Część 5: Mapowanie wzajemnego oddziaływania epigenomicznego i transkryptomicznego podczas tworzenia pamięci i przywoływania w zespole engramów hipokampa

ali.ma@wecistanche.com

Pls kliknij tutaj, aby część 6!

Pls kliknij tutaj, aby część 5!

Rozszerzone dane Rys. 2: Stabilne DAR-y są głównie wzbogacone o znaczniki wzmacniające

(a) Przebieg pracy dla sekcji cytometrii przepływowej różnych populacji neuronów z hipokampa, podczaspamięćtworzenie i odzyskiwanie. Reprezentatywne wykresy FACS przedstawiające ekspresję całej populacji (panel lewy). Dalszej selekcji dokonano na pojedynczych jądrach i populacji NeuN plus /DAPI plus (panel środkowy). Na koniec dokonano selekcji w subpopulacji bramkowanej; GFP plus (dostosowany do ~2,5 procent ze wszystkich komórek), ARC plus /GFP plus (~0,15 procent ze wszystkich komórek) i jądra posortowano do 1,5 ml probówek Eppendorfa pokrytych 200 ul 1% PBS.

Kliknij, abyProszek z ekstraktu z Cistanche poprawia pamięć

(b) Diagram Venna (po lewej) i tabela (po prawej) ilustrują nakładanie się wartości DAR zidentyfikowanych w różnych porównaniach parami podczaspamięćformacja i przypominanie.

(c) Przeprowadzono analizę statystyczną opartą na ponownym próbkowaniu w celu określenia, czy wzbogacenia stanów chromatyny w stosunku do emisji ChromHMM (obserwowane) są statystycznie istotne. Oczekiwane wzbogacenie zostało obliczone przez wykonanie 10,000 randomizowanych zestawów nakładania się (permutacji) między „wszystkimi dostępnymi witrynami” a „wszystkimi miejscami modyfikacji histonów (tj. wszystkimi emisjami)” loci i przedstawione jako histogram w Figura. Wielkość próby każdego randomizowanego zestawu została określona na podstawie wielkości DAR z każdego stanu. Obliczono średnią i odchylenie standardowe próbki (tabela uzupełniająca 3). Liczbę zaobserwowanych nakładania się DARów i każdej emisji obliczono i przedstawiono w postaci linii. Z-score obliczono jako odłogi; Z=(wartości obserwowane (X) – średnia próbki (μ))/(odchylenie standardowe próbki (σ)). podstawowa wartość z-score vs. wczesna; SE 10.5, ŚŚ 6.9. Stabilny; SE 16,9, WE 12,7, wszystkie p < 0,0001,="" z-score="" wczesne="" vs="" późne;="" sp="" 91,7,="" wp="" 38.7.="" późny="" vs.="" reaktywowany;="" sp="" 26,8,="" wp="" 28,9,="" wszystkie=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">

(d) Wykres kołowy pokazuje procent różnych stanów wzmacniacza dla wszystkich regionów stabilnych. Nakładanie się każdego stabilnego regionu przeprowadzono z wcześniej opublikowanymi danymi H3K4me1 i H3K27ac ChIP-seq, uzyskanymi 1 godzinę po FS21. Stany wzmacniające zostały sklasyfikowane jako „podstawowe” – nakładają się na regiony oznaczone tylko przez H3K4me1, „aktywne” – z H3K4me1/ H3K27ac lub „utajone” – brak nakładania się.

(e) Motifs identified from nucleosome-free regions (NFR) on the ATAC-seq tracks from each state (Basal, Activated -early, Activated -late, and Reactivated). Peaks were divided into positions that were annotated to promoters (5kb from TSS) and enhancers (>5kb z TSS). Rozmiar okręgu wskazuje procent wzbogacenia (1–50 procent). Kolor wskazuje –log (wartość P).

Dane rozszerzone Ryc. 3: Skoordynowane torowanie stanu epigenetycznego podczaspamięćkodowanie i

(a) Właściwości oddziaływań wykrytych przez Chicago w każdej fazie (Podstawowa, Aktywowana-wczesna, Aktywowana-późna i Reaktywowana). W wywoływaniu znaczących interakcji, wykonywanym wspólnie we wszystkich powtórzeniach, zastosowano ustawienia domyślne i próg wyniku równy 5.

(b) Wykres kołowy przedstawia odsetek wszystkich wykrytych przez Chicago interakcji, które są wyznaczone przez H3K27ac/H3K4me1 (67,5% znaków wzmacniających), H3K4me3/H3K9ac (46,2% znaków promotorów) lub H3K27me3 (1,1% znaków represyjnych).

(c) Obraz przeglądarki epigenomu WashU, obejmujący region ~500 Kb wokół genów Eif4e2. Łuki pokazują znaczące wspólne (czerwony prostokąt) i unikalne (strzałki) wzmacniacze, które oddziałują z promotorami (niebieski prostokąt).

