Część 1: Wpływ akteozydu jako obrońcy komórek w celu wyprodukowania sklonowanego psa

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Wydział Nauk o Zwierzętach i Mleczarstwie, Kolegium Rolnictwa i Nauk Przyrodniczych, Chungnam National University, Daejeon, Republika Korei,

2 Wydział Edukacji Biologicznej Kolegium Pedagogicznego,Narodowy Uniwersytet Chonnam, Gwangju, Republika Korei

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Pls kliknij tutaj, aby przejść do części 2!

Abstrakcyjny

Transfer jądra komórki somatycznej (SCNT) jest dobrze znaną techniką laboratoryjną. Zasada SCNT polega na przeprogramowaniu jądra somatycznego poprzez wstrzyknięcie komórki somatycznej do oocytu biorcy, którego jądro zostało usunięte. Dlatego komórki dawcy jądra są uważane za kluczowy czynnik w SCNT. Synchronizacja cyklu komórkowego komórek jądra dawcy na etapie G0/G1 może być indukowana przez hamowanie kontaktowe lub głód surowicy. W tym badaniu,akteozyd, związek glikozydów fenylopropanoidowych, zbadano w celu określenia, czy można go zastosować do indukowania synchronizacji cyklu komórkowego, cytoprotekcji i poprawy wydajności SCNT w fibroblastach płodowych psów. Pierwotne psie fibroblasty płodowe leczonoakteozyd(10, 30, 50 μM) dla różnych okresów czasu (24, 48 i 72 godziny). Synchronizacja cyklu komórkowego na etapie G0/G1 nie różniła się istotnie od metody indukcji:akteozydleczenie, hamowanie kontaktowe lub głód surowicy. Jednak z tych trzech terapii głód w surowicy powodował znacznie zwiększony poziom reaktywnych form tlenu (ROS) (99,5 ± 0,3 procent) i apoptozę. Wyniki ujawniły również, żeakteozydzmniejszone procesy ROS i apoptozy, w tym martwica w fibroblastach płodowych psów oraz poprawa przeżywalności komórek. Fibroblasty płodowe psów leczoneakteozydzostali pomyślnie aresztowani na etapie G0/G1. Co więcej, zrekonstruowane zarodki przy użyciu komórek dawców jądra poddanych działaniu akteozydu dały zdrowego sklonowanego psa, ale nie zarodki wytworzone przy użyciu komórek dawców jądra poddanych inhibicji kontaktowej. Podsumowując,akteozydIndukowana synchronizacja cyklu komórkowego komórek dawcy jądra byłaby alternatywną metodą poprawy wydajności psiego SCNT ze względu na jego działanie cytoochronne.

Akteozyd Cistanche może zwiększyć odporność

Wstęp

Technika SCNT została wykorzystana do produkcji genetycznie lepszych lub zmanipulowanych zwierząt do celów rolniczych i jako zasoby biomedyczne. Wraz z rosnącym zapotrzebowaniem na zwierzęce modele choroby, ratowanie zwierząt zagrożonych wyginięciem, komórki macierzyste w medycynie regeneracyjnej, przeszczepianie narządów itp., w ostatnim czasie wzrasta zainteresowanie klonowaniem zwierząt przy użyciu SCNT [1–5]. Mimo że produkcja sklonowanych zwierząt odniosła sukces, wydajność SCNT jest nadal bardzo niska [6]. Przyczyny niskiej kompetencji rozwojowej zarodków SCNT obejmują wiele czynników, które są związane z jakością oocytów biorcy, jakością komórek jądra dawcy oraz stanem matki zastępczej [7–10].

Wiadomo, że reaktywne formy tlenu (ROS) i apoptoza biorą udział w procesach rozrodczych kobiet, w tym w rozwoju oocytów in vivo i in vitro [11–14]. ROS przerywają rozwój zarodka poprzez wywoływanie kondensacji cytoplazmatycznej, uszkodzenia DNA i apoptozy w zarodkach. Badania pomocnicze wykazały, że zmniejszenie ROS poprawia kompetencje rozwoju zarodka SCNT podczas hodowli in vitro [15–17]. Apoptoza jest procesem fizjologicznym, który zachodzi spontanicznie podczas prawidłowego rozwoju zarodka przed implantacją, aby utrzymać homeostazę komórkową poprzez usunięcie uszkodzonych/niewłaściwie funkcjonujących komórek DNA. ROS powoduje fragmentację DNA i zwiększa apoptozę blastomerów, które zaburzają rozwój zarodka. Przypadek ROS i apoptozy obserwuje się częściej po SCNT niż po zapłodnieniu in vitro [18, 19]. W wielu badaniach stwierdzono, że zdolność rozwoju zarodka SCNT jest uratowana przez zmniejszenie poziomu ROS i apoptozy za pomocą przeciwutleniaczy, takich jak selen [20], insulina transferyna-selen [17, 21], melatonina [22] i glutation [23].

