Część 1: Zintegrowana farmakologia sieciowa i model danio pręgowanego do badania składników o podwójnym działaniu Cistanche Tubulosa w leczeniu zarówno osteoporozy, jak i choroby Alzheimera
Mar 30, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * i Fei Li 1, 2, *
ABSTRAKCYJNY
Znaczenie etnofarmakologiczne:Osteoporoza (OP) i choroba Alzheimera (AD) są powszechnymi współistniejącymi chorobami geriatrycznymi, a wiele badań wskazuje na związek ich patogenezy. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) jest szeroko stosowaną tradycyjną medycyną chińską i jest szeroko stosowana odpowiednio w leczeniu OP i AD. Jednak aktywne składniki dla obu współistniejących chorób jednocześnie i mechanizmów leżących u ich podstaw są ograniczone.
Cel pracy:Prace te miały na celu ustanowienie skutecznej i niezawodnej metody przesiewowej sieci w celu znalezienia związków o podwójnym działaniu w CT, które mogą jednocześnie chronić AD i OP. I zapewni nowe perspektywy powiązania między OP i AD w mechanizmach molekularnych.
Materiał i metody:Podwójne efekty CT były systematycznie analizowane poprzez integrację wielu baz danych i obszerną analizę na poziomie farmakologii sieciowej. Skonstruowano sklasyfikowaną sieć interakcji lek-cel, aby ujawnić różnice w skutkach między różnymi typami związków. Aby udowodnić skuteczność tej sieci, wybrano niektóre związki do weryfikacji w modelu preindukowanej OP i modelu AD wywołanej AlCl3- u danio pręgowanego zgodnie z parametrami topologicznymi.
Słowa kluczowe:Farmakologia sieciowa; Osteoporoza;Choroba Alzheimera; Tubulosa Cistanche; Danio pręgowany.
Cistanche pełni funkcję antyalzheimerską.
1. Wstęp
Tendencja wiekowa populacji powoduje wzrost częstości występowania osteoporozy (OP) i choroby Alzheimera (AD) na przestrzeni lat (Parnetti i in., 2019; Rizzoli, 2018). Obecnie zarówno OP, jak i AD zostały uznane za główne zagrożenia dla zdrowia publicznego, ponieważ mogą rozwijać się bez objawów i przynosić ogromne obciążenia społeczne (Erkkinen i in., 2018; Jonsson i in., 2018). Jako choroby związane z wiekiem często współwystępują w praktyce klinicznej z wysokim wskaźnikiem niepełnosprawności i śmiertelności (Dengler-Crish i Elefteriou, 2019). OP jest ogólnoustrojową chorobą szkieletową charakteryzującą się niską masą kostną i upośledzoną mikroarchitekturą tkanki kostnej, ze zwiększoną kruchością kości i zwiększonym ryzykiem złamań (Rizzoli, 2018). AD jest najczęstszą degeneracją mózgu charakteryzującą się postępującą utratą pamięci i innych funkcji poznawczych (Bondi i in., 2017). Do tej pory wciąż nie ma wystarczająco skutecznych opcji zapobiegania lub leczenia dwóch chorób o złożonej etiologii i patogenezie. A co gorsza, pacjent częściej ma skutki uboczne (Brown, 2017; Huang i Mucke, 2012).
Na podstawie teoretycznych podstaw różnicowania syndromów (Sucher, 2013), tradycyjne chińskie leki (TCM) z wieloma składnikami ukierunkowanymi na więcej niż jeden mechanizm patofizjologiczny mają wyjątkową przewagę w leczeniu niektórych znanych złożonych chorób. Jako zioło wzmacniające nerki, Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) jest szeroko stosowany przez tradycyjnych chińskich lekarzy przeciwko utracie pamięci i zanikowemu osłabieniu kości (Fu i in., 2018). Oprócz tradycyjnej skuteczności, liczne badania wykazały, że ma on różne działania farmakologiczne, takie jak łagodzenie deficytów poznawczych i behawioralnych (Wu i wsp., 2014), działanie przeciwzapalne (Fu i wsp., 2018), promowanie tworzenia kości i tłumienie kości resorpcji (Li et al., 2013; Li et al., 2012), a także aktywności antyoksydacyjnej (Zhang et al., 2016). Jednak złożoność jego aktywnych składników i proces metaboliczny spowodowały trudności zarówno w odkrywaniu celów w tkankach ludzkich, jak i wyjaśnianiu mechanizmu działania.
