Część 1: Ekstrakty z Cistanche Deserticola mogą antagonizować immunostarzenie i wydłużać żywotność u myszy ze skłonnością do starzenia 8 (SAM-P8) z przyspieszoną starzeniem

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Ke Zhang,1 Xu Ma,1 Wenjun He,1 Haixia Li,1 Shuyan Han,1 Yong Jiang,1

Hounan Wu,2 Li Han,3 Tomohiro Ohno,3 Nobuo Uotsu,3 Kohji Yamaguchi,3 Zhizhong Ma,1,4 i Pengfei Tu1

1 Wydział Leków Naturalnych, Szkoła Nauk Farmaceutycznych, Uniwersytet Pekiński, nr 38 Xueyuan Road, Pekin 100191, Chiny

2 Centrum Medyczne i Zdrowe Analityczne, Uniwersytet Pekiński, nr 38 Xueyuan Road, Pekin 100191, Chiny

3 Wydział Badań Podstawowych, Fancl Research Institute, FANCL Corporation, 12-13 Kamishinano, Totsuka-ku, Yokohama, Kanagawa 244-0806, Japonia

4 Department of Integration of Traditional Chinese and Western Medicine, School of Basic Medical Sciences, Beijing University, No. 38 Xueyuan Road, Pekin 100191, Chiny

Korespondencję należy kierować do Zhizhong Ma; zhma@bjmu.edu.cn i Pengfei Tu; pengfeitu@bjmu.edu.cn Otrzymano 19 lipca 2013 r.; Zaktualizowano 23 października 2013 r.; Przyjęto 11 listopada 2013 r.; Opublikowano 9 stycznia 2014 r.; Redaktor akademicki: Adair Santos

Wstęp

Cistanche deserticola, jeden z najpopularniejszych tradycyjnych chińskich leków ziołowych / produktów zdrowotnych, został opisany w wielu historycznych chińskich farmakopeach ziołowych jako posiadający właściwości przeciwstarzeniowe. W związku z tym jest szeroko stosowany w Chinach do leczenia różnych zaburzeń związanych z wiekiem, w tym demencji starczej, impotencji, niepłodności, przewlekłych infekcji i zaburzeń krwiotwórczych u osób starszych [1]. Nowoczesne metody chemiczne pozwoliły na wyodrębnienie dwóch głównych typów związków, glikozydów fenyloetanoidowych i oligosacharydów, jako głównych składników aktywnych Cistanche deserticola [1]. W ostatniej dekadzie intensywnie badano Cistanche deserticola i jej ekstrakty, które wykazały zdolność do ochrony neuronów przed uszkodzeniem wywołanym przez neurotoksyny [2], hamowania hepatotoksyczności wywołanej przez tetrachlorek węgla [2] i promowania regeneracji komórek szpiku kostnego z Uszkodzenia radiacyjne wywołane przez Co [3]. Wykazano również, że ma działanie przeciwzapalne, przeciwutleniające i przeciwstarzeniowe [4]. Jednakże, czy Cistanche deserticola może wydłużyć życie i jakie są leżące u jego podstaw mechanizmy molekularne [3] związane z jegoprzeciw starzeniuwłaściwości nie zostały rygorystycznie przetestowane.

Ekstrakty z Cistanche deserticola o działaniu przeciwstarzeniowym

Immunosenescencja, czyli zmiany układu odpornościowego wraz z wiekiem, stanowią tło, na którym odnotowano zwiększoną podatność na infekcje, nowotwory, choroby neurodegeneracyjne i autoimmunologiczne u osób starszych [5]. Istnieją doniesienia, że interwencje terapeutyczne, takie jak ograniczenie kalorii [6] i suplementacja witaminy E, skutecznie opóźniają postęp immunostarzenia, a tym samym zmniejszają zachorowalność na niektóre choroby związane z wiekiem, a także wydłużają długość życia zarówno ludzi, jak i gryzoni [7, 8]. Badania w tym zakresie komplikuje jednak fakt, że starzenie się wiąże się z paradoksem jednoczesnego niedoboru odporności i przewlekłego stanu zapalnego [9]. Oznacza to, że prosta stymulacja proliferacji limfocytów lub przeciwzapalna nie stanowi idealnej interwencji terapeutycznej w radzeniu sobie ze starzeniem się i schorzeniami związanymi z wiekiem [10]. W związku z tym w poszukiwaniu interwencji medycznych zdolnych do zapobiegania lub łagodzenia stanów związanych z wiekiem, w tym infekcji, nowotworów, chorób autoimmunologicznych, miażdżycy i chorób neurodegeneracyjnych, które są głównymi przyczynami zgonów i niepełnosprawności, a także naprawie wad układu odpornościowego musi towarzyszyć hamowanie reakcje zapalne.