Wcześniejsze badania wykazały, że zastosowanie komórek dawcy zatrzymanych na etapie G{{0}/G1 poprawiło skuteczność SCNT [7, 9, 24-28]. Chromatyna w komórkach dawcy na etapie G0/G1 została uznana za najskuteczniejszą dla kompetencji rozwoju zarodka SCNT. Aby zsynchronizować cykl komórkowy dawcy, często stosowano inhibicję kontaktową, głód surowicy i terapie chemiczne [7, 25, 29, 30]. Jednak głód surowicy zmniejsza przeżywalność komórek i zwiększa fragmentację DNA, co prowadzi do apoptozy [31]. Inhibicja chemiczna to kolejna strategia zatrzymania cyklu komórkowego na etapie G0/G1 za pomocą inhibitorów, takich jak roskowityna [29, 32], dimetylosulfotlenek (DMSO) [33] i cykloheksymid (CHX) [34]. Skuteczność metody użytej do synchronizacji zależy od rodzaju i gatunku komórek dawcy. Aby uzyskać optymalną synchronizację komórek dawcy, należy dokładnie ocenić różne aspekty stosowanych metod.

Akteozyd(znany również jako werbaskozyd) [{{0}}(3, 4-dihydroksyfenyloetyl)-1-OaL-ramnopiranozylo-(1/3)-bD-({{13} }O-caffeoilo)-glukopiranozyd] jest izolowany z fioletowych kwiatów Syringa vulgaris. Wiadomo, że rośliny zawierające akteozyd mają działanie przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze [35–37] i zapobiegają stanom zapalnym. Rzeczywiście, akteozyd wykazuje różne aktywności biologiczne in vitro i in vivo, takie jak aktywność antyoksydacyjna, aktywność antyapoptotyczna, cytotoksyczność wobec różnych komórek nowotworowych i synchronizacja cyklu komórkowego na etapie G0/G1 jako zależna od cykliny inhibitor kinazy (CDK) [38]. Na przykład Lee i in.[38] poinformował, że leczenie akteozydem może hamować proliferację ludzkich komórek promielocytowej białaczki HL-60 poprzez indukowanie zatrzymania cyklu komórkowego na etapie G0/G1. Jednak wpływ komórek dawcy traktowanych akteozydem na wydajność psiego SCNT nie został jeszcze zbadany.

W tym badaniu efektyakteozydna synchronizację cyklu komórkowego, ROS iapoptozana psich fibroblastach płodowych. Analizę synchronizacji cyklu komórkowego, ROS i apoptozy przeprowadzono przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Aby zademonstrować skuteczność komórek dawcy traktowanych akteozydem, zarodki SCNT hodowano i przeniesiono do psa biorcy i z powodzeniem wyhodowano zdrowego sklonowanego psa.

cistanchemoże leczyćnerkachoroba poprawia sięnerkowyfunkcjonować

Materiały i metody

Oświadczenie etyczne

W tym badaniu 44 samice psów rasy mieszanej (w wieku 1–6 lat) wykorzystano jako dawczynie oocytów i surogatów transferu zarodków, a samicę rasy beagle (w wieku 2 lat) wykorzystano do ustalenia płodowych linii komórkowych fibroblastów. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Chungnam National University (numer zatwierdzenia: CNU-00487) i przeprowadzone zgodnie z „The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” opublikowanym przez IACUC Chungnam National University. Psy hodowano w pomieszczeniach zamkniętych w oddzielnych klatkach z systemem kontroli temperatury i wentylacji. Psy karmiono paszą komercyjną raz dziennie i dostarczano im wodę ad libitum. We wszystkich doświadczeniach na zwierzętach psy początkowo znieczulano 6 mg/kg ketaminy i ksylazyny i utrzymywano w stanie znieczulenia 2% izofluranem. Pod koniec zabiegu podano antybiotyki (procaine penicylina G, benzatyna penicylina G i siarczan dihydrostreptomycyny) w celu zapobieżenia jakimkolwiek zakażeniom. Po zabiegu psy zostały przeniesione do ich indywidualnych klatek ze słodką wodą, monitorowane i otoczone szczególną opieką ze strony lekarza weterynarii, tak aby można było zastosować niezbędne leczenie, jeśli zwierzęta tego potrzebowały.

