Część 1: Ustalenie równoczesnego eksperymentalnego modelu osteoporozy w połączeniu z chorobą Alzheimera u szczura oraz podwójnym działaniem echinakozydu i akteozydu z Cistanche Tubulosa

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li

ABSTRAKCYJNY

Znaczenie etnofarmakologiczne: Cistanche tubulosato cenna tradycyjna medycyna chińska, która jest szeroko stosowana w leczeniu osteoporozy iChoroba Alzheimera. Echinakozydi akteozyd są głównymi aktywnymi składnikami Cistanche tubulosa, które mają działanie farmakologiczne o wartości badawczej. Doniesiono, że echinakozyd iakteozydmoże poprawić zdolność uczenia się i zapamiętywania, promować proliferację i różnicowanie osteoblastów. Cel pracy: Echinakozyd i akteozyd zCistanche tubulosawykazały znaczące działanie przeciw osteoporozie i chorobie Alzheimera, podczas gdy tych efektów nie badano jednocześnie na modelu szczurzym. Celem pracy było ustalenie i weryfikacja modelu osteoporozy w połączeniu zChoroba Alzheimerau szczurów i zbadać podwójne skutkiechinakozydi akteozyd w tym modelu współbieżnym.

Materiały i metody:Trzy grupy modelowe wycięcia jajników (OVX), pozorowanej operacji z D-galaktozą i AlCl3 (D), wycięcia jajników z D-galaktozą i AlCl3 (OVX plus D) zostały ustawione w tym samym czasie. Szczury w grupach leczonych lekiem poddano wycięciu jajników. Podczas przeprowadzania dootrzewnowej iniekcji D-galaktozy i dożołądkowego podawania AlCl3 szczurom z grup leczonych lekami szczurom podawano doustnieechinakozyd(90 mg/kg/dzień),akteozyd(90 mg/kg/dzień) i lekami kontroli pozytywnej: walerianianem estradiolu (0,6 mg/kg/dzień), chlorowodorkiem donepezilu (0,8 mg/kg/dzień). Po 8 tygodniach leczenia farmakologicznego po raz pierwszy wykonano test Morris Water Maze (MWM) przez 6 dni. Następnie szczury uśmiercono w celu pobrania krwi, macicy, kości udowych, piszczeli i tkanek mózgowych. Surowica została użyta do testów biochemicznych. Do histomorfometrii wykorzystano macice. Prawe kości udowe zostały użyte do mikro-CTi histomorfometrii, odpowiednio. Do testu biomechanicznego wykorzystano prawe kości piszczelowe. Do badań biochemicznych wykorzystano hipokamp zebrany w lodówce. Mózg 41 pobrany przez perfuzję zastosowano do histomorfometrii.

Wyniki:W porównaniu z grupą Sham, grupa OVX plus D może znacznie zmniejszyć zdolność uczenia się i zapamiętywania, powodując uszkodzenia oksydacyjne, osłabiając neurony w hipokampie i wpływając na hydrolizę i syntezę acetylocholiny. Tymczasem aktywność BALP i TRAP w grupie OVX plus D znacznie wzrosła (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">echinakozydorazakteozyd, typowe cechy patologiczne osteoporozy iChoroba Alzheimerazostały poprawione.

Wnioski:Model osteoporozy w połączeniu zChoroba Alzheimerau szczurów było wykonalne i pomyślnie ustalone.Echinakozydi akteozyd również wykazały pewien znaczący wpływ na ten równoległy model i mogą być potencjalnymi 56 kandydatami zCistanche tubulosaz podwójnymi efektami do dalszych badań.

Słowa kluczowe:osteoporoza; choroba Alzheimera; podwójne efekty; echinakozyd; akteozyd; Cistanche tubulosa