(d) Przykłady interakcji wywoływanych przez Chicago. Wykresy pokazujące wszystkie odczyty z drugiej strony przynęty (wzmacniacz), w promieniu 500–700 kb (w górę i w dół) od Grink3 i Promotory Wwc2. Istotne interakcje wykryte przez Chicago (wynik Większy lub równy 5) są pokazane na czerwono, a interakcje podprogowe (3 Mniejsze lub równe wynikowi < 5)="" są="" pokazane="" na="" niebiesko.="" szare="" linie="" pokazują="" oczekiwane="" liczby,="" a="" linie="" przerywane="" górną="" granicę="" 95-procentowego="" przedziału="" ufności.="" (e)="" analiza="" wzbogacania="" nakładania="" się="" między="" oddziałującymi="" wzmacniaczami="" i="" dar,="" przy="" użyciu="" procedury="" permutacji="" na="" 10,000="" randomizowanych="" zestawach="" dostępnych="" miejsc.="" histogram="" przedstawia="" losowy="" rozkład="" próbkowania="" dostępnych="" miejsc="" dla="" każdego="" stanu="" (podstawowy="" vs.="" aktywowany="" -="" wczesny,="" aktywowany="" -wczesny="" vs.="" aktywowany="" -późny,="" aktywowany="" -późny="" vs.="" reaktywowany,="" stabilny).="" liczba="" nakładających="" się="" loci="" jest="" przedstawiona="" kolorowymi="" liniami="" z="" neuronów="" basal,="" activated="" -early,="" activated="" -late="" i="" reactivated.="" dar="" dla="" bas="" vs.="" aktywowany="" wcześnie="" (z-score;="" 7,1,="" 7,7,="" 8,5,="" 10,9).="" dar="" aktywowanego="" -wczesnego="" vs.="" aktywowanego="" -późnego="" (z-score;="" -0,1,="" -0,8,="" -2,4,="" -3,2).="" dar="" aktywowanego="" późnego="" vs.="" reaktywowanego="" (0,4,="" 1,8,="" 0,4,="" -0,2).="" dar="" stabilne="" (z-score;="" 1,7,="" 2,0,="" 6,5,="">

Rozszerzone dane Rys. 4: Zmiany chromatyny zachodzące we wczesnej fazie umożliwiają

(a) Analiza nakładania się nazw genów z analizy różnicowej w parach i wcześniej opublikowanych danych dotyczących i) aktywowanych komórek ziarnistych DG 1 godz. po nowej ekspozycji32 ii) 24 godz. po FS20 i iii) po przedłużonej stymulacji (6 godz.) hodowli komórek korowych myszy neurony z KCl33. Analiza została przeprowadzona przez pakiet GeneOverlap R.

(b) Odczyty egzonu (czerwony) i intronowy (niebieski) obliczono oddzielnie we wszystkich warunkach i porównano z aktywnością transkrypcyjną mierzoną za pomocą DEseq2. Odczyty zostały znormalizowane (RPKM), a zmiany log2FC są prezentowane dla każdego stanu. fabuła skrzypcowa wskazuje średnią,

zakres międzykwartylowy oraz minimum i maksimum, jednoczynnikowa ANOVA (parametryczna, niesparowana), podstawowa vs. wczesna; F (5, 248)=389.9. Wczesny vs. Późny; F (5, 2374)=2183. Późny vs. reaktywowany. F (5, 1357) {{10}.5, Wszystkie Ps < 0.0001.="" wielokrotne="" porównania="" bonferroniego.="" ns="nieistotne," ***p=""><>

(c) Stosunki egzon/intron zmierzono w każdym klastrze we wszystkich warunkach (skala Log2FC). wykres skrzypcowy wskazuje średnią, przedział ćwiartkowy oraz minimum i maksimum, jednoczynnikową ANOVA (parametryczną, niesparowaną), F (5, 1143)=260.2, P<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p="" <="">

(d) Analiza nakładania się między DAR i DEG podczas różnychpamięćfazy. DAR w regionach intergenowych i intronowych zmapowano do ich odpowiednich genów za pomocą map interakcji pc-HiC. Analiza nakładania się została przeprowadzona przez pakiet GeneOverlap R. Wartość P (liczby) i iloraz szans (kolor) z dokładnego testu Fishera są przedstawione na mapie cieplnej. ns – nieistotne.

(e) Korelacja Pearsona między wartościami log2FC DAR i log2FC DEG, które zostały przypisane do tego regionu (regiony międzygenowe mapowano za pomocą zestawu danych pc-HiC). Zmiany dostępności chromatyny porównano z przeanalizowanymi odczytami egzonów (linia czerwona), odczytami intronowymi (linie niebieskie) i całkowitymi zmianami transkrypcji (odczyty intronowe i egzonowe) mierzonymi za pomocą Desq2 (linia szara). Wszystkie wartości r i p przedstawiono w uzupełniającej tabeli 9.