Przede wszystkim konieczne jest rzetelne omówienie celów terapeutycznych OP/AD. Szczególnie w oparciu o myśl o „takim samym leczeniu różnych chorób” w TCM i metodologiach „wieloskładnikowej terapii, sieci biologicznej” farmakologii sieciowej, próby poszukiwania istotnych wspólnych celów między obiema chorobami mogą mieć szczególnie praktyczne zastosowanie. znaczenie w dostarczaniu wskazówek dotyczących zapobiegania i kontroli OP i AD. Danio pręgowany ma silne podobieństwo w fizjologii szkieletu do ssaków i wysoce homologiczne geny do ludzi. Jest to dostępny i atrakcyjny model zwierzęcy in vivo do badań OP i AD (Bergen i in., 2019; Newman i in., 2014). Dlatego te badania w zakresie farmakologii sieciowej miały na celu zbadanie aktywnych składników CT o podwójnym działaniu, zbadanie wspólnych potencjalnych celów OP i AD, a także odkrycie możliwości zastosowania CT do jednoczesnego leczenia dwóch chorób. W tym badaniu, informacje docelowe dotyczące aktywnych składników CT, genomów i informacji proteomicznych OP i AD zostały zebrane odpowiednio z różnych baz danych w celu ustanowienia interaktywnej sieci, a analiza wzbogacenia została skonstruowana w celu odkrycia synergicznych mechanizmów CT w leczeniu OP i AD . Ponadto zainicjowaliśmy odpowiednio modele OP i AD danio pręgowanego i przechwyciliśmy kluczowe związki w sieci, aby zweryfikować ich skuteczność i cele dla dwóch chorób.
Cistanche pobudza wzrost sklerotyny.
2. Materiały i metody
2.1 Odczynniki
Wzorce chemiczne genisteiny (GE), kwercetyny (QU), kwasu abietynowego (AA), -sitosterolu (BSS) (czystość Większa lub równa 98 procent) zakupiono od Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Chiny). Płytki hodowlane otrzymano z Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, Chiny). Prednizolon (Pre), etydronian disodowy (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3·6H2O zakupiono od Aladdin Reagent Inc. Zestaw do testu immunoabsorpcji enzymatycznej (ELISA) z acetylotransferazą (ChAT) został dostarczony przez Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Szanghaj, Chiny). Trizol został uzyskany z Nanjing KeyGen Biotech. Co., Ltd. (Nankin, Chiny). Transtar Top Green qPCR SuperMix został zakupiony od TransGen Biotech. Co., Ltd. (Pekin, Chiny).
ekstrakt z cistanche
2.2 Zwierzęta
Dorosły danio pręgowany (szczep AB, w wieku 4 miesięcy) utrzymywano w temperaturze 28 stopni w cyklu światło/ciemność 14/10 godzin w akwarium zasilanym wodą słodką. Trzymano je dwa razy dziennie na świeżo wyklutej diecie z krewetek solankowych (Chen i wsp., 2018). Normalnie zapłodnione zarodki wyselekcjonowano i hodowano do 3 dni po zapłodnieniu (dpf) w lekkim inkubatorze wzrostu. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach były zgodne z wytycznymi instytucji i rządu dotyczącymi doświadczeń na zwierzętach.
2.3 Sieciowy proces farmakologiczny
2.3.1 Obliczanie przestrzeni chemicznej i badanie przesiewowe związków kandydujących
Wszystkie dane dotyczące składników chemicznych w tomografii komputerowej zostały zebrane z platformy bazy danych i analizy farmakologicznej tradycyjnej medycyny chińskiej. TCMSP to platforma farmakologii systemowej chińskich leków ziołowych, która wychwytuje relacje między lekami, celami i chorobami (Ru i in., 2014). W międzyczasie uzyskano cztery podstawowe parametry związane z farmakologią w TCMSP do analizy głównych składników (PCA), w tym masę cząsteczkową (MW), współczynnik podziału między oktanolem i wodą (AlogP), liczbę donatorów wodoru (Hdon) i liczbę akceptorów wodoru ( Hacc). Dystrybucja chemiczna CT została zbudowana z powyższymi parametrami za pomocą oprogramowania SIMCA (wersja 14.1, Umetrics). W tym samym toku były przetwarzane leki drobnocząsteczkowe zatwierdzone dla AD/OP przez DrugBank. Składniki z CT przefiltrowano według podobieństwa do leków (DL). DL jest pojęciem jakościowym stosowanym w projektowaniu leków do oszacowania, jak „lekopodobny” jest potencjalny związek. Ta istotna właściwość jest wykorzystywana jako kryterium wyboru związków „lekopodobnych” w tradycyjnych chińskich ziołach i pomaga zoptymalizować właściwości farmakokinetyczne i farmaceutyczne (Tao i in., 2013). Na podstawie sugestii z literatury i TCMSP wybraliśmy DL większe lub równe 0.18 jako warunki filtrowania. Składniki odpowiadające warunkom wywieziono do dalszej analizy. Ich 2-wymiarowe (2D) i 3D struktury zostały namalowane przez oprogramowanie ChemDraw Professional 16.0. Struktury 3D zostały zoptymalizowane dzięki funkcji minimalizacji energii w Chem3D 16.0.