CIstanche Lost Empire zioła łagodzą chorobę Alzheimera

1. Wstęp

Osteoporoza jest chorobą zwyrodnieniową kości charakteryzującą się postępującą utratą masy kostnej i niszczeniem mikroarchitektury, co może zwiększać ryzyko złamań osteoporotycznych (Rachner et al., 2011).Choroba Alzheimera(AD) jest powszechną chorobą neurodegeneracyjną u osób starszych, która w warunkach klinicznych charakteryzuje się ciągłym upośledzeniem umysłowym, upośledzeniem funkcji poznawczych i utratą zdolności do samodzielnego życia (Reitz 76 i wsp., 2011). Typowymi cechami patologicznymi AD (Serrano-Pozo et al., 2011) są powstawanie blaszek starczych indukowane przez odkładanie amyloidu, splątki neurofibrylarne spowodowane hiperfosforylacją białka tau oraz degeneracja neuronów w mózgu. Pozornie OP i AD są chorobami całkowicie niezależnymi o różnej patologii i cechach klinicznych. Jednak w praktyce klinicznej często obserwuje się współwystępowanie OP i AD (Zhang i in., 2001; Lui i in., 2003; Luckhaus i in., 2009). Częstość występowania obu chorób wzrastała wraz z wiekiem, zwłaszcza u kobiet po menopauzie (Li i wsp., 2017; Stern, 2012). Coraz więcej dowodów wskazuje, że osoby z rozpoznaniem AD mają zwiększone ryzyko OP (Zhou i in., 2014).

Konieczne jest zbadanie i wyjaśnienie relacji między osteoporozą aChoroba Alzheimerain vitro i in vivo. Przed przeprowadzeniem badań in vivo ważne jest, aby wybrać odpowiednie modele zwierzęce osteoporozy czy choroby Alzheimera. Model osteoporozy można ustalić za pomocą kilku rodzajów metod, takich jak dożołądkowe podawanie kwasu retinowego, operacja wycięcia jajników i domięśniowe wstrzyknięcie glikokortykoidów (Wei i wsp., 2007; Komori, 2015). W szczególności model osteoporozy pomenopauzalnej wywołanej przez wycięcie jajników u szczurów był klasyczny ijest szeroko stosowany w większości badań (Miao i in., 2012; Liu i in., 2017).Sporadyczna choroba Alzheimera jest głównym rodzajem choroby Alzheimera. Zwierzęmodele SporadicChoroba Alzheimeramożna wywołać różnymi metodami, takimi jak:wstrzyknięcie D-galaktozy lub -amyloid, dożołądkowe podanie AlCl3,i tak dalej(Bagheri i in., 2011; Gao i in., 2015; Justin Thenmozhi i in., 2017). Ponadtomodel skojarzony choroby Alzheimera wywołanej długotrwałym podaniem dootrzewnowymwstrzykiwanie D-galaktozy połączone z wycięciem jajników również było przedmiotem wielu badań (Liui in., 2010; Zhao i in., 2012). W celu ujawnienia znaczenia osteoporozy iChoroba Alzheimera, konieczne jest ustalenie modelu osteoporozy połączonejz chorobą Alzheimera w celu zbadania powszechnych mechanizmów działania leków naosteoporoza ichoroba Alzheimeraase.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight jest rośliną pasożytniczą, która występuje głównie na pustyniach w północno-zachodnich Chinach. Suszone soczyste łodygiCistanche tubulosa(CT) są używane jako słynny lek wzmacniający o nazwie Cistanches Herba z chińską nazwą Roucongrong w Farmakopei Chińskiej (2015). Został uhonorowany jako „żeń-szeń pustyni” i jest szeroko stosowany w leczeniu bólu talii i kolan, bezpłodności kobiet i zaparć w tradycyjnej medycynie chińskiej (Jiang i Tu, 2009). Głównymi aktywnymi składnikami CT są glikozydy fenyloetanoidowe (PhG), echinakozyd (ECH) iakteozyd(ACT) są reprezentatywnymi związkami w PhG (Morikawa et al., 2014). W szczególności ECH i ACT są zazwyczaj wybierane jako markery do kontroli jakości w CT ze względu na ich wysoką zawartość i różne działania farmakologiczne, takie jak działanie neuroprotekcji, ochrona kości,

przeciwutleniacze, przeciwstarzeniowe oraz poprawiające zdolność uczenia się i zapamiętywania (Wang i in.,2012; Li i in., 2016). Jednak wpływ ECH i ACT na osteoporozęw połączeniu zChoroba Alzheimeranie były jeszcze badane razem w modelu szczurzym.Dlatego celem tego badania było ustalenie połączonego szczurzego modelu osteoporozyz chorobą Alzheimera i poznaj efektyechinakozydi akteozyd na ten tematmodel współbieżny, aby dostarczyć dowodów eksperymentalnych dla dalszych badańmechanizm molekularny echinakozydu lub akteozydu w poniższych badaniach.

Cistanche Pharma specialdlaOGŁOSZENIE

2. Materiały i metody

2.1. Zwierząt

Osiemdziesiąt 8-tygodniowe samice szczurów rasy Wistar (numer certyfikatu: SCXK 2018-0006), ważące 180~200 g, pozyskano z chińsko-brytyjskiego laboratorium SIPPR/BK Lab. Animal Ltd (Szanghaj, Chiny) i wychowała się w Centrum Doświadczalnym Zwierząt Farmaceutycznych na Chińskim Uniwersytecie Farmaceutycznym.

