Część 1: Wypływ magnezu z komórek Drosophila Kenyon ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej i wspomaganej dietą pamięci długoterminowej

więcej informacji:Ali.ma@wecistanche.com

Pls kliknij tutaj, aby przejść do części 2!

Yanying Wu1, Yosuke Funato2, Eleonora Meschi1, Kristijan D Jovanoski1, Hiroaki Miki2, Scott Waddell1*

1Centre for Neural Circuits and Behaviour, The University of Oxford, Tinsley Building, Oxford, Wielka Brytania; 2 Zakład Regulacji Komórkowej, Instytut Badawczy Chorób Mikrobiologicznych, Uniwersytet Osaka, Suita, Japonia

Streszczenie Suplementacja diety magnezem (Mg2 plus) może poprawićpamięću młodych i starszych szczurów.Pamięć-zwiększenie zdolności przypisywano w dużej mierze wzrostowi gęstości synaptycznej hipokampa i podwyższonej ekspresji podjednostki NR2B receptora glutaminianu typu NMDA. Tutaj pokazujemy, że karmienie Mg2 plus poprawia również długoterminowopamięćw Drosophila. Normal i Mg2 plus - wzmocniona muchapamięćwydaje się być niezależny od receptorów NMDA w ciele grzyba i zamiast tego wymaga ekspresji konserwatywnego transportera Mg2 plus -wypływowego typu CNNM, kodowanego przez gen nierozszerzony (uex). UEX zawiera domniemaną domenę homologii cyklicznej wiązania nukleotydów, a jej mutacja oddziela kluczową rolę dla uex od funkcji wpamięć. Co więcej, lokalizacja UEX w komórkach Kenyona (KC) grzyba jest zmieniona w:pamięć-wadliwe muchy niosące mutacje w genach związanych z cAMP. Obrazowanie funkcjonalne sugeruje, że zależny od UEX wypływ jest wymagany do powolnego utrzymywania rytmu KC Mg2 plus. Proponujemy, że regulowany neuronalny wypływ Mg2 plus jest krytyczny dla normalnego, a Mg2 plus -wzmocnionypamięć.

Kliknij, abySklep z witaminami Cistanche i Cistanche dla pamięci

Wstęp

Magnez (Mg2 plus ) odgrywa kluczową rolę w metabolizmie komórkowym i jest uważany za niezbędny kofaktor dla ponad 350 enzymów (Romani i Scarpa, 2000; Vink i Nechifor, 2011). W rezultacie zmiany homeostazy Mg2 plus są związane z szerokim zakresem stanów klinicznych, w tym tych wpływających na układ nerwowy, takich jak jaskra (DeToma i in., 2014), choroba Parkinsona (Hermosura i in., 2005; Hermosura i in. Garruto, 2007; Lin i in., 2014; Shindo i in., 2016), choroba Alzheimera (Andra´si i in., 2000; Andra´si i in., 2005; Cilliler i in., 2007; Durlach i in. ., 1997; Glick, 1990; Lemke, 1995; Chui i in., 2011; Vural i in., 2010), lęk (Sartori i in., 2012), depresja (Whittle i in., 2011; Murck, 2002; Murck, 2013; Rasmussen i in., 1990; Ghafari i in., 2015) oraz niepełnosprawność intelektualna (Arjona i in., 2014).

Być może zaskakujące, że zwiększenie Mg2 plus w mózgu poprzez dietę może zwiększyć plastyczność neuronów ipamięćwydajność młodych i starszych gryzoni, mierzona różnymi zadaniami behawioralnymi (Slutsky i in., 2010; Landfield i Morgan, 1984; Mickley i in., 2013; Abumaria i in., 2013). Ponadto podwyższony poziom Mg2 oraz zmniejszone deficyty poznawcze w mysim modelu choroby Alzheimera (Li et al., 2013) i wzmocniły wygasanie wspomnień związanych ze strachem (Abumaria et al., 2011). Te pozornie korzystne efekty doprowadziły do ​​wniosku, że dietetyczny Mg2 plus może mieć wartość terapeutyczną dla pacjentów z różnymipamięćzwiązane z problemami (Billard, 2011).