2.3.2 Zbieranie celów powiązanych z OP i AD
Wszystkie asocjacje genów dla OP i AD zostały niezależnie zebrane z DisGeNET i GeneCards. Baza danych DisGeNET jest jedną z największych publicznie dostępnych platform do odkrywania genów i wariantów związanych z chorobami człowieka (Pinero i in., 2017). GeneCards to zintegrowana baza danych ludzkich genów, która zawiera informacje genomowe, transkryptomiczne, proteomiczne, genetyczne, kliniczne i funkcjonalne (Safran i wsp., 2010).
2.3.3 Zbieranie celów złożonych i przewidywanie odwrotnego dokowania
Bazę danych GeneCards i szwajcarską bazę danych TargetPrediction połączono, aby przewidzieć odpowiednie cele aktywnych składników w tomografii komputerowej. GeneCards wskazuje znane aktywne cele związków, podczas gdy szwajcarska baza danych TargetPrediction może oszacować najbardziej prawdopodobne cele makromolekularne małych cząsteczek (Daina i in., 2019). Przed przewidywaniem struktury cząsteczek kandydujących zostały przekonwertowane z formatu mol2 na format SMILES przy użyciu Open Babel (wersja 2.4.1).
2.3.4 Analiza interakcji białko-białko
Baza danych STRING została wykorzystana do odkrycia interakcji między grupą wspólnych celów CT-OP-AD. Po przeszukaniu według wzoru „Homo sapiens”, sieć interakcji białko-białko (PPI) została zwizualizowana za pomocą oprogramowania Cytoscape (wersja 3.7.2). STRING to baza danych znanych i przewidywanych PPI, pochodzących z przewidywań kontekstu genomowego, wysokowydajnych eksperymentów laboratoryjnych, (zachowanej) koekspresji, zautomatyzowanej eksploracji tekstu i wcześniejszej wiedzy w bazach danych (Szklarczyk i in., 2017).
Cistanche jest dobry na chorobę Alzheimera.
2.3.5 Analiza wzbogacania ścieżki GO i KEGG
Analizę wzbogacenia Gene Ontology (GO) przeprowadzono w oprogramowaniu Funrich. FunRich (wersja 3.1.3) to funkcjonalne oprogramowanie używane głównie do analizy wzbogacania genów i białek (Pathan i wsp., 2015). Do przeprowadzenia analizy wzbogacania szlaku wykorzystano bazę danych ConsensusPathDB-human. Otrzymana lista genów została przesłana do bazy danych z ustawieniem „p-value cutoff” na 0,01. Po uzyskaniu wyników wyselekcjonowano tylko te szlaki związane z OP i/lub AD i podzielono na grupy według kategorii funkcji KEGG. CPDB to bezproblemowa sieć interakcji zawierająca binarne i złożone interakcje białko-białko, genetyczne, metaboliczne, sygnalizacyjne, regulujące geny i interakcje lek-cel, a także szlaki biochemiczne u Homo sapiens (Kamburov i in., 2013).
2.4 Procedury eksperymentalne dla modelu OP Danio pręgowany
2.4.1 Grupowanie modeli
Larwy danio pręgowanego podzielono na kilka grup: grupę kontrolną, grupę modelową, grupę model plus Ed, grupę model plus związki, z których każda zawierała 30 larwy. Grupę kontrolną utrzymywano w pożywce z 0,2% DMSO. Grupę modelową leczono Pre (25 µM) od 3 dpf do 8 dpf. Model plus grupa Ed była jednocześnie traktowana Pre i Ed (30 µg/ml).
2.4.2 Barwienie czerwone alizaryny
Po 5 dniach hodowli z różnymi związkami larwy kolejno znieczulano, utrwalano i wybielano. Czerwień alizarynowa została użyta do barwienia kości głowy danio pręgowanego. W celu usunięcia nadmiaru zastosowano odpowiednio 1% KOH i glicerol (w proporcjach 3:1, 1:1 i 1:3). Na koniec zastosowano stereomikroskop (Olympus SZX16) do uchwycenia obrazów barwienia danio pręgowanego w pozycji leżącej. Powierzchnia barwienia i zintegrowana gęstość optyczna (IOD) zostały obliczone przez Image-Pro Plus 6. 0.
2.4.3 Określanie aktywności ALP i TRAP
Larwy danio pręgowanego przy 3 dpf przeszczepiano na płytkach z 6-studzienkami i inkubowano z Pre w obecności lub przy braku związków przez 5 dni. Następnie zebrano je do pomiaru aktywności ALP. Aktywność ALP określono przy użyciu zestawu danio pręgowanego ALP ELISA w oparciu o protokół producenta. Metoda oceny aktywności TRAP była taka sama jak ALP.
2.5 Procedury eksperymentalne dla modelu AD Zebrafish
2.5.1 Grupowanie modeli
Larwy danio pręgowanego podzielono na kilka grup: grupa kontrolna, grupa modelowa, grupa modelowa plus grupa DPZ, grupa modelowa plus związki, z których każda zawierała 30 larwy. Grupę kontrolną utrzymywano w pożywce z 0,2% DMSO. Grupę modelową potraktowano AlCl3 (150 µM, pH 5,8) od 3 dpf do 6 dpf. Model plus grupa DPZ była jednocześnie traktowana AlCl3 i DPZ (8 µM).
2.5.2 Analiza behawioralna
Po 3 dniach dostarczania leków ruch larw został zarejestrowany przez analizator behawioralny ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). Wszystkie eksperymenty zakończono w 60 min w 28°C, zawierające 3 cykle fazy światło/ciemność (10 min każdy dla światła i ciemności). Zgodnie z metodami z poprzedniego raportu, średnia prędkość (AS), zmiana prędkości (∆S), wskaźnik powrotu dyskinezy (DRR, równanie a) i skuteczność odpowiedzi (RE, równanie b) są wybierane jako skuteczność leku przeciw AD wskaźnik oceny w tym modelu (Pan i in., 2019; Wenhai i in., 2016).
AS (mm/s)=D / T, DRR ( procent )=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
gdzie D to odległość przemieszczania się danio pręgowanego przez 60 min, T to czas eksperymentu.
RE ( procent )=100 × (∆Drug - ∆SModel) / (∆SControl - ∆SModel), b
gdzie ∆S jest zmianą prędkości danio pręgowanego w cyklach światło/ciemność.
2.5.3 Pomiar aktywności AChE i ChAT
Larwy danio pręgowanego w 3 dpf hodowano na płytkach ze studzienkami 6- i inkubowano z AlCl3 w obecności lub przy braku związków przez 3 dni. Następnie zostały zebrane na działalność AChE. Aktywność AChE wykrywano przy użyciu zestawu AChE ELISA danio pręgowanego w oparciu o protokół producenta. Metoda oceny aktywności ChAT była taka sama jak AChE.
2.6 Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym
Larwy danio pręgowanego podzielono na grupy OP i AD. Grupy OP składały się z grupy kontrolnej, grupy Pre i grup związków Pre plus, hodowanych od 3 dpf do 8 dpf. Grupy AD obejmowały grupę kontrolną, grupę AlCl3 i grupy AlCl3 plus związki, hodowane od 3 dpf do 5 dpf. Każda grupa zawierała 30 larw. Całkowity RNA został odpowiednio wyekstrahowany z tych próbek larw danio pręgowanego przez Trizol. Próbki RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA zgodnie z instrukcją producenta zestawu cDNA. Poziom ekspresji mRNA wykrywano metodą ilościowej fluorescencyjnej PCR w czasie rzeczywistym (Roche LightCycler96). Wyniki znormalizowano do ekspresji β-aktyny i oznaczono ilościowo metodą porównawczą (2-∆∆Ct). Zastosowane startery przedni i wsteczny zostały zsyntetyzowane przez Sangon Biotech (Szanghaj, Chiny) i wymienione w Tabeli Uzupełniającej S1.
proszek cistanche i Tongkat alipomaga poprawić odporność.
Aby uzyskać więcej informacji, kliknij tutaj.
2.7 Analiza statystyczna
Do opisowych analiz statystycznych wykorzystano GraphPad Prism w wersji 8.00. Dane wyrażono jako średnią ± SD i przeanalizowano metodą ANOVA w celu zbadania zmienności między każdym badaniem, uznając P mniejsze lub równe 00,05 za istotne.