2.2. Chemikalia i odczynniki

Hydrat chloralu, sól sodową penicyliny G, D-galaktozę, heksahydrat chlorku glinu, walerianian estradiolu, chlorowodorek donepezylu zakupiono od Aladdin Industrial Corporation (Szanghaj, Chiny).Echinakozyd(HPLC 94 procent) otrzymano z Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Chiny).Akteozyd(HPLC 98%) zakupiono od Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Chiny). Zestawy do testów immunoenzymatycznych (ELISA) dla specyficznej dla kości fosfatazy alkalicznej (BALP), kwaśnej fosfatazy opornej na winian (TRAP), dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), aldehydu malonowego (MDA), acetylocholinesterazy (AChE) i acetylotransferazy cholinowej (ChAT) (ChAT) zakupiono od Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Szanghaj, Chiny). Uniwersalny utrwalacz tkanek uzyskano zChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Chiny).

echinakozyd

2.3. Modele zwierzęce i zabiegi

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były autoryzowane i nadzorowane przez Komitet ds. Etyki Zwierząt Chińskiego Uniwersytetu Farmaceutycznego. Szczury utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22±2°C) i karmiono standardową paszą granulowaną i wodą wodociągową.

Po adaptacji trwającej tydzień uzyskano model osteoporozy, przeprowadzając operację wycięcia jajników (French i wsp., 2008). Po zakończeniu operacji jednorazowo spryskano szew rany penicyliną sodową G, aby zapobiec infekcji. Następnie szczury karmiono normalnie przez trzy tygodnie. Zgodnie z literaturą (Hua i in., 2007; Alawdi i in., 2017), modelChoroba Alzheimeramożna wywołać przez długotrwałe dootrzewnowe wstrzyknięcie D-galaktozy połączone z wycięciem jajników lub długotrwałym dożołądkowym podawaniem AlCl3. Aby zbadać wykonalność modelu osteoporozy w połączeniu z chorobą Alzheimera, trzy grupy modelowe: wycięcie jajników (grupa OVX), fikcyjna operacja z wstrzyknięciem dootrzewnowym 150 mg/kg/d D-galaktozy i podaniem dożołądkowym 30 mg/kg/d AlCl3 (grupa D), w tym badaniu ustalono wycięcie jajników z dootrzewnowym wstrzyknięciem 150 mg/kg/dzień D-galaktozy i podanie dożołądkowe 30 mg/kg/dzień AlCl3 (grupa OVX plus D).

Dlatego szczury podzielono losowo na osiem grup (n{{0}} dla każdej grupy) po 3 tygodniach i leczono doustnie lekami przez 8 tygodni: Grupa pozorowana; grupa OVX; grupa D; OVX plus grupa D; grupa leczona walerianianem estradiolu (grupa EV, OVX plus D plus 0,6 mg/kg/d walerianian estradiolu); grupa leczona chlorowodorkiem donepezilu (grupa DPZ, OVX plus D plus 0,8 mg/kg/dzień chlorowodorku donepezilu);echinakozydgrupa leczona (grupa ECH, OVX plus D plus 90 mg/kg/d echinakozydu);akteozydgrupa leczona (grupa ACT, OVX plus D plus 90 mg/kg/d akteozydu). Zgodnie z zasadą przeliczania dawki ekwiwalentnej dawki człowiek-szczur i dawką z powiązanego odniesienia (Li i in., 2013; Gao i in., 2014), przyjęto dawki dla grup leczonych lekami w tym badaniu.

Masę ciała każdego szczura mierzono co tydzień. Po całej kuracji lekami trwającej 8 tygodni najpierw wykonano test Morris Water Maze (MWM) przez 6 dni. Następnie 6 szczurów z każdej grupy uśmiercono w celu zebrania materiałów. Szczury znieczulono dootrzewnowym wstrzyknięciem 3,0 ml/kg 10% wodzianu chloralu i pobrano krew z aorty brzusznej. Krew umieszczono w temperaturze pokojowej do skrzepnięcia i odwirowano przy 3500 obr/min przez 10 min. Surowicę zebrano w 1,5 ml probówce wirówkowej (NEST Biotechnology) i przechowywano w -80 stopniu do czasu użycia w testach biochemicznych. Następnie pobrano macicę, kość udową, piszczel i tkanki mózgowe. Do histomorfometrii wykorzystano macice. Prawe kości udowe wykorzystano odpowiednio do mikrotomografii i histomorfometrii. Do testu biomechanicznego wykorzystano prawe kości piszczelowe. Do badań biochemicznych wykorzystano hipokamp zebrany w lodówce. Następnie pozostałe trzy szczury z każdej grupy poddano perfuzji z serca solą fizjologiczną i uniwersalnym środkiem utrwalającym tkankę w celu pobrania mózgu do histomorfometrii.