Pomimo dużej liczby potencjalnych miejsc działania Mg2 plus w mózgu,pamięćWzmacnianie właściwości u gryzoni w dużej mierze przypisuje się zwiększeniu gęstości synaptycznej hipokampa i aktywności receptorów glutaminianu N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR). Pozakomórkowy Mg2 plus blokuje kanał kanału NMDAR i tym samym hamuje przechodzenie innych jonów (Mayer i wsp., 1984; digest Przysłowiowe powiedzenie „jesteś tym, co jesz” doskonale podsumowuje koncepcję, że nasza dieta może wpływać zarówno na nasz umysł, jak i zdrowie fizyczne.Wiemy, że pokarmy, które są dobre dla serca, takie jak orzechy, tłuste ryby i jagody, są również dobre dla mózgu.Wiemy też, że witaminy i minerały są niezbędne dla ogólnego dobrego stanu zdrowia.Ale czy są jakieś dowody że zwiększenie spożycia określonych witamin lub minerałów może pomóc zwiększyć siłę mózgu?

Chociaż może to brzmieć zbyt pięknie, aby mogło być prawdziwe, istnieją pewne dowody na to, że tak jest w przypadku co najmniej jednego minerału, magnezu. Badania na gryzoniach wykazały, że dodawanie suplementów magnezu do żywności poprawia wydajność pamięci. Zarówno młode, jak i stare zwierzęta korzystają z dodatkowego magnezu. Nawet starsze gryzonie ze stanem podobnym do choroby Alzheimera wykazują mniejpamięćutrata przy podawaniu suplementów magnezowych. Ale co z innymi gatunkami?

Wu i in. teraz pokazują, że suplementy magnezu poprawiają również wydajność pamięci u muszek owocówek. Jedna grupa much była przez kilka dni karmiona standardową mąką kukurydzianą, natomiast druga grupa otrzymywała mąkę kukurydzianą z dodatkiem magnezu. Obie grupy zostały następnie przeszkolone w kojarzeniu zapachu z nagrodą w postaci jedzenia. Muchy, które otrzymały dodatkowy magnez, wykazywały się lepiejpamięćna zapach testowany 24 godziny po treningu.

Wu i in. pokazać, że magnez się poprawiapamięću much za pomocą innego mechanizmu niż ten, o którym wspomniano wcześniej dla gryzoni. U gryzoni magnez zwiększał poziom białka receptorowego dla substancji chemicznej mózgu zwanej glutaminianem. Natomiast u muszek owocówekpamięćdoładowanie zależało od białka, które transportuje magnez z neuronów. Zmutowane muchy, którym brakowało tego transportera, wykazywały zaburzenia pamięci. W przeciwieństwie do zwykłych much, te bez transportera nie wykazywały poprawy pamięci po zjedzeniu pokarmu wzbogaconego magnezem. Wyniki sugerują, że transporter może pomóc w dostosowaniu poziomu magnezu w komórkach mózgowych w odpowiedzi na aktywność nerwową.

Ludzie wytwarzają cztery warianty tego transportera magnezu, z których każdy jest kodowany przez inny gen. Jeden z tych transporterów był już zaangażowany w rozwój mózgu. Ustalenia Wu i in. sugerują, że transportery mogą również działać w mózgu osoby dorosłej, wpływając na funkcje poznawcze. Potrzebne są dalsze badania, aby sprawdzić, czy celowanie w transporter magnezu może ostatecznie przynieść nadzieję na leczeniepamięćupośledzenia.