Mysz z akceleracją starzenia [11] jest mysim modelem wsobnym, wywodzącym się ze szczepu AKR/J, który jest szeroko stosowany w badaniach nad starzeniem się. Podszczep P8 (SAM-P8) tych myszy ma znacznie skróconą długość życia w porównaniu z podszczepem R1 (SAM-R1), który również wykazuje wolniejszy proces starzenia [12]. Równolegle z przedwczesnym starzeniem się myszy SAM-P8 wykazują również zwiększoną neurologiczną starzenie się, immunostarzenie i związane z wiekiem deficyty krwiotwórcze, które ściśle naśladują typowe cechy starzenia się człowieka [13, 14]. Analiza mechanizmów leżących u podstaw przyspieszonego procesu starzenia i zaburzeń związanych z wiekiem wskazuje, że w grę wchodzą dysfunkcja mitochondriów [15], stres oksydacyjny oraz zwiększona szybkość mutacji somatycznego DNA [16, 17]. Ten mysi system, z jednorodnym tłem genetycznym, stanowi zatem doskonały model eksperymentalny do badania terapii starzenia i przeciwdziałania starzeniu się [12], który został zdeponowany w zielniku Szkoły Nauk Farmaceutycznych Uniwersytetu Pekińskiego w Chinach.

cistanche extract

cistanche może przeciwdziałać starzeniu

2. Materiały i metody

2.1. Materiały.

ŚwieżyCistanche deserticola YC MAzostał zebrany z różnych obszarów w północno-zachodnich Chinach, w tym z regionów autonomicznych Xinjiang, Neimenggu i Ningxia. Próbki użyte do przygotowania ekstraktów zostały uwierzytelnione przez profesora Pengfei Tu, specjalistę farmakognozji z Wydziału Medycyny Naturalnej Wydziału Nauk Farmaceutycznych Uniwersytetu Pekińskiego. Wykorzystany egzemplarz kuponu Cistanche deserticola (numer CD-2007-03-08) miał Centrum Nauki (Pekin, Chiny). Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Pekińskiego i zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych na Uniwersytecie Pekińskim. Numer certyfikacji tych myszy to SCXK2001-2008. Myszy trzymano w standardowych klatkach metabolicznych w warunkach środowiskowych

C, 45-60% wilgotności i 12-godzinny cykl światło/ciemność) i zapewniono swobodny dostęp do żywności i wody. Po 2 tygodniach aklimatyzacji zwierzęta podzielono na pięć grup: 3 grupy leczone ECD, grupę kontrolną SAM-R1 i grupę kontrolną SAM-P8 bez leczenia. Dieta 3 leczonych grup została uzupełniona dietą zmieszaną z różnymi stężeniami ECD: wydajność niskich (50 mg/kg), średnich (150 mg/kg) i wysokich (450 mg/kg) średnich dawek ECD dziennie . Grupy kontrolne SAM-R1 i SAM-P8 bez leczenia były karmione tą samą dietą bez ECD. Pomiar spożycia pokarmu przez wszystkie zwierzęta prowadzono co trzy dni przez cały eksperyment. Miesiące ciśnienia krwi i serca na czas trwania eksperymentu w celu określenia stanu zdrowia myszy. Długość życia każdej myszy była Żywe limfocyty apoptotyczne i nekrotyczne oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu Annexin V-FITC (Beijing Biosea Biotechnology Co., Ltd., Pekin, Chiny). Limfocyty poddano podwójnemu wybarwieniu znakowaną aneksyną V sprzężoną z izotiocyjanianem fluoresceiny (Annexin V-FITC) i zawieszono propid w 200 μl buforu wiążącego (10 mM HEPES/NaOH,

2.2 Przygotowanie ekstraktów Cistanche deserticola (ECD) i analiza HPLC.

Suszona na powietrzu i pokrojona w plasterki desericola Cistanche(2,0 kg) sproszkowano i dwukrotnie wyekstrahowano 70% etanolem przez 1 godzinę. Stosowane stosunki roślina/etanol wynosiły 1/6 (wag./wag.) w pierwszej ekstrakcji i 1/4 (wag./wag.) w drugiej ekstrakcji. Dwa ekstrakty połączono i przefiltrowano przed zatężeniem do gęstości względnej 1,10-1,15 pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 60°C. Koncentrat ten został następnie wysuszony próżniowo, a otrzymany proszek był ekstraktem z Cistanche deserticola (ECD) stosowanym w tym badaniu .

Składniki ECD analizowano metodą HPLC, jak opisano wcześniej [1]. W skrócie, 100 mg proszku ECD rozpuszczono w 10.0 ml H2O i po filtracji wstrzyknięto do HPLC. Analizę HPLC przeprowadzono na układzie do chromatografii cieczowej Agilent 1100 (Agilent Co., USA). Faza ruchoma składała się z mieszaniny metanolu (A) i 0,10% kwasu metanolowego (B). Zastosowano program do chromatografii gradientowej; było to 26,5% (A) i 73,5% (B) w 0-7 min, 26,5-29,5% (A) i 73,5-70,5 (B) w 8-10 min oraz 29,5% (A) i 70,5% (B). ) za 20–27 min. Szybkość przepływu utrzymywano na stałym poziomie 1,0 ml/min, objętość nastrzyku wynosiła 10 ml, a temperaturę kolumny utrzymywano na poziomie 25°C. Do monitorowania wypływu z kolumny i generowania chromatogramów zastosowano detektor UV ustawiony na 330 nm.

sliced Cistanche deserticola

Suszona i pokrojona w plasterki desericola Cistanche

Glikozydy fenyloetanoidowe i oligosacharydy cistanchezostały zidentyfikowane na podstawie ich czasów retencji i widm absorpcji. Oznaczenie ilościowe przeprowadzono za pomocą zewnętrznych krzywych kalibracji wzorca. Wydajnośćekstrakty z Cistanche deserticola(ECD) wynosiła około 3,33%, a zawartość fenyloetanoidów wynosiła 17,94%. Akteozyd i echinakozyd były dwoma głównymi składnikami tej frakcji, a ich zawartość wynosiła odpowiednio 3,80% i 8,25%. Oligosacharydy stanowią 82 procent całkowitej ECD. Stężenia głównych aktywnych składników ECD przedstawiono w tabeli 1.

2.3 Analiza rozpiętości życia zwierząt.

Niniejsze badanie skupiło się na zbadaniu, czyekstrakty z Cistanche deserticolasą w stanie przedłużyć żywotność myszy SAM-R1 zostały zakupione w Laboratorium Hodowli Zwierząt i Centrum Badawczego Zdrowia Uniwersytetu Pekińskiego. Myszy SAM-P8 odwróciły ich status immunostarzenia.

2.4. Analiza statystyczna.

Dane przedstawiono jako wartości średnie SD Porównania między różnymi grupami przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA z testem post hoc. W badaniu długości życia dane poddano analizie przeżycia Kaplana-Meiera, która obejmowała zastosowanie zarówno testu log-rank (Mantel-Cox), jak i Gehana-Breslowa-Wilcoxona. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu Statistical Package for Social Sciences for Windows (SPSS, sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS, pH 7,4) zawierająca 00,01% azydek sodu i poddano analizie FCM. Subpopulacje limfocytów analizowano metodą przepływową cytometrii przy użyciu cytometru przepływowego FACS Calibur (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) i oprogramowania do analizy BD CellQuest. Chicago, IL) i za istotne.

cistanche extract

Glikozydy fenyloetanoidowe i oligosacharydy cistanche

3. Wyniki

Uwzględniono wartość mniejszą niż 0.05.Ocena żywotności komórek obwodowych limfocytów T za pomocą aneksyny V-FITC i podwójnego barwienia PI i analizy FACS. Po suplementacji diety myszy SAM-P8 trzema dawkami ECD przez 4 tygodnie, zwierzęta utrzymywano na czczo przez 12 godzin, a następnie znieczulano i pobierano krew i analizowano.

3.1. Analiza potencjalnych składników aktywnych w ekstraktach z Cistanche deserticola (ECD). Jak pokazano w Tabeli 1, ECD składa się głównie z dwóch typów związków, glikozydów fenyloetanoidowych i oligosacharydów. W glikozydach fenyloetanoidowych zidentyfikowano echinakozyd, akteozyd i kwas 8-epiloganowy, podczas gdy w oligosacharydach zidentyfikowano tylko galaktytol.

3.2.Wpływ CistanchedeserticolakbdO4ct na średni okres życia myszy SAM-P8. Do tego i kolejnych badań ośmiomiesięczne samce myszy SAM-P8 podzielono na 4 grupy. Wśród nich jedna grupa myszy była karmiona normalną dietą bez ECD, pozostałe 3 grupy przyjmowały oddzielnie diety zawierające różne proporcje ECD. We wszystkich eksperymentach jako grupę kontrolną zastosowano myszy z podszczepu SAM-R1, które charakteryzują się normalnym procesem starzenia i długością życia.

W porównaniu z kontrolną grupą SAM-R1, średnia długość życia myszy SAM-P8 była znacząco skrócona (Figura 1(a);<0.001). although="" supplementation="" of="" diet="" with="" the="" low="" dose(50mg/kg)of="" ecd="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" increase="" in="" life="" spanofsam-p8mice,="" at="" the="" medium="" (150="" mg/kg)and="" high(450="" mg/ml)="" supplementary="" doses="" there="" was="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" life="" span="" (figures="" 1(a)and=""><0.05 0.0thatwasconfirmedby="" kaplan-meier="" survival="" analysis,="" which="" included="" use="" of="" both="" the="" log-rank="" (mantel-cox)="" and="" gehan-breslow-wilcoxon="">

3.3. Odwrócenie immunosenescencji u myszy SAM-P8 przez ekstrakty z Cistanche deserticola (ECD). Zmniejszenie obwodowych naiwnych limfocytów T i równoczesny wzrost obwodowych limfocytów T pamięci to główne cechy immunostarzenia, które są powszechnie uważane za główne przyczyny zaburzeń immunologicznych związanych z wiekiem. Ta immunostarzenie w SAM-P8 w stosunku do SAM-R1

aniftalsv0jest to prawie oczywiste, gdy analiza FACS miała na celu wyliczenie limfocytów (CD3 plus CD44wCD4Bigh) jako wskaźnika naiwnych limfocytów T i (limfocyty CD3 plus CD44gh CD45 BR jako wskaźnika limfocytów T pamięci. Zatem, niedobór krwi obwodowej( Rysunek 2) i komórki śledziony (Rysunek 3) u myszy SAM-P8 zaobserwowano zmniejszone poziomy naiwnych limfocytów T i zwiększone poziomy limfocytów T pamięci. Stwierdzono, że suplementacja diety myszy SAM-P8 ECD jest w stanie odwrócić te wskaźniki zależny sposób zarówno w populacji krwi obwodowej (ryc. 2), jak i komórek śledziony (ryc. 3) Jako dodatkowy wskaźnik odwrócenia immunostarzenia przez suplementację diety przez ECD, poziom komórek NK [18], głównego markera komórkowego wrodzonego układu odpornościowego Wykazało to, że suplementacja diety ECD spowodowała zależny od dawki wzrost liczby komórek NK (CD3 plus CD49 plus) zarówno w populacji limfocytów krwi obwodowej (Figura 4), jak i komórek śledziony (Figura 5).

3.4. Ekstrakty z Cistanche deserticola wzmacniają relacyjną intensywność fluorescencji komórek Sca-1 dodatnich u myszy SAM-P8. Antygen komórek macierzystych-1(Sca-1)jest jednym z najważniejszych biomarkerów hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) w populacjach komórek szpiku kostnego.Sca-1 dodatnie komórki również reprezentują prekursory limfocytów, które mają zostały świeżo wywiezione ze szpiku kostnego do krwi obwodowej, gdzie są poddawane.

Rysunek 2: Analiza FACS wpływu suplementacji diety limfocytozyną krwi obwodowej ECD naiwną i pamięciową. Ośmiomiesięczne samce myszy SAM-P8 i kontrolne myszy SAM-RI podzielono na 5 grup. Trzy leczone grupy zwierząt SAM-P8 były karmione przez cztery tygodnie dietami uzupełnionymi niskimi (100 mg/kg), średnimi (500 mg/kg) i wysokimi (2500 mg/kg) dawkami ECD, a dwa zwierzęta kontrolne

przez bramkowanie na komórkach CD3 plus T. Linie nie pokazane na każdym wykresie wskazują progi stosowane do rozróżnienia CD44x* i CD45 należy zastosować całkowicie niską identyfikację limfocytów T naiwnych (CD3 plus Cp b"C4RB→) i pamięci (CD3 plus CD4hCD 4Bl). b)Histogram pokazujący grupy były karmione na tej samej diecie bez suplementacji Po 12 godzinach poszczenia pobrano krew obwodową od znieczulonych zwierząt z podgrupy komórek T RB i poddano analizie FACS, wszystko jak opisano w rozdziale 5. Reprezentatywne wykresy FACS różnych grup komórek generowały odsetek naiwnych we krwi obwodowej różnych grup zwierząt. (c) Histogram pokazujący procent komórek T pamięci we krwi obwodowej różnych grup zwierząt. Słupki reprezentują średnią ± SD (w każdej grupie,=10).<0.05sam-p8versus>

Rycina 3: Analiza FACS wpływu suplementacji diety limfocytami limfocytów ECD naiwnych i pamięci w śledzionie.Ośmiomiesięczne samce myszy SAM-P8 i kontrolneSAM-RI podzielono na 5 grup.Trzy leczone grupy zwierząt SAM-P8 karmiono przez cztery tygodnie dietami uzupełnionymi przy niskich (100 mg/kg), średnich (500 mg/kg) i wysokich (2500 mg/kg) dawkach ECD i dwóch kontrolnych grupach zwierząt przez bramkowanie CD3 plus limfocyty T. Linie pokazane na każdym wykresie wskazują, że należy użyć do rozróżnienia CD44zhand CD45 bw używanego do identyfikacji naiwnych（CD3 plus CD „CsRB动）i pamięci（CD3plusCD42CDI'mTcels.（b）Histogram pokazujący był karmiony na tę samą dietę bez suplementacji Po 12 godzinach poszczenia śledzionowe limfocyty pobrano od zwierząt z znieczulonych podgrup komórek T RB i poddano analizie FACS, wszystkie opisane w Rozdziale 5. (a) Reprezentatywne wykresy FACS wytworzonych różnych grup mic.

Rysunek 4: Wpływ suplementacji diety ECD na komórki NK (komórki NK, CD3 plus CD49 plus komórki T) w populacjach limfocytów krwi obwodowej myszy SAM-P8. Ośmiomiesięczne samce myszy SAM-P8 i kontrolne myszy SAM-RI podzielono na 5 grup. Trzy leczone grupy zwierząt SAM-P8 były karmione przez cztery tygodnie dietami uzupełnionymi niską (100 mg/kg), średnią (500 mg/kg) i wysoką (2500 mg/kg) dawką ECD, a dwie kontrolne grupy zwierząt były przeznaczone do ta sama dieta bez suplementacji. Po poście przez 12 godzin pobrano krew obwodową od znieczulonych zwierząt i poddano analizie FACS, wszystko jak opisano w Części 5. (a) Reprezentatywne wykresy FACS dla różnych grup myszy wytworzonych przez bramkowanie na limfocyty T CD3 plus CD49 plus. (b) Histogram przedstawiający odsetek komórek T naturalnego zabójcy w krwi obwodowej różnych grup zwierząt. Słupki przedstawiają średnią ± SD (każda grupa, =10).=<0.01><0.01 each="" treatedgroup="" versussam-p8group="" (byone="" way="" anovawith="" post="" hoc="">

Rysunek 5: Wpływ suplementacji diety ECD na komórki NK (komórki NK, CD3 plus CD49 plus komórki T) w limfocytach śledziony myszy SAM-P8. Ośmiomiesięczne samce myszy SAM-P8 i kontrolne myszy SAM-RI podzielono na 5 grup. Trzy grupy leczone zwierząt SAM-P8 były karmione przez cztery tygodnie dietami uzupełnionymi niskimi (100mg/kg), średnimi (500mg/kg) i wysokimi (2500mg/kg) dawkami ECD, a dwie kontrolne grupy zwierząt były karmione tą samą dietą bez suplementacji. Po 12 godzinach poszczenia limfocyty śledziony pobrano od znieczulonych zwierząt i poddano analizie FACS, opisanej w części 5. (a) Reprezentatywny wykres FACS dla różnych grup myszy wytworzonych przez bramkowanie na limfocyty T CD3 plus CD494. (b) Histogram przedstawiający odsetek T NK komórki w limfocytach śledziony różnych grup zwierząt. Słupki reprezentują średnie SD (w każdej grupie,=10), # < 0,01="" sam-p8="" yersus=""><0.01 eachtreatedgroup="" versussam-p8group(by="" oneway="">

Dalsze różnicowanie w różne typy dojrzałych limfocytów. W konsekwencji te Sca-1-dodatnie komórki stanowią główne źródło naiwnych limfocytów T we krwi obwodowej. Figura 6 pokazuje, że w porównaniu z myszami kontrolnymi SAM-R1, względna intensywność fluorescencji komórek Sca-1 dodatnich u myszy SAM-P8 była znacznie niższa. Wykazano, że suplementacja diety myszy SAM-P8 trzema różnymi dawkami ECD znacząco zwiększa względną intensywność fluorescencji komórek Sca-1 dodatnich (Figura 6).