2.4. Test labiryntu wodnego Morrisa (MWM)

Po 8 tygodniach interwencji szczury poddano testom uczenia się odniesień przestrzennych i pamięci w teście MWM. Test MWM przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanymi metodami (Morris, 1984; Gao i in., 2016). W skrócie, 5 kolejnych dni z czterema próbami dziennie, szczury szkolono w używaniu różnych wizualnych wskazówek umieszczonych na ścianie basenu, aby znaleźć ukrytą zanurzoną platformę (średnica 11 cm, wysokość 29 cm) w okrągłym basenie (średnica 130 cm, wys. 50 cm) wypełnione nietoksyczną wodą zabarwioną tuszem węglowym. Basen został wyimaginowany podzielony na cztery ćwiartki, a cztery pozycje startowe znajdowały się na przecięciach ćwiartek. Platforma znajdowała się w środku jednego z kwadrantów, a pozycja była stała podczas prób. W każdej próbie szczury umieszczano losowo w wybranych miejscach, twarzą do ściany basenu. Każdą próbę kończono, gdy szczur dotarł do platformy lub po 60 s, a upływający czas rejestrowano jako opóźnienie ucieczki. Szczur, który nie doszedł do platformy, został na nią wprowadzony. Po każdej próbie na ukrytej platformie szczur pozostawał na platformie przez 10 sekund. Jako wyniki treningu obliczono średni czas opóźnienia czterech prób dziennie. W dniu 6 wszystkie szczury poddano próbie sondy, w której pływały przez 60 s w basenie bez platformy. Jako wyniki końcowe rejestrowano czasy przejścia w lokalizacji platformy i czas podróży w kwadrancie docelowym. Szczury były monitorowane przez kamerę zamontowaną w suficie bezpośrednio nad basenem, a wszystkie próby były rejestrowane i analizowane przy użyciu programu MORRIS MAZE dostarczanego przez Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Pekin, Chiny).

2.5. Test biochemiczny metodą ELISA

Zgodnie z instrukcjami producenta zestawów ELISA, aktywność swoistej dla kości fosfatazy alkalicznej (BALP), aktywność kwaśnej fosfatazy odpornej na winian (TRAP), aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) oraz zawartość dialdehydu malonowego (MDA) w surowicy zostały zbadane przez firmę BioTek Synergy 2 wielomodowe czytniki mikropłytek (BioTek, USA). Tkanki hipokampu z każdej grupy przemyto PBS (0,01 M, pH 7,4) w celu usunięcia krwi lub zanieczyszczeń pozostających na powierzchni tkanki. Tkanki hipokampu po jednej stronie zważono, a następnie pocięto na możliwie najmniejsze kawałki. Tkanki hipokampu homogenizowano w stosunku 1:9 (masa tkanki: objętość PBS). Homogenat wirowano w 4 stopniach, 3000 obr/min przez 15 min. Supernatant zebrano i rozcieńczono w celu pomiaru stężenia białka metodą BCA. Aktywność acetylocholinesterazy (AChE), aktywność acetylotransferazy cholinowej (ChAT), aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) oraz zawartość dialdehydu malonowego (MDA) w tkance hipokampa zbadano następnie metodami ELISA.

2.6. Histomorfometria hipokampu

Tkanki mózgowe (n=3/grupę) utrwalono w uniwersalnym utrwalaczu tkanek. Próbki tkanki mózgowej zostały następnie przemyte, odwodnione gradientem etanolu, zatopione w parafinie i pokrojone na skrawki koronowe o wielkości 5 μm. Skrawki wybarwiono hematoksyliną i eozyną (HE). Następnie części wieńcowe tkanek mózgu sfotografowano za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (Nikon, Japonia). Szczególnie zaobserwowano zmiany morfologiczne CA1, CA2, CA3 i DG w hipokampie.