Bekkers i Stevens, 1993; Jahr i Stevens, 1990; Nowak i wsp., 1984). Co ważne, uprzednia depolaryzacja neuronów, napędzana przez inne receptory przekaźnikowe, jest wymagana do uwolnienia bloku Mg2 plus na NMDAR i umożliwienia napływu Ca2 plus bramkowanego glutaminianem. Dlatego NMDAR odgrywa ważną rolę w plastyczności neuronalnej jako potencjalny hebbowski detektor koincydencji. Ostre podwyższenie stężenia zewnątrzkomórkowego Mg2 plus ([Mg2 plus ]e) w zakresie fizjologicznym (0,8–1,2 mM) może antagonizować indukcję długotrwałego wzmocnienia zależnego od NMDAR (Dunwiddie i Lynch, 1979; Malenka i wsp., 1992; Malenka i Nicoll, 1993; Slutsky i wsp., 2004). W przeciwieństwie do tego, zwiększenie [Mg2 plus]e przez kilka godzin w hodowlach neuronalnych prowadzi do wzmocnienia prądów, w których pośredniczy NMDAR i ułatwienia ekspresji LTP (Slutsky i wsp., 2004). Wzmacniające działanie zwiększonego [Mg2 plus ]e zaobserwowano również in vivo w mózgu szczurów karmionych Mg2 plus -L-treonanem (Slutsky i wsp., 2010). Obwody neuronalne hipokampa ulegają homeostatycznej plastyczności (Turrigiano, 2008), aby dostosować się do zwiększonego [Mg2 plus]e poprzez zwiększenie ekspresji NMDAR zawierających podjednostki NR2B (Slutsky i wsp., 2004; Slutsky i wsp., 2010). Uważa się, że wyższa gęstość synaps hipokampa z NMDAR-ami zawierającymi NR2B kompensuje przewlekły wzrost [Mg2 plus]e poprzez wzmacnianie prądów NMDAR podczas strzelania seryjnego. Na poparcie tego modelu myszy, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu nadekspresji NR2B, wykazują zwiększone hipokampowe LTP i behawioralnepamięć(Tang i in., 1999).

Węchowypamięću Drosophila obejmuje mechanizm heterosynaptyczny napędzany przez wzmacnianie neuronów dopaminergicznych, co powoduje presynaptyczną depresję połączeń cholinergicznych między komórkami Kenyona aktywowanymi zapachem (MB) a dalszymi neuronami wyjściowymi ciała grzyba (MBON) (Schwaerzel et al., 2003 ; Aso i wsp., 2010; Aso i wsp., 2012; Claridge-Chang i wsp., 2009; Burke i wsp., 2012; Liu i wsp., 2012; Plac¸ais i wsp., 2013; Owald i wsp. ., 2015; Hige i wsp., 2015; Barnstedt i wsp., 2016; Parisse i wsp., 2016; Aso i wsp., 2014; Oswald i Waddell, 2015). Ponadto informacja węchowa jest przekazywana do KC przez transmisję cholinergiczną z neuronów projekcyjnych węchowych (Yasuyama i wsp., 2002; Leiss i wsp., 2009). Chociaż można sobie wyobrazić, że glutaminian jest dostarczany do sieci MB szlakiem, który nie został jeszcze zidentyfikowany, obecnie nie ma oczywistej lokalizacji dla plastyczności zależnej od NMDAR w znanej architekturze cholinergicznych warstw wejściowych lub wyjściowych (Barnstedt et al., 2016 ). Mucha stanowi zatem potencjalny model do badania innych mechanizmów, dzięki którym dieta Mg2 plus może wzmocnićpamięć.

Wzmacniające działanie dopaminy zależy od receptora dopaminy typu Dop1R D1- (Kim i wsp., 2007; Qin i wsp., 2012; Handler i wsp., 2019), który jest pozytywnie sprzężony z produkcją cAMP (Tomchik i Davis, 2009; Boto i in., 2014). Co więcej, wczesne badania na Drosophila wykazały, że odpowiednio fosfodiesteraza cAMP kodowana przez oślę i brukwię oraz stymulowaną cyklazę adenylanową typu I Ca2 są niezbędne dla węchu.pamięć(Dudai i in., 1976; Byers i in., 1981; Dudai i Zvi, 1984; Chen i in., 1986; Livingstone i in., 1984; Levin i in., 1992). Badania na komórkach ssaków wykazały, że hormony lub środki zwiększające komórkowy poziom cAMP często wywołują znaczące, zależne od Na plus, wytłaczanie Mg2 plus do przestrzeni zewnątrzkomórkowej (Romani i Scarpa, 1990b; Romani i Scarpa, 1990a; Romani i Scarpa, 2000; Vink i Nechifor, 2011; Vormann i Gu¨nther, 1987). Jednak nie jest jasne, czy wytłaczanie Mg2 plus odgrywa jakąkolwiek rolę w przetwarzaniu w pamięci.

Tutaj pokazujemy, że Drosophila długoterminowapamięć(LTM) można wzmocnić suplementacją Mg2 w diecie. Odkryliśmy, że gen nierozszerzony (uex) (Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010), który koduje funkcjonalny ortolog muchy ssaczych białek transportera cykliny M2 Mg2 plus -wypływ (CNNM), ma kluczowe znaczenie dlapamięć-wzmacniające właściwości Mg2 plus . Funkcja UEX w MB KC jest wymagana do LTM, a funkcjonalne przywrócenie interfejsu UEX ujawnia, że ​​MB jest kluczowym miejscem wzmocnienia pamięci zależnego od Mg2 plus. Przewlekła zmiana metabolizmu cAMP poprzez wprowadzenie mutacji w genach dnc lub rut zmienia komórkową lokalizację UEX. Co więcej, zmutowanie konserwatywnej domeny cyklicznej homologii wiązania nukleotydów (CNBH) w UEX odłącza istotną rolę uex od jego funkcji w pamięci. Napędzany UEX wypływ Mg2 plus jest wymagany do powolnego rytmicznego utrzymywania poziomów KC Mg2 plus, co sugeruje potencjalną rolę przetwarzania Mg2 plus wypływ w pamięci.

Wyniki

Karmienie Mg2 plus zwiększa LTM dzikich much

Wcześniejsze badania wykazały, że karmienie szczurów pokarmem zawierającym wysokie stężenie Mg2 plus zwiększało ich zdolność uczenia się i zapamiętywania (Slutsky i in., 2010; Landfield i Morgan, 1984; Abumaria i in., 2011; Mickley i in., 2013; Abumaria i in., 2013). Dlatego testowaliśmy, czy podobne efekty występują u much, karmiąc je pokarmem zawierającym wysokie stężenie Mg2 plus przed treningiem. Co zaskakujące, muchy dzikie karmione przez 4 dni przed treningiem pokarmem uzupełnionym dodatkowym chlorkiem magnezu (MgCl2) wykazywały znacznie lepszą wydajność pamięci w ciągu 24 godzin. Wzmocnienie pamięci zależy od koncentracji i było maksymalne, gdy pokarm był uzupełniany 80 mM MgCl2 (ryc. 1A). Wydajność pamięci natychmiastowej nie uległa oczywiście poprawie (rysunek 1B). Wzmacniające działanie MgCl2 zaobserwowano również u much karmionych siarczanem magnezu (MgSO4), ale nie chlorkiem wapnia (CaCl2) (Figura 1C). Ponadto karmienie much przez 4 dni pokarmem zawierającym od 5 do 80 mM chlorku strontu (SrCl2) powodowało wysoki poziom śmiertelności, a muchy, które przeżyły karmienie 5 mM SrCl2 nie wykazywały zwiększonej wydajności pamięci natychmiastowej lub 24-godzinnej (dane nie pokazane). . Efekty poprawiające pamięć można zatem w szczególności przypisać suplementacji diety dwuwartościowym Mg2 plus.

Mg2 plus – zwiększona pamięć jest niezależna od NMDAR w ciałach grzybów

Ponieważ zwiększona pamięć L-treonianu magnezu u szczurów była skorelowana z regulacją w górę hipokampa NMDAR zawierających podjednostkę NR2B (Slutsky et al., 2010), zbadaliśmy zmiany w ekspresji receptora glutaminianu u much karmionych MgCl2. Analizy RT-qPCR nie wykazały istotnej różnicy w obfitości mRNA dla przypuszczalnych receptorów NMDA (Nmdar1, Nmdar2), AMPA (GluRIA) lub typu kainowego (GluRIIA) w głowach pobranych od much karmionych przez 4 dni 80 mM MgCl2 w porównaniu z karmionymi 1 mM MgCl2 (Figura 1D).

Następnie zbadaliśmy bezpośrednio, czy pamięć wzmocniona Mg2 plus wymaga funkcji NMDAR, poprzez obniżenie ekspresji genów Nmdar1 lub Nmdar2 przy użyciu transgenicznej interferencji RNA sterowanej przez UAS

Rysunek 1. Dietetyczna suplementacja Mg2 plus poprawia pamięć długotrwałą Drosophila. (A) Muchy typu dzikiego były trenowane i testowane pod kątem 24 godzinnej pamięci apetytywnej po 1–5 dniach karmienia ad libitum pokarmem uzupełnionym Mg2 plus. Pamięć była istotnie poprawiona u much karmionych przez 4 dni 80 mM MgCl2 w porównaniu z tymi karmionymi 1 mM. 80 mM MgCl2 zapewniało nieznacznie wyższą wydajność niż 50 mM lub 100 mM i dlatego zostało uznane za optymalne (gwiazdki oznaczają p<0.05, t-test="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" groups="" for="" each="" time="" point,="" n="6–8)." (b)="" 4="" days="" of="" 80="" mm="" mgcl2="" food="" did="" not="" enhance="" immediate="" memory.="" (c)="" appetitive="" 24="" hr="" memory="" was="" enhanced="" by="" feeding="" wild-type="" flies="" for="" 4="" days="" with="" mgcl2="" and="" mgso4,="" but="" not="" cacl2.="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05, anova,="" n="6)" between="" mg2+="" fed="" and="" plain="" groups.="" (d)="" rt-qpcr="" showed="" no="" significant="" differences="" in="" glutamate="" receptor="" mrna="" expression="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" fed="" flies="" (t-test,="" n="5)." (e)="" c739-gal4;="" uas-magfret-1="" flies="" were="" fed="" for="" 4="" days="" on="" food="" supplemented="" with="" mg2+.="" brains="" were="" dissected="" and="" fixed="" and="" a="" fluorescence="" emission="" ratio="" measurement="" (citrine/cerulean)="" was="" taken="" as="" an="" indicator="" of="" [mg2+]i.="" the="" magfret="" signal="" was="" significantly="" greater="" in="" the="" ab="" lobes="" of="" flies="" fed="" with="" 80="" mm="" mgcl2="" than="" those="" fed="" with="" 1="" mm="" mgcl2=""><0.05, t-test,="" n="52–60)." unless="" otherwise="" noted,="" all="" data="" are="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" the="" mean="" (sem).="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05), individual="" data="" points="" displayed="" as="" open="">

Wersja online tego artykułu zawiera następujące dodatki do rysunku 1:

Suplement do ryciny 1. Uderzenie receptora glutaminianu N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR) w ciałach grzybów nie osłabia pamięci wzmocnionej Mg2 plus.

konstrukty (RNAi) (Dietzl i wsp., 2007; Perkins i wsp., 2015). Z dwóch niezależnych testowanych przez nas linii UAS-Nmdar1R-NAi i czterech UAS-Nmdar2RNAi, tylko jedna linia Nmdar1RNAi (BDSC 25941), kierowana do wszystkich neuronów przez neuronalną synaptobrewinę (nSyb)-GAL4, wykazywała znacząco obniżoną wydajność pamięci w ciągu 24 godzin, ponieważ w porównaniu z heterozygotycznymi muszkami kontrolnymi (ryc. 1 – dodatek do ryciny 1A). W przeciwieństwie do tego, bardziej selektywna ekspresja tego UAS-Nmdar1RNAi w odpowiednich dla LTM ab KC przy użyciu c739-GAL4 nie pogorszyła znacząco wydajności pamięci w ciągu 24 godzin (Figura 1 – dodatek do figury 1B). Co więcej, muchy eksprymujące Nmdar1RNAi w neuronach ab zachowały silną pamięć wzmocnioną Mg2 plus (ryc. 1 – dodatek do ryciny 1C). Wyniki te sugerują, że pamięć wzmocniona Mg2 plus nie zmienia ekspresji receptorów glutaminianu ani nie wymaga funkcji NMDAR w ab KC.

Stężenie Mg2 plus w neuronach ab jest podwyższone u much karmionych wysokim poziomem Mg2 plus Użyliśmy MagFRET, pierwszego genetycznie kodowanego fluorescencyjnego czujnika Mg2 plus (Lindenburg i wsp., 2013), aby sprawdzić, czy karmienie Mg2 plus zmieniło wewnątrzkomórkowe stężenie Mg2 plus ([Mg2 plus ]i). Skonstruowaliśmy muchy niosące transgen UAS-MagFRET-1 i połączyliśmy go z c739-GAL4 w celu ekspresji MagFRET- 1 w ab KC. Porównaliśmy sygnały FRET w stałych mózgach z c739; Muchy UAS-MagFRET-1 karmione karmą 1 mM lub 80 mM MgCl2 przez 4 dni. Sygnał MagFRET był znacznie wyższy w obu obocznych ab KCs ab much karmionych 80 mM, niż u tych karmionych 1 mM (Figura 1E). Wynik ten wskazuje, że karmienie Mg podnosi poziom neuronów [Mg2 plus]i. Biorąc pod uwagę powinowactwo MagFRET-1 (Kd=148 mM) i ~50-procentowy wzrost sygnału FRET po wiązaniu Mg2 plus (Lindenburg et al., 2013), szacujemy, że ~8-procentowe wzmocnienie sygnał MagFRET mierzony u much karmionych 80 mM MgCl2 odpowiada średnio około 50 mM wzrostowi ab KC [Mg2 plus]i.

Nierozszerzony zakodowany transporter Mg2 plus typu CNNM odgrywa rolę w pamięci

Zidentyfikowaliśmy nierozszerzony (uex; Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010) jako zmieniający geny apetytywny węchowy LTM, wzmocniony nagrodą sacharozową. Muchy z wstawką uexMI01943 MiMIC (Venken et al., 2011) wykazywały silny defekt pamięci dobowej, ale ich wydajność bezpośrednio po treningu była nie do odróżnienia od kontroli typu dzikiego. Bardziej szczegółowa analiza much uexMI01943 ujawniła stały zanik pamięci, który po raz pierwszy znacząco różnił się od much typu dzikiego 12 godzin po treningu (Figura 2A). U heterozygotycznych much uexMI01943/plus nie stwierdzono wady pamięci, co dowodzi, że ten domniemany allel płciowy jest recesywny.

uex zwrócił naszą uwagę, ponieważ jest to ortolog pojedynczej muchy z czterech ludzkich genów CNNM, które kodują transportery Mg2 plus (Ishii et al., 2016), a także zawiera domniemaną domenę CNBH, która jest strukturalnie powiązana z domenami w bramkach cyklicznych kanały (Zagotta i in., 2003; Flynn i in., 2007; Kesters i in., 2015). Dopasowanie 834 aminokwasowej sekwencji UEX z CNNM1-4 ujawnia szczególnie wysoką konserwację sekwencji z CNNM2 i CNNM4 w domenach DUF21, CBS i CNBH (Figura 2 – dodatek do figury 1A-C). Postawiliśmy zatem hipotezę, że UEX może potencjalnie łączyć wzmacniające pamięć działanie dietetycznego Mg2 plus z plastycznością neuronów zależną od cAMP.

Although uexMI01943 is assigned to the uex gene, the MiMIC element is annotated to lie 17 kb downstream of the uex coding region (Venken et al., 2011; Figure 2B). RYa (Yoon et al., 2016) is the next nearest gene to uexMI01943 but is >230 kb dalej. Po raz pierwszy potwierdziliśmy lokalizację MiMIC za pomocą odwróconej PCR (Attrill i wsp., 2016). Co ważne, u tych much nie wykryto dodatkowej insercji MiMIC. Następnie zbadaliśmy, czy uexMI01943 był odpowiedzialny za defekt pamięci, precyzyjnie usuwając element MiMIC przez wycięcie za pośrednictwem transpozazy Minosa (Arca` i in., 1997; Ryc. 2 – dodatek do ryciny 2A i B). Usunięcie MiMIC w muchach uexMI01943.ex1 i uexMI01943.ex2 przywróciło normalną 24-godzinną wydajność pamięci, co pokazuje, że wstawienie MiMIC jest wymagane dla uexMI01943pamięćwada (rysunek 2C).

Zarówno analiza qRT-PCR mRNA, jak i analiza Western blot ekstraktów białkowych z głów muchówek nie wykazały istotnej różnicy w ekspresji uex/UEX u muszek uexMI01943. Dlatego zastosowaliśmy CRISPR do wprowadzenia kodonu stop do piątego kodującego egzonu locus uex (ryc. 2B i ryc. 2 — dodatek do ryc. 2C). Muchy homozygotyczne pod względem powstałej mutacji uexD nie były zdolne do życia jako osobniki dorosłe, umierając w stadium larwalnym. W przeciwieństwie do tego, heterozygotyczne muchy uexMI01943/uexD były żywotne, ale ich 24-godzinne apetytypamięćbył znacząco upośledzony (ryc. 2D). Dane te pokazują, że uex jest niezbędnym genem i że uexMI01943 jest żywotnym hipomorficznym allelem uex.

Przetestowaliśmy również awersjępamięćwydajność zmutowanych much uexMI01943. Homozygotyczne muchy uexMI01943 wykazały natychmiastowepamięćbyło to nie do odróżnienia od kontroli heterozygotycznych i typu dzikiego (Figura 2E). Jednak ich pamięć dobowa, ukształtowana po pięciu próbach treningu awersyjnego (Tully et al., 1994; Jacob i Waddell, 2020) lub jednej próbie treningu wspomaganego na czczo (Hirano et al., 2013), uległa znacznemu pogorszeniu (Rysunek 2E). Eksperymenty te sugerują, że muchy uexMI01943 mają bardziej ogólnie upośledzoną zdolność do tworzenia LTM. O ile nie określono inaczej, wszystkie kolejne analizypamięćw tym badaniu stosuj pobudzanie apetytywne nagradzane cukrem.

Rysunek 2. Zmutowane muchy uexMI01943 mają wadę długoterminowąpamięć(LTM). (A) Zachowanie pamięci apetytywnej testowano w różnych momentach po treningu. Muchy homozygotyczne pod względem uexMI01943 wykazywały istotny defekt pamięci od 12 godzin po treningu w porównaniu z wydajnością heterozygotycznych much uexMI01943/plus i typu dzikiego (p<0.05, anova,="" n="6–10)." (b)="" the="" uex="" locus="" lies="" on="" chromosome="" 2r="" between="" 3,900,285="" and="" 3,949,425="" (light="" blue="" bar).="" the="" four="" alternate="" uex="" transcripts,="" uex-re,="" uex-rg,="" uex-rh,="" and="" uex-rf,="" all="" encode="" the="" same="" protein.="" the="" uexmi01943="" mimic="" (blue="" triangle)="" resides="" ~17="" kb="" downstream="" of="" the="" uex="" coding="" region.="" the="" crispr/cas9="" edited="" uexd="" allele="" replaces="" a="" 3047="" bp="" fragment,="" including="" exon="" 7="" of="" uex="" with="" a="" stop="" signal="" (termination="" codon="" in="" all="" three="" reading="" frames)="" and="" a="" gfp="" cassette,="" truncating="" the="" uex="" reading="" frame="" (dark="" blue="" bar).="" (c)="" precise="" excision="" of="" the="" uexmi01943="" mimic="" restores="" normal="" 24="" hr="" memory="" to="" uexmi01943.ex1="" and="" uexmi01943.ex2="" flies=""><0.05, anova,="" n="8–11)." (d)="" uexd="" fails="" to="" complement="" the="" 24="" hr="">pamięćwada uexMI01943 (p<0.05, anova,="" n="6–8)." (e)="" flies="" homozygous="" for="" uexmi01943="" showed="" a="" significant="" defect="" in="" aversive="" ltm,="" as="" figure="" 2="" continued="" on="">

Rysunek 2 ciąg dalszy

w porównaniu do wyników heterozygotycznych uexMI01943/plus i dzikich muszek kontrolnych (p<0.05, anova,="" n="8–12)." an="" ltm="" defect="" was="" also="" observed="" following="" five="" cycles="" of="" aversive="" spaced="" training="" and="" a="" 16="" hr="" fasting="" facilitated="" one-cycle="" training="" protocol.="" immediate="" aversive="">pamięćnie miało to wpływu na homozygotyczne zmutowane muchy uexMI01943.

Wersja online tego artykułu zawiera następujące dane źródłowe i uzupełnienia do rysunku 2:

Dane źródłowe 1. Tabela kontroli poziomu cukru i węchu dla wszystkich eksperymentów behawioralnych w tym manuskrypcie.

Dodatek do rysunku 1. Ochrona UEX wraz z jej ortologami.

Dodatek do rysunku 2. Schematy konstrukcyjne wycinania uex Mino i tworzenia allelu uexD.