Chemikalia

Wszystkie chemikalia zakupiono od Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), o ile nie podano inaczej. Acteoside uzyskano z Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. w Chinach.

Izolacja psich fibroblastów płodowych

Fibroblasty płodów psów uzyskano z {{0}}dniowych płodów. W skrócie, samica rasy beagle została sztucznie zapłodniona nasieniem samca rasy beagle. Po 28 dniach potwierdzono ciążę u samicy rasy beagle i 5 płodów uzyskano przez celiohysterektomię. Płody płukano trzykrotnie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA). Głowę, narządy wewnętrzne i kończyny płodu usunięto za pomocą ostrza chirurgicznego, a pozostałe części ciała rozdrobniono w PBS. Kawałki płodów przemywano dwukrotnie przez wirowanie przy 400 × przez 5 minut i hodowano w Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Gibco) z dodatkiem 1% penicyliny-streptomycyny (nr produktu P4458) i 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS; Gibco) w 39°C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza. Gdy komórki osiągnęły konfluencję po 5-7 dniach, traktowano je 0,25% trypsyną-EDTA (Gibco) przez 2 minuty i zbierano. Dwie linie komórkowe psich płodowych fibroblastów uzyskano z dwóch pojedynczych płodów. Komórki zamrożono w 10% DMSO w FBS i przechowywano w ciekłym azocie w -196 stopniu do czasu ich użycia.

Leczenie komórek

Zamrożone psie fibroblasty rozmrożono i hodowano do 80% konfluencji. Komórki zbierano i pasażowano 4 do 7 razy do kolejnych eksperymentów. Komórki wysiano w stężeniu 106/ml na 60 mm szalkach hodowlanych. Komórki hodowano w (1) DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną przez pięć dni (hamowanie kontaktu), (2) DMEM uzupełnionym 0,5% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną przez pięć dni (głód surowicy) lub (3) DMEM z dodatkiem 10% FBS i 1% akteozydu zawierającego penicylinę-streptomycynę w stężeniu 10 μM, 30 μM lub 50 μM przez 24 godziny, 48 godzin i 72 godziny (leczenie akteozydem).

Analiza cyklu komórkowego metodą cytometrii przepływowej

Do analizy etapów cyklu komórkowego, komórki zebrano przy użyciu {{0}},25% trypsyny-EDTA i przemyto 3 razy PBS przez odwirowanie. Po ostatnim płukaniu supernatanty odrzucono, a komórki ponownie zawieszono w 0,3 ml PBS. W celu utrwalenia do zawiesiny komórek wkroplono {{10}},7 ml zimnego absolutnego etanolu, wymieszano przez delikatne worteksowanie i przechowywano przez noc w 4 stopniach. Utrwalone komórki odwirowano i dwukrotnie przemyto zimnym PBS. Komórki ponownie zawieszono w 0,25 ml PBS uzupełnionego 5 µl 10 mg/ml RNazy i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Następnie dodano 10 µl 1 mg/ml jodku propidyny (PI). Cykl komórkowy analizowano przez oznaczenie ilościowe zawartości DNA w populacjach komórek w fazach G0/G1 (2n), S (między 2n i 4n) i G2/M (4n) przy użyciu cytometru przepływowego FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA , USA).