2.7. Histomorfometria i morfometria macicy

Wybrane macice (n{{0}}/grupę) utrwalono w uniwersalnym utrwalaczu tkanek. Próbki tkanki macicy następnie przemyto, odwodniono gradientem etanolu, zatopiono w parafinie i pocięto na poprzeczne przekroje 5 μm. Skrawki wybarwiono hematoksyliną i eozyną (HE). Zaobserwowano i sfotografowano poprzeczne przekroje macicy. Wybrano losowo pięć pól widzenia, następnie zmierzono średnicę przekroju poprzecznego macicy i grubość nabłonka błony śluzowej macicy za pomocą oprogramowania Image-Pro Plus 6.0. Policzono również liczbę gruczołów macicy w blaszce właściwej.

2.8. Mikro-CT

Wybrane prawe kości udowe (n=3/grupę) zeskanowano w pozycji z odległością obiektu do źródła 121 mm i odległością kamery do źródła 171 mm za pomocą SkyScan 1176 micro X- promieniowa tomografia komputerowa (mikro-CT) skaner (Bruker, Niemcy). Jako powierzchnię odniesienia wybrano dalszą płytkę wzrostową. Przy odległości 1 mm poniżej powierzchni odniesienia, jako badaną objętość wybrano region o grubości 1,8 mm (VOI, 100 warstw). Uzyskane obrazy w skali szarości miały rozmiar piksela 17,76 μm z rekonstrukcji kości (65 kV, 385 μA). Do selekcji beleczek z kości korowej zastosowano półautomatyczną metodę konturowania. Zastosowano bezpośrednie metody pomiaru 3D do oceny procentowej objętości kości (BV/TV), gęstości powierzchni kości (BS/TV), separacji beleczkowania (Tb. Sp), liczby beleczkowania (Tb. N), grubości beleczkowania (Tb. Th). , wskaźnik modelu struktury (SMI), współczynnik kształtu beleczkowania (Tb. Pd) i średnią gęstość mineralną kości (średnie BMD) dla tego samego VOI przy użyciuCTProgram analizatora (Bruker, Niemcy). Wizualizację 3D VOI za pomocą algorytmu renderowania adaptacyjnego wykonano za pomocą oprogramowania CTvol (Bruker, Niemcy).

ekstrakt roślinny z cistanche

2.9. Histomorfometria kości

Wybrane prawe kości udowe (n=3/grupę) utrwalono w uniwersalnym utrwalaczu tkanek, a następnie odwapniono w roztworze 10% EDTA-2Na przez 3 tygodnie. Odwapnione próbki przemyto, odwodniono gradientowym etanolem, zatopiono w parafinie i pocięto na podłużne odcinki 5 μm. Skrawki wybarwiono hematoksyliną i eozyną (HE). Sfotografowano podłużne przekroje kości udowych. Obserwowano struktury tkanki kostnej każdej grupy, a zwłaszcza struktury kości beleczkowej.

2.10. Test biomechaniczny

Wybrane losowo prawe kości piszczelowe (n=4/grupę) poddano ocenie w teście trzypunktowego zginania przy użyciu uniwersalnej maszyny testującej (SHIMADZU, Japonia). Średnice tych próbek mierzono suwmiarką z noniuszem w zakresie 2.16-2.38 mm (d). Próbkę umieszczono następnie na dwóch podtrzymujących poprzeczkach w odległości 25 mm (L) między dwiema szynami, a fizjologiczna krzywizna próbki była skierowana ku górze. Pręt obciążający znajdował się w środku próbki i spadał ze stałą prędkością 1,5 mm/min aż do złamania próbki. Dane dotyczące siły (F) i przemieszczenia były automatycznie rejestrowane w komputerze, który był połączony z maszyną testującą i jednocześnie wykreślano krzywą obciążenia-odkształcenia. Wartości maksymalnego obciążenia (N) i pochłaniania energii (mJ) były rejestrowane jednocześnie przez oprogramowanie TRAPEZIUM X do badania materiałów. Wartości maksymalnego naprężenia (MPa) obliczono według wzoru: Naprężenie (σ)=Moment zginający (M) / Współczynnik przekroju (Z)=(8×L×F) / ( π×d3 )

2.11. Analiza statystyczna

Wyniki grup modelowych porównano z grupą Sham, a wyniki grup leczonych lekiem porównano z grupą OVX plus D. Dane analizowano przy użyciu jednokierunkowej analizy ANOVA, a następnie testu wielokrotnego porównania Bonferroniego przy użyciu oprogramowania Graph Pad Prism 5.0. Dane wyrażono jako średnią ± SD, a wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za istotne statystycznie.

mirycetynaorazcistanche

KLIKNIJ TUTAJ, ABY CZĘŚĆ 2