Dane rozszerzone Ryc. 5: Zmiany transkrypcyjne w neuronach późnych po aktywacji korelowały wyżej

(a) Odczyty egzoniczne (czerwony) i intronowy (niebieski) skwantyfikowano oddzielnie we wszystkich warunkach dla każdego z klastrów zidentyfikowanych na ryc. 5B. Odczyty zostały znormalizowane (RPKM), a zmiany log2FC są prezentowane dla każdego klastra.

(b) Stosunki egzon/intron mierzono w każdym klastrze we wszystkich warunkach. Wykres skrzypcowy wskazuje średnią, zakres międzykwartylowy oraz minimum i maksimum, n=3 biologicznie niezależnych próbek jednoczynnikowa ANOVA (parametryczna, niesparowana), Dw – późne skupienie; K (3, 968)

652) = 93.97, P<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p="" <="">

Rozszerzony Dane Figa. 6: Odrębny tymczasowo transkrypcyjny programy są istnienie zsynchronizowane do

w sposób zależny w obecności tamoksyfenu. W prawym panelu reprezentatywne obrazy IHC DG. Zielony – AAV-eYFP, Czerwony – łuk endogenny. Skala przedstawia 50 μm.

(b) Ocena morfologii kręgosłupa podczas różnychpamięćfazy. Prawy panel pokazuje pojedynczy eYFP plus trzon dendrytyczny z różnymi typami kolców (Króciaki, Cienki, Grzybowy, Powiększony Grzyb). Skala przedstawia 5 μm. Wykres pudełkowy wskazuje średnią, zakres międzykwartylowy oraz minimum i maksimum, Aktywowane -wczesne: n=4 myszy /5 skrawków na zwierzę, Aktywowane -późne: n=4 myszy /4 skrawki na zwierzę, Reaktywowane: n=4 myszy /2 sekcje na zwierzę. jednokierunkowa ANOVA (parametryczna, niesparowana), Stubby; F (2, 36)=2.313, P=0.1135. Cienki; F (2, 36)=35.12, P<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="" <="" 0.0001.="" bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p="" <="">

(c) Reprezentatywne obrazy IHC i kwantyfikacja poziomów białka dwóch członków rodziny EIF; (po lewej) Eif2a i (po prawej) Eif3e. Skala przedstawia 10 μm. Dane dla wału dendrytycznego są przedstawione jako stosunek liczby do długości (μM). n=4 myszy /5 sekcji na zwierzę, wykres pudełkowy wskazuje średnią, zakres międzykwartylowy oraz minimalną i maksymalną, jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA (parametryczną, niesparowaną) z testem wielokrotnych porównań Bonferroniego, ns - nieistotne, wał Eif2a; F (2, 20)=4.484, P=0.0246. Soma; F (2, 21)=19,58, P < 0,0001.="" (aktywacja="" -wczesna="" vs.="" aktywowana="" -późna="" *p="0.0142," aktywowana="" -wczesna="" vs.="" reaktywowana="" *p="">< 0,0001,="" aktywowana="" -późna="" vs.="" reaktywowana="" *p="0.0303)." wał="" eif3e;="" f="" (2,="" 14)="1,983," p="0,1745." soma;="" f="" (2,="" 23)="8.309," p="0.0019," (aktywowane="" -wcześnie="" vs.="" reaktywowane="" *p="0.0057," aktywowane="" -późne="" vs.="" reaktywowane="" *p="" {{="">

(d) Wykres kołowy przedstawia procent powiększonych kolców grzyba (Dh Większy lub równy 3Dn) i kolców grzyba z neuronów Activated -late i Reactivated.

(e) Obrazy reprezentatywne (panel lewy) i ocena ilościowa (panel prawy) poziomów mRNA Gria1 podczas różnych fazpamięć. Dane są przedstawiane jako stosunek między kilkoma punktami a długością trzonu dendrytycznego. Skala przedstawia 10 μm. N=4 myszy /5 sekcji na zwierzę, wykres pudełkowy wskazuje średni zakres międzykwartylowy oraz minimum i maksimum Shaft; jednoczynnikowa ANOVA (parametryczna, niesparowana) F (2, 15)=10.41, P=00.0015. Test wielokrotnych porównań Bonferroniego, **P=0.0011. dolny panel - Soma; jednokierunkowa ANOVA F (2, 12)=0.13, P=0.88.