Wykrywanie ROS metodą cytometrii przepływowej

ROS w żywych komórkach oceniano przy użyciu zestawu Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). W skrócie, komórki przemyto PBS po usunięciu pożywki hodowlanej i dodano 2 ml 100 μM roztworu roboczego wodoronadtlenku tert-butylu (TBHP). Po inkubacji w 37°C przez 1 godzinę, roztwór roboczy TBHP usunięto i komórki delikatnie przemyto 3 razy ciepłą solanką buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS; Gibco). Komórki następnie inkubowano w roztworze roboczym 25 μM 5-(i-6)-karboksy-2,7-dichlorodihydrofluoresceiny (karboksy-H2DCFDA) w temperaturze 37 stopni przez 30 min w ciemności . Po utlenieniu karboksy-H2DCFDA emituje zieloną fluorescencję, ułatwiając ocenę ROS za pomocą cytometrii przepływowej. Jako kontrolę pozytywną zastosowano TBHP, który jest induktorem produkcji ROS. Jądra komórek wybarwiono Hoechst 33342. Po trzykrotnym przemyciu PBS komórki zebrano przez trypsynizację, zawieszono w PBS i zastosowano do wykrywania ROS przy użyciu cytometru przepływowego FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA ). Szybkość tworzenia ROS obliczono dzieląc liczbę komórek ROS-dodatnich przez całkowitą liczbę komórek i przeliczając wartości na procenty.

Analiza apoptozy metodą cytometrii przepływowej

Analizę apoptozy przeprowadzono przy użyciu zestawu Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). W skrócie, komórki zebrano przez trypsynizację i przemyto 2 razy zimnym PBS. Następnie do komórek dodano 100 µl 1x buforu wiążącego aneksynę, 5 µl aneksyny V Alexa Fluor 488 i 1 µl PI. Po inkubacji przez 15 min w temperaturze pokojowej dodano 400 µl 1x buforu wiążącego aneksynę i delikatnie wymieszano zawiesinę komórek. Aneksyna V, która jest białkiem wiążącym fosfolipidy zależne od Ca2 plus, ma wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny (PS). W żywych komórkach PS znajduje się na wewnętrznej błonie cytoplazmatycznej i przemieszcza się do zewnętrznej błony cytoplazmatycznej w komórkach apoptotycznych. Komórki apoptotyczne rozróżnia się na podstawie aneksyny V znakowanej wiązaniem Alexa Fluor 488 z PS na błonie zewnętrznej. Ponadto PI, który jest barwnikiem wiążącym kwasy nukleinowe, barwi komórki martwicze czerwoną fluorescencją. W związku z tym komórki apoptotyczne z zieloną fluorescencją, komórki nekrotyczne z czerwoną fluorescencją oraz żywe komórki z niewielką lub bez fluorescencji w komórkach analizowano przy użyciu cytometru przepływowego FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Wskaźniki obliczono dzieląc liczbę komórek żywych, nekrotycznych lub apoptotycznych przez całkowitą liczbę komórek i przeliczając obliczone wartości na wartości procentowe.

Pobieranie dojrzałych in vivo oocytów

W celu wykrycia owulacji u każdego psa, zmierzono stężenie progesteronu (P4) w surowicy przy użyciu zestawu radioimmunologicznego DSL-3900ACTIVE progesteron Coated-Tube Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA). Jak opisano wcześniej [39, 40], dzień, w którym stężenie P4 przekroczyło 4 ng/ml, uznano za dzień owulacji. W 72 h po owulacji komórki jajowe zostały pobrane przez laparotomię z zastosowaniem aseptycznych procedur chirurgicznych. Do fimbrii jajowodu doprowadzono przez szczelinę kaletki i kaniulowano za pomocą stalowej igły z odwróconym kołnierzem (18 G, 7,5 cm). Cewnik dożylny (IV) o rozmiarze 24 (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seul, Korea) został wprowadzony do przesmyku jajowodu w pobliżu połączenia maciczno-jajnikowego, a podłoże 199 (Gibco) uzupełniono 1% penicyliną-streptomycyną i 5% FBS wprowadzono do jajowodu przez cewnik IV. Oocyty natychmiast przetransportowano do laboratorium. Od 31 psów pobrano łącznie 316 oocytów.

Transfer jądra komórki somatycznej i transfer zarodka SCNT przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [39]. W skrócie, w celu usunięcia komórek wzgórka z dojrzałych in vivo oocytów, kompleksy wzgórka-oocytów (COC) powtarzano pipetowaniem w 0,1% hialuronidazie. Pierwsze ciało polarne i chromosomy metafazy-II usunięto przez aspirację. Wyłuszczenie potwierdzono przez barwienie Hoechst 33342 (bisbenzimid). Fibroblasty płodów psów traktowano 30 μM akteozydem przez 48 godzin, a następnie zbierano 0.25 procent trypsyny-EDTA. Pojedyncza komórka, która ma gładką błonę komórkową, została przeniesiona do przestrzeni perywitelinowej każdego wyłuszczonego oocytu. Pary były zrównoważoną pożywką infuzyjną, którą jest 0pożywka mannitolowa o stężeniu 0.26 M zawierająca 0.1 mM HEPES, 0.5 mM MgSO4 i 0,05% BSA, i połączona dwoma impulsami prądu stałego (69–75 V przez 15 μs) z aparatu Electro-Cell Fusion (NEPA gene Co., Chiba, Japonia). Pary te inkubowano w pożywce 199 uzupełnionej 10% FBS przez 1 godz. 30 min. Połączone zarodki SCNT sprawdzano i indukowano aktywację chemiczną przez inkubowanie ich w 10 μM jonoforze wapnia (nr produktu C7522, Sigma) przez 4 min. Zarodki SCNT płukano, a następnie umieszczano w zmodyfikowanej syntetycznej pożywce płynów jajowodowych (mSOF) [41] zawierającej 1,9 mM 6-dimetyloaminopurynę (6-DMAP) na 3 godz. 30 min. Zmodyfikowane zarodki zostały chirurgicznie przeniesione do jajowodów surogatów zsynchronizowanych w rui w ciągu 4 godzin po SCNT. Ciążę potwierdzono ultrasonograficznie po 26 dniach (najwcześniej) po transferze zarodka.

Składnik czynnyakteozydwcistanche

Hodowla in vitro sklonowanych zarodków

Po SCNT, sklonowane zarodki hodowano w 40 µl mikrokroplach zmodyfikowanej syntetycznej pożywki płynu jajowodowego (mSOF) (10 sklonowanych zarodków na mikrokroplę) pokrytą olejem mineralnym w 38,5°C w 5% CO2 i 95% powietrza. Rozwój zarodka SCNT obserwowano od 2 do 8 dnia.

Analiza mikrosatelitarna i mitochondrialnego DNA sklonowanego psa

Całkowite DNA zostało wyekstrahowane z jądrowych komórek dawcy i skóry psów dawców oocytów, psów zastępczych i sklonowanego psa za pomocą zestawu G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Korea) zgodnie z wytycznymi producenta, a następnie eluowano w 100 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Ilość DNA mierzono spektrofotometrem BioSpec-nano (Shimadzu Corp., Japonia).

Do genotypowania mikrosatelitarnego wybrano 7 specyficznych genów: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 i FH2079. PCR przeprowadzono z początkową denaturacją przez 10 min w 95 stopniach, 20 cykli składało się z denaturacji przez 30 sekund w 95 stopniach, 30 sekund hybrydyzacji w 58 stopniach (-0.1 stopień/cykl), 1 minuta wydłużania w temperaturze 72 stopnie i 15 dodatkowych cykli składających się z denaturacji przez 30 sekund w 95 stopniach, 30 sekund wygrzewania w 56 stopniach, 1 minuty wydłużania w 72 stopniach i końcowego wydłużania w 72 stopniach przez 10 minut.

Do sekwencjonowania mitochondrialnego DNA przy użyciu pełnych sekwencji nukleotydowych psiego mtDNA (nr dostępu GenBank: U96639) zsyntetyzowano następujące startery oligonukleotydowe: Region b cytochromu (L14 252 – L14 631) F: ACTCATTCATTGACCTCCCAGCG,R: AGTTCCGATATAGGGATGGCAGAG; Podjednostka II oksydazy cytochromu c (L7,054—L7465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; Region pętli D (L15 622 – L16030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Cykle PCR dla tej analizy obejmowały: 95 stopni początkowej denaturacji przez 5 min, 5 cykli denaturacji przez 30 sekund w 95 stopniach, 40 sekund przyłączania w 60 stopniach (-1 stopnia/cykl), 1 min wydłużania w 72 stopnie i kolejne 30 cykli denaturacji przez 30 sekund w 95 stopniach, 40 sekund wygrzewania w 55 stopniach, 1 minuta wydłużania w 72 stopniach i końcowe wydłużanie w 72 stopniach przez 10 minut. Fragmenty PCR z różnych eksperymentów analizowano przy użyciu analizatora genetycznego ABI Prism 3100 (Applied Biosystems Inc., USA). Składanie sekwencji, wielokrotne przyrównywanie i przycinanie przyrównywania dla regionów kontrolnych przeprowadzono za pomocą oprogramowania BioEdit (v.7.0.5.3).

akteozydwcistanchemoże wzmocnić układ odpornościowy