republika Ludowa). Komórki hodowane na sześciostudzienkowych płytkach traktowano 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM lub 80 μM Echinakozyd przez 5 godzin, 12 godzin lub 24 godziny, przemywano dwukrotnie PBS i inkubowano z 10 μM dioctan dichlorofluoresceiny przez 30 minut w temperaturze 37 stopni . Komórki następnie trypsynizowano i analizowano za pomocą cytometru przepływowego FACSCaliber (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Wewnątrzkomórkowe poziomy ROS wyrażono jako średnie natężenie fluorescencji dichlorodihydrofluoresceiny w komórkach. Przedstawione liczby były średnimi z trzech niezależnych eksperymentów.

Barwienie immunofluorescencyjne

Komórki wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych traktowano {{0}} μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM lub 80 μM Echinakozyd przez 5 godzin, 12 godzin lub 24 godziny, a następnie przemywano raz PBS, utrwalano 4% paraformaldehyd w PBS przez 20 minut i blokowane w TBS 0,1% Triton X-100 i 15% płodową surowicą bydlęcą przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Utrwalone komórki barwiono przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko 8-oxoG (mysie monoklonalne przeciw-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (królicze przeciw-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery , TX, USA) lub aktywna kaspaza-3 (królicza anty-kaspaza-3, Bioss, Pekin, Chińska Republika Ludowa), a następnie barwienie za pomocą osła antymysz sprzężonego z Alexa 488- ( Abcam) lub kozie przeciwkrólicze skoniugowane z Cy3- (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po 3-krotnym płukaniu w PBS przez 5 minut, szkiełka nakrywkowe zamknięto na szkiełkach w pożywce montażowej VECTASHIELD z DAPI (Vector Laboratories). Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss LCM 510.

test tworzenia kolonii

Dzień przed traktowaniem komórki wysiano na płytkę z sześcioma studzienkami w stężeniu 1x104 komórek na studzienkę. Następnie leczono je 0 μM, 60 μM lub 80 μM Echinakozydem przez 7 dni. Po przemyciu PBS komórki utrwalano lodowatym metanolem i barwiono roztworem fioletu krystalicznego (Sigma-Aldrich) (0,5% w 25% metanolu). Obrazy sfotografowano po wysuszeniu płytek przez noc. Kryształy fioletu krystalicznego rozpuszczono przez dodanie 70% etanolu i zmierzono absorbancję przy 595 nm czytnikiem mikropłytek BioRad 680. Dane analizowano przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism.

Test MTT

Dzień przed zabiegiem komórki wysiano na 96-dołkowych płytkach w stężeniu 1×104 komórek na dołek, a następnie poddano działaniu seryjnych rozcieńczeń echinakozydu przez 24 godziny lub 48 godzin lub 60 μM echinakozydu przez 5 godzin, 12 godzin lub 24 godziny. Pożywkę usunięto, a komórki przemyto PBS, a następnie 20 μl 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilu)-2,{{15} Do każdego dołka dodano roztwór bromku difenylotetrazoliowego (MTT) (5 mg/ml w PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific). Płytki inkubowano w temperaturze 37 stopni przez kolejne 4 godziny. Na koniec roztwór MTT usunięto i do każdego dołka dodano 150 µl DMSO. Płytki inkubowano na wytrząsarce do płytek przez 10 minut i mierzono absorbancję przy 570 nm czytnikiem mikropłytek BioRad 680. Każdy eksperyment przeprowadzono dwukrotnie w trzech powtórzeniach. Dane analizowano przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism. Wartości IC50 określono stosując analizę regresji nieliniowej.

analiza cyklu komórkowego

Komórki w sześciostudzienkowych płytkach traktowano 0 μM, 6{{10}} μM lub 80 μM echinakozydem przez 24 godziny, zbierano trypsyną (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) , przemyto dwukrotnie PBS, a następnie utrwalono lodowatym etanolem (70 procent) przez 2 godziny w temperaturze -20 stopni. Utrwalone komórki przemyto dwukrotnie zimnym PBS i ponownie zawieszono w 300 µl świeżo przygotowanego PBS z 0,1% Triton X-100, 0,2 mg/ml RNazy A wolnej od DNaz (Sigma-Aldrich), 10 µg/ml jodku propidyny ( PI) (Hoffman-La Roche Ltd., Bazylea, Szwajcaria). Po inkubacji w temperaturze 37 stopni w ciemności przez 20 minut, komórki przefiltrowano przez nylonową siatkę Falcon (BD Biosciences), załadowano do cytometru przepływowego FAC-SCalibur i analizowano przy użyciu oprogramowania ModFit (BD Biosciences).

Analiza fragmentacji DNA

Komórki hodowane na sześciostudzienkowych płytkach traktowano 0 μM, 60 μM lub 80 μM echinakozydem przez 24 godziny i utrwalano w lodowatym 4% paraformaldehydzie (Sigma-Aldrich) przez 20 minut. Po przemyciu PBS komórki zapieczętowano w pożywce montażowej VECTASHIELD z DAPI (Vector Laboratories). Morfologia jądrowa została sfotografowana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Olympus. W celu wykrycia fragmentacji DNA na żelach agarozowych, DNA wyekstrahowano przy użyciu mikrozestawu QIAamp DNA (Qiagen NV, Venlo, Holandia) i przeprowadzono elektroforezę na 2% żelach agarozowych zawierających 0,1 ug/ml bromku etydyny.

Analiza apoptozy metodą cytometrii przepływowej Komórki apoptotyczne badano stosując zestaw do wykrywania apoptozy Annexin V-FITC (Bestbio, Szanghaj, Chińska Republika Ludowa), zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki hodowane w 96-dołkowych płytkach traktowano 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM lub 160 μM echinakozydem przez 2 godziny, 5 godzin, 12 godzin lub 24 godziny, przemyte dwukrotnie PBS, a następnie ponownie zawieszone w buforze wiążącym. Następnie dodano kolejno 5 µl aneksyny V-FITC i 5 µl PI (Roche) i komórki inkubowano przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Komórki załadowano do cytometru przepływowego FACSCalibur (BD Biosciences), a dane analizowano przy użyciu oprogramowania Cell Quest (BD Biosciences).

Analiza Western blot

Komórki hodowane na płytkach sześciodołkowych traktowano 0 μM, 6{{10}} μM lub 80 μM echinakozydem przez 5 godzin, 12 godzin lub 24 godziny, przemyte dwukrotnie PBS i zeskrobane z płytki przy użyciu 100 μl buforu radioimmunoprecypitacyjnego (150 mM NaCl, 1,0% IGEPAL CA-630, 0,5% dezoksycholan sodu, 0,1% dodecylosiarczan sodu i 50 mM Tris, pH 8,0) (Sigma-Aldrich) zawierający 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu. Próbki wirowano przy 12 000 x g przez 20 minut w 4 stopniach. Stężenia białka w supernatantach oznaczono odczynnikiem Bradforda (Dingguo, Changchun, Chińska Republika Ludowa). Próbki denaturowano w 95 stopniach przez 10 minut i rozdzielano na 12% żelu do elektroforezy w żelu dodecylosiarczan sodu-poliakrylamid. Po elektroforezie białka przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu (Millipore), a następnie zablokowano w soli fizjologicznej buforowanej Tris za pomocą Tween 20 (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1% Tween 20) zawierającego 5% (wag./obj.) mleko beztłuszczowe przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Bloty sondowano pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko polimerazie p21 (Abcam), poli(ADP-rybozie) (Bioss) lub aktywowanej kaspazie -3 (Bioss), a następnie drugorzędowym przeciwciałom sprzężonym z peroksydazą chrzanową (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Sygnały zostały opracowane przy użyciu zestawu do wykrywania ulepszonej chemiluminescencji Western blotting (Transgen Biotech, Changchun, Chińska Republika Ludowa). Eksperymenty powtórzono trzykrotnie.

Echinakozydw cistanche możeantyapoptozaorazantyutleniacz

Pomiar mitochondriów

potencjał błonowy

Potencjał błony mitochondrialnej mierzono przy użyciu barwnika JC{{0}} (Biotechnology), zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki hodowane na sześciostudzienkowych płytkach traktowano 0 μM, 60 μM lub 80 μM Echinakozyd przez 5 godzin, 12 godzin lub 24 godziny, płukano dwukrotnie w PBS, a następnie inkubowano z JC-1 przez 20 minut. Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism. Istotność obliczono stosując jednokierunkową analizę wariancji, a P0.05 uznano za statystycznie istotne. Wyniki wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe.

Echinakozydw cistanche możeantyapoptozai poprawić odporność