Rozszerzone dane Rys. 7: Interakcje z różnymi wzmacniaczami kombinatorycznymi prowadzą do kierunkowego

(a) Diagramy Venna pokazują procent nakładania się dostępności chromatyny (DAR) we wszystkichpamięćfaz (BAS vs. aktywowany -wczesny, jasnozielony okrąg; aktywowany -wczesny vs. aktywowany -późny, ciemnozielony okrąg; Aktywowany -późny vs. Reaktywowany, pomarańczowy okrąg) oraz całkowite zmiany transkrypcji ze wszystkich zidentyfikowanych skupień (Dw – późno, Spóźnione, Stabilne, Reaktywacja, niebieskie kółko z siatką). DAR międzygenowe i intronowe zostały zmapowane do odpowiednich genów za pomocą map interakcji pc-HiC. Procent nakładania się obliczono ze wszystkich zidentyfikowanych DEG w klastrach (n=1095).

(b) Analiza nakładania się między DAR (parami) i DEG z każdego klastra. DAR międzygenowe i intronowe zostały zmapowane do odpowiednich genów za pomocą map interakcji pc-HiC.

Analiza nakładania się została przeprowadzona przez pakiet GeneOverlap R. Wartości P i wartości Jaccarda (kolor) z dokładnego testu Fishera są przedstawione na mapie cieplnej (po lewej). Procent nakładania się obliczono ze wszystkich zidentyfikowanych DEG w klastrach (po prawej).

(c) Reprezentatywny obraz zmian chromatyny i transkrypcji locus Gabrb3 z gromady Dw-późnej. Podczas gdy interakcje w stanie wczesnym zachodziły między promotorem i wzmacniaczami z aktywatorami transkrypcji (Ap1), interakcje w stanie późnym zachodziły z represorami transkrypcji (Slug). Górne ścieżki przeglądarki genomu IGV (fioletowy - podstawowy, jasnozielony - aktywowany - wczesny, ciemnozielony - aktywowany - późny i pomarańczowy - reaktywowany) przedstawiają zmiany transkrypcyjne (ncRNA-seq), środkowe ścieżki pokazują dynamikę dostępności chromatyny (ATAC-seq) na promotor (czerwony prostokąt) i wzmacniacze (szary prostokąt). Istotne interakcje promotor-wzmacniacz są reprezentowane jako łuki (ścieżki przeglądarki WashU). Dolna ścieżka przedstawia motywy, które zostały zidentyfikowane za pomocą narzędzi HOMER (Slug, Ap1 i Rest).

(d) Wykresy agregacji dla poszczególnych motywów. Wartości wzbogacenia (motywy na pz/ na pik) sześciu wybranych motywów (dwa represory, dwa aktywatory i dwa biwalentne) oceniano wokół środka pików (-/ plus 4000 pz) z każdego skupienia.

Rozszerzone dane Ryc. 8: Proponowany model dostępności chromatyny, interakcji promotor-wzmacniacz i dynamiki transkrypcyjnej neuronów engramów pamięci hipokampa

regiony, które zawierają motywy aktywatora transkrypcji. To przeprogramowanie promotora-wzmacniacza powoduje zwiększoną ekspresję genów, która przypuszczalnie umożliwia stabilizacjępamięć. Przypomnijmy – reaktywowane neurony engramowe wykorzystywały podzbiór oddziaływań pobudzonych promotor-wzmacniacz, które są związane ze zmianami transkrypcyjnymi zaangażowanymi w transport mRNA do przedziałów synaptycznych i translację białek. Czynnik transkrypcyjny – TF, E(1–3) – różne wzmacniacze oddziałujące z tym samym promotorem, Czerwony – represory transkrypcji, Niebieski – aktywatory transkrypcji.

Materiał uzupełniający

Zapoznaj się z wersją internetową w PubMed Central, aby uzyskać dodatkowe materiały.

Podziękowanie

Dziękujemy E. Niederst, J. Penney, S. Barker, RT Stott, M. Victor, A. Watson, N. Dedic, E. Lockshin i członkom L.HT Lab za pomocną dyskusję i sugestie. Dziękujemy kierownikom laboratorium Y. Zhou, E. McNamara za utrzymanie kolonii myszy. Dziękujemy P. Autissier (Instytut Whitehead) za pomoc przy FACS. Finansowanie: Prace te były wspierane przez granty NIH RF1AG062377, AF1AG054012, RO1NS102730, RF1AG064321, The JPB Foundation, The Alana Down Syndrome Research Foundation, The LuMind Down Syndrome Research Foundation, konsorcjum Cure Alzheimer's Fund CIRCUITS oraz The Robert A i Renee E. Fundacja Rodziny Belfer dla LH.T. Ta praca była również częściowo wspierana przez granty NIH R01AG058002, U01NS110453, R01AG062335, UG3NS115064 dla MK i LH.T oraz R01AG067151, R01MH109978, U01MH119509, R01HG008155, U24HG009446 dla MKVD jest wspierany przez {28} grant stowarzyszenia Alzheimera {28}ARF . HSM jest wspierany przez Burroughs Wellcