Część 1: Werbaskozyd chroni komórki trzustki przed stresem ER

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Alessandra Galli 1 plus , Paola Marciani 1 plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 i Carla Perego 1,*

Abstrakcyjny:

Pokaźne dowody epidemiologiczne wskazują, że dieta bogata w polifenole chroni przed rozwojem cukrzycy typu 2. Glikozyd fenyloetanoidowywerbaskozyd/akteozyd, szeroko rozpowszechniony polifenolowy związek roślinny, ma kilka właściwości biologicznych, w tym silne działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i neuroprotekcyjne. Celem tych badań było przetestowanie możliwych skutkówwerbaskozydna komórkach trzustkowych, cel nigdy wcześniej nie testowany. Komórki myszy i człowieka inkubowano zwerbaskozyd(0,8–16 μM) przez okres do pięciu dni oraz kombinację technik biochemicznych i obrazowania, aby ocenić przeżycie i funkcjonowanie komórek b w warunkach normalnych lub indukujących stres retikulum endoplazmatycznego (ER). Znaleźliśmy zależne od dawki działanie ochronnewerbaskozydprzeciw stresowi oksydacyjnemu w komórkach klonalnych i ludzkich. Badania mechanistyczne wykazały, że polifenol chroni komórki β przed dysfunkcjami wywołanymi stresem ER, modulując aktywację kinazy białkowej podobnej do RNA gałęzi kinazy retikulum endoplazmatycznej (PERK) w odpowiedzi na rozwinięte białka i promując dynamikę mitochondriów. W rezultacie w tych komórkach wykryto zwiększoną żywotność, funkcję mitochondriów i zawartość insuliny. Badania te dostarczają dowodów, żewerbaskozydzwiększa zdolność komórek b do radzenia sobie ze stresem ER, ważnym czynnikiem dysfunkcji i niewydolności komórek b w stanach cukrzycowych oraz wspiera potencjał terapeutyczny werbaskozydu w cukrzycy.

Słowa kluczowe:

werbaskozyd; polifenole; komórki wytwarzające insulinę; cukrzyca; UPR; stres oksydacyjny; ER-stres; AKCYDENS; przeciwzapalne; mitochondria

1. Wstęp

Cukrzyca to przewlekła choroba dotykająca setki milionów ludzi [1]. Cukrzyca typu 1 (T1D) i typu 2 (T2D) charakteryzuje się odmienną etiologią, przy czym obie charakteryzują się brakiem insuliny [2]. Insulina reguluje stężenie glukozy w osoczu, stymulując wychwyt glukozy w komórkach mięśniowych i tłuszczowych oraz modulując metabolizm glukozy w wątrobie. Dostępność składników odżywczych, hormony i sygnały nerwowe regulują wydzielanie insuliny przez trzustkę i utrzymują stężenie glukozy we krwi w zakresie fizjologicznym [3–5]. Dlatego dysfunkcja komórek b prowadzi do cukrzycy charakteryzującej się hiperglikemią na czczo.

T2D jest stanem postępującym, w którym insulinooporność i nieprawidłowe funkcjonowanie komórek b są ze sobą powiązane, a najnowsze dowody wzmogły zainteresowanie kluczową rolą komórek b w stanie hiperglikemii [6, 7]. U osób otyłych bez cukrzycy komórki kompensują insulinooporność zwiększonym wydzielaniem hormonu. Jednak u niektórych osób, wraz z pogarszaniem się ich stanu, insulinemia spada, a poziom glukozy wzrasta do hiperglikemii [8,9].

Glukoza jest najważniejszym modulatorem funkcji komórek b. Stymulacja glukozy wpływa na regulację genów i ekspresję białek zaangażowanych w wiele funkcji komórkowych, takich jak glikoliza, synteza i sekrecja insuliny [10]. Wydzielanie insuliny indukowane glukozą opiera się na metabolizmie oksydacyjnym w celu wytworzenia trójfosforanu adenozyny (ATP), a fizjologicznie wytwarzany jest niski poziom reaktywnych form tlenu (ROS). Jednak komórki b nie są zbyt dobrze wyposażone w enzymy zmiatające i ta słabość czyni je bardzo podatnymi na stres oksydacyjny [11,12]. Wraz ze wzrostem stresu oksydacyjnego produkcja insuliny w komórkach spada, a komórki - wytwarzają cytokiny, które powodują uszkodzenie komórek poprzez stan zapalny i apoptozę [13]. Co ciekawe, chociaż zmniejszoną masę komórek b przypisywano wcześniej śmierci komórki, ostatnie badania sugerują ważną rolę odróżnicowania komórek [14,15]. Stało się jasne, że kilka etapów prowadzi do T2D. Zaburzenia metaboliczne i oksydacyjne powodują stres retikulum endoplazmatycznego (ER), który prowadzi do spadku syntezy i wydzielania insuliny, procesy zapalne następują po uwolnieniu cytokin, a utrata komórek b może nastąpić poprzez apoptozę i odferencjalizację. Wiedza ta ma fundamentalne znaczenie dla opracowania odpowiednich strategii leczenia, gdyż można przeciwdziałać stresowi oksydacyjnemu i stanom zapalnym, a plastyczność komórek trzustki pozwala na przekształcenie komórek macierzystych w komórki b, co udowodniono na myszach [16].

Ostatnio podatność komórek b na stres oksydacyjny z powodzeniem skłoniła do stosowania przeciwutleniaczy w diecie w celu zapobiegania cukrzycy [17]. Wśród najbardziej interesujących przeciwutleniaczy, oliwa z oliwek znana jest ze swoich dobroczynnych właściwości od czasów starożytnych Greków. Oliwa z oliwek zawiera dużą ilość jednonienasyconych kwasów tłuszczowych (MUFA) i kilka polifenoli, takich jak tyrozol, hydroksytyrozol, oleuropeina i werbaskozyd.

Werbaskozyd, znany również jako akteozyd, jest glikozydem fenyloetanoidowym wyekstrahowanym z Olea europea, roślin z gatunku Verbascum i 23 innych rodzin roślin [18–20]. Może być również otrzymywany z produktów ubocznych oliwy z oliwek (jest wzbogacany w ścieki z tłoczni oliwy pochodzące z przetwarzania owoców oliwnych) lub być wytwarzany przy użyciu metod inżynierii metabolicznej i biologii syntetycznej [21].

Jak dotąd nie zgłoszono żadnych danych dotyczących biodostępności werbaskozydu u ludzi. Badania przeprowadzone na myszach, komórkach SKBR3 i Caco-2 sugerują, że możliwe jest, aby niezmetabolizowany werbaskozyd przekraczał barierę jelitową, krążył w osoczu krwi i wywierał działanie antyoksydacyjne [20,22,23]. W przeciwieństwie do większości polifenoli roślinnych, werbaskozyd działa głównie na komórki poprzez modulację transkrypcji genów różnych enzymów i czynników regulatorowych, działając przeciwutleniająco i przeciwzapalnie [24–30].

Chociaż znanych jest wiele korzystnych skutków werbaskozydu na zdrowie człowieka, brak jest danych na temat jego wpływu na komórki trzustkowe. Ponieważ stres oksydacyjny i stan zapalny są podstawą patogenezy T2D, zbadaliśmy, czy leczenie werbaskozydem może poprawić żywotność komórek b i

funkcjonować w warunkach wywołujących stres ER i scharakteryzowaliśmy molekularne mechanizmy jego działania. Nasze dane pokazują, że werbaskozyd zapobiega stresowi oksydacyjnemu i zapaleniu komórek b, modulując aktywację odpowiedzi na rozwinięte białka i promując dynamikę mitochondriów, co skutkuje zwiększoną żywotnością komórek b i zawartością insuliny.

2. Materiały i metody

2.1. Hodowla komórek i materiały

Mysie komórki tc3 (dostarczone przez prof. Hanahan — Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, CA [31]) hodowano w pożywce RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Włochy) z dodatkiem 10% (v/v) inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Włochy), 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Włochy) i 1% (v/v) L-glutaminy (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Włochy). Ludzkie wysepki Langerhansa wyizolowano w Mediolanie (Niguarda Ca' Granda) od dawców nieżyjących wielonarządowych zgodnie z procedurą opisaną przez Ricordi i in. [32]; hodowano je w pożywce hodowlanej RPMI zawierającej 5,5 mmol/l glukozy, 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 0,7 mM glutaminy, 50 jednostek/ml penicyliny i 50 ug/ml streptomycyny (EuroClone, SpA, Pero MI, Włochy). Zastosowano cztery różne preparaty wysepek, czystość wysepek wynosiła 80 ± 10 procent. Izolacja wysepek i badania wysepek zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki szpitala Niguarda Ca' Granda w Mediolanie (11.12.2009). Komórki tc3 potraktowano 0,8, 1,6 i 16 uM werbaskozydem (Carbosynth, OV08034, Compton, Wielka Brytania), kwasem kawowym i hydroksytyrozolem (uprzejmy dar prof. Dell'Agli, Department of Pharmacological and Biomolecular Sciences, Universita degli Studi di Milano, Mediolan, Włochy) w kompletnej pożywce RPMI przez 5 dni, podczas gdy ludzkie wysepki z 16 uM werbaskozydem. Komórki potraktowane metanolem/etanolem zastosowano jako kontrole. W celu wywołania stresu oksydacyjnego, komórki traktowano H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 µM w kompletnej pożywce RPMI przez 20 minut przed analizą, podczas gdy traktowano tunikamycyną 2 µg/ml (T7765, Sigma Aldrich ) przez 7 godzin w celu wywołania stresu ER.

2.2. Wykrywanie żywotności komórek za pomocą testu MTT

Komórki umieszczono na 96-studzienkowych płytkach i pięć dni po potraktowaniu werbasozydem inkubowano je z 00,5 mg/ml MTT (3-(4,5-dimetylotiazol{{7} }yl)-2,5-difenylotetrazoliowy bromek) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) przez 4 godziny w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 oC. Po inkubacji komórki delikatnie ponownie zawieszono w 100 µl DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Włochy) i wykrywano absorbancję przy 540 nm czytnikiem mikropłytek (Benchmark, czytnik mikropłytek, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA) [33]. Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a dane wyrażono jako krotność wzrostu w porównaniu z próbkami kontrolnymi.

2.3. Wykrywanie śmierci komórek metodą cytometrii przepływowej

Pięć dni po inkubacji z 16 µM werbaskozydem, komórki β oddzielono przez 7 min inkubacji z trypsyną/EDTA, zebrano i odwirowano; osad delikatnie ponownie zawieszono w niskich solach soli fizjologicznej buforu fosforanowego. Komórki barwiono odczynnikiem MuseTM do zliczania i żywotności (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) zgodnie z protokołem producenta i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a dane wyrażono jako procent martwych komórek w stosunku do całości.

2.4. Generacja ROS

Wewnątrzkomórkowe ROS oceniano za pomocą DCFDA (dioctanu 2/,7/-dichlorofuoresceiny) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA), sondy przepuszczalnej przez błonę, która po związaniu z ROS staje się fluorescencyjna [34]. Komórki tc3 zostały wstępnie załadowane 15 uM DCFDA w buforze Krebsa-Ringera (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 i 2 mM CaCl2)

uzupełniony 11 mM glukozą przez 1 godz. w 37 oC. Zawartość ROS wykrywano przez 30 minut zarówno w warunkach podstawowych, jak i stresowych za pomocą czytnika mikropłytek (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite® F500, Tecan Group Ltd. Mannedorf, Szwajcaria). Wartości średnie i odchylenia standardowe oparto na trzech niezależnych eksperymentach.

2.5. Western Blotting

Komórki tc3 zebrano i rozpuszczono w buforze RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 1% TERGITOLw NP40, 0,5% dezoksycholan) z dodatkiem aprotyniny (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) oraz inhibitorami Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) przez 40 min w 4 oC. Stężenie białka określono w teście Bradforda [35] przy użyciu odczynnika Bradford (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA), 30 ug białek rozdzielono przez 10% SDS-PAGE i przeniesiono na błony nitrocelulozowe (Millipore, Burlington MA, USA). Pierwotne przeciwciała stosowano przez 2 godziny w buforze blokującym z 5% odtłuszczonym mlekiem lub 5% roztworami BSA; zastosowano następujące przeciwciała pierwszorzędowe: mysie przeciw - -aktynie (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), mysie przeciw akroleinie (Abcam, ab48501, Cambridge, UK), mysie przeciw BIP (życzliwy dar prof. Borgese Nica, Institute of Neuroscience, CNR, Mediolan, Włochy), królicze anty-HNE (-diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), mysie anty-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), królicze anty-fosfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), mysie anty-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, USA), królicze anty-fosfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), królicze anty-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), owcze anty-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), królicze anty-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), królicze anty-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc., 5324, Danvers, MA, USA) i królicze anty-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). Drugorzędowe przeciwciała skoniugowane z HRP (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) zastosowano w rozcieńczeniu 1:5000. Białka wykrywano za pomocą systemu detekcji ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, Włochy) za pomocą systemu Odyssey Fc Image (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Niemcy), a gęstość prążków określano ilościowo za pomocą oprogramowania Image Studiow Lite (LI -COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) [36]. Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a dane wyrażono jako krotność wzrostu w porównaniu z próbkami kontrolnymi.

2.6. Potencjał błony mitochondrialnej

Komórki tc3 i ludzkie wysepki Langerhansa inkubowano z 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Mediolan, Włochy) lub 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde Srl, Mediolan, Włochy) przez 30 minut w 37 °C oC; Intensywność fluorescencji wykrywano za pomocą czytnika mikropłytek TECAN Infinite® F500 (551/576 nm Ex/Em dla MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em dla MitoSpyw Green) (TECAN Infinite® F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Szwajcaria). Komórki inkubowano z 500 uM H2O2 przez 20 min i wykrywano intensywność fluorescencji, jak opisano wcześniej. Wartości średnie i odchylenia standardowe oparto na trzech różnych eksperymentach.

2.7. Morfologia i dynamika mitochondriów

Komórki tc3 wstępnie załadowano 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Mediolan, Włochy) w 11 mM glukozowym buforze Krebsa-Ringera w 37 oC przez 30 min. Próbki umieszczono w komorze obrazowania, a losowe pola obrazowano za pomocą filtra rodanowego mikroskopu Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Niemcy). Aby ocenić morfologię mitochondriów, za pomocą oprogramowania do analizy cząstek ImageJ analizowano następujące parametry: obszar (um2), kołowość (4mArea2/Perimeter2) i maksymalną średnicę Fereta (um) [37].

W przypadku eksperymentów poklatkowych obrazowanie pojedynczych komórek prowadzono z szybkością 1 klatki na sekundę przez 30 s w warunkach kontroli lub stresu oksydacyjnego. Aby zmierzyć skumulowaną odległość mitochondrialną (um2), obrazy najpierw skorygowano pod kątem wybielania, a następnie przeanalizowano filmy przy użyciu istniejącej wtyczki Image-Pro Plus (śledzenie obiektów) (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Do dwunastu

komórki obrazowano w trzech niezależnych eksperymentach, a dane przedstawiono jako wartości średnie i odchylenia standardowe.

2.8. Wydzielanie insuliny

Wyizolowane ludzkie wysepki Langerhansa wysiano na płytce 96-dołkowej z gęstością 20 wysepek na dołek i po 5 dniach leczenia mierzono zawartość i wydzielanie insuliny w stanie podstawowym (3,3 mM glukozy) i stymulowanym (16,7 mM glukozy). ) w warunkach za pomocą testu immunologicznego ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Szwecja).

2.9. Analizy statystyczne

Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą programu GraphPad Prism 8.0 w niezależnych powtórzeniach biologicznych. Średnie między dwiema grupami oceniano za pomocą dwustronnego testu t-Studenta, a jako dowód istotności statystycznej przyjęto wartość p < 0.05.="" średnie="" pomiędzy="" trzema="" lub="" więcej="" grupami="" zostały="" porównane="" przez="" analizę="" wariancji="" (anova),="" a="" następnie="" wielokrotny="" test="" porównawczy="" post-hoc="" (tukey'a).="" zastosowany="" test="" statystyczny,="" dokładne="" wartości="" p="" i="" liczba="" replik="" (n)="" są="" wskazane="" w="" poszczególnych="" legendach="" rycin.="" słupki="" błędów="" na="" rysunkach="" pokazują="" średnią="" ±="" sd="" lub="" średnią="" ±="" se,="" jak="">

3. Wyniki

3.1. Werbaskozyd poprawia - żywotność komórek

Ponieważ nie było danych dotyczących wpływu werbaskozydu na komórki b, wykonaliśmy test MTT w celu oceny żywotności komórek i jak pokazano na Figurze 1A, zaobserwowano pozytywny trend zależny od dawki. Dlatego do dalszych badań wybraliśmy stężenie 16 μM, które statystycznie udowodniło, że skutecznie zwiększa żywotność komórek b. Za pomocą cytometrii przepływowej zbadaliśmy wpływ pięciodniowej inkubacji werbaskozydu na przeżywalność komórek b w warunkach podstawowych i po 2{{21} } min obróbki wstępnej 500 uM H2O2. W stanie podstawowym werbaskozyd nie wpływał na przeżycie komórek, co sugeruje, że zwiększona żywotność komórek b obserwowana w teście MTT może być spowodowana poprawą aktywności mitochondriów. Natomiast po ekspozycji na H2O2 wstępne traktowanie 16 µM werbaskozydu znacząco zmniejszyło śmierć komórek wywołaną stresem oksydacyjnym (ryc. 1B, C). Werbaskozyd jest złożoną cząsteczką, która może być modyfikowana przez enzymy hydrolizujące [18]. Aby sprawdzić, czy metabolity werbaskozydu mogą być odpowiedzialne za obserwowany efekt ochronny, komórki tc3 traktowano hydroksytyrozolem i kwasami kawowymi (0,8 i 16 µM) przez 5 dni. Oba metabolity nie zwiększyły żywotności komórek, przeciwnie, dla stężenia 16 uM wykryto efekt cytotoksyczny, bardziej istotny po ekspozycji na H2O2 (Figura S1). To odkrycie dowodzi, że werbaskozyd, a nie jego metabolity, wywiera ochronny wpływ na leczenie H2O2.

3.2. Werbaskozyd moduluje homeostazę redoks i wywiera działanie przeciwzapalne w komórkach -

Najpierw potwierdziliśmy w komórkach tc3 przeciwzapalne i przeciwutleniające działanie werbaskozydu obserwowane w innych typach komórek [24,29,34]. Aktywność zmiatania ROS werbaskozydu oceniano przy użyciu komórek tc3 wyznakowanych specyficzną dla ROS DCFDA (2/,7/-dioctan dichlorofuoresceiny) sondą przepuszczalną dla komórek. Jak pokazano na rycinie 2A, znaczny spadek zawartości ROS wykryto po wstępnej obróbce werbaskozydem, zarówno w warunkach stresu podstawowego, jak i oksydacyjnego.

Analiza Western blot wykazała znaczny spadek ekspresji markerów stresu oksydacyjnego akroleiny i 4-hydroksynonenalu (HNE) w komórkach traktowanych werbaskozydem. Ponadto stwierdziliśmy wzrost ekspresji dysmutazy ponadtlenkowej (SOD1), co sugeruje, że werbaskozyd wywiera aktywność przeciwutleniającą prawdopodobnie w dwóch różnych mechanizmach, bezpośrednio jako zmiatacz ROS i pośrednio poprzez indukowanie ekspresji enzymów antyoksydacyjnych (ryc. 2B, C).

Działanie przeciwzapalne werbaskozydu na komórki b oceniano poprzez ocenę aktywacji szlaku NFKB, najważniejszego szlaku prozapalnego w tych komórkach [38]. Analiza Western blot wykazała zmniejszoną ekspresję inhibitora jądrowego czynnika kappa B (IKB) i jądrowego czynnika kappa-wzmacniacza łańcucha lekkiego (NFKB) oraz znaczny spadek fosforylacji NFKB we wstępnie potraktowanych komórkach, potwierdzając hipotezę skuteczność werbaskozydu w zmniejszaniu stanu zapalnego komórek (ryc. 2D, E).

3.3. Werbaskozyd moduluje odpowiedź niezfałdowanego białka komórek -

Następnie przeanalizowaliśmy dogłębnie mechanizm molekularny, dzięki któremu werbaskozyd pełni rolę przeciwutleniającą i przeciwzapalną, skupiając się na siateczce endoplazmatycznej, która staje się kluczowym czujnikiem sygnałów metabolicznych i stresowych w komórkach b. W warunkach stresu organelle wytwarzają odpowiedź homeostatyczną, znaną jako odpowiedź na rozwinięte białko (UPR), mającą na celu przywrócenie funkcji ER; jednak nadmierna aktywacja tego szlaku powoduje apoptozę [39,40].

Markerami zwiększonego stresu ER są regulacja w górę białek opiekuńczych i aktywacja odpowiedzi UPR. Analiza Western blot komórek traktowanych werbaskozydem ujawniła obniżone poziomy dwóch białek opiekuńczych szoku cieplnego 70 (HSP70) i ​​wiążącego białka immunoglobuliny (BIP) (Figura 3A, B). Ponadto wykryto znaczną redukcję ekspresji kinazy białkowej RNA-podobnej kinazy ER (PERK) i zmniejszoną fosforylację jej dalszego efektora, eukariotycznego czynnika inicjacji translacji 2 (eIF2).

Kliknij tutaj, aby przejść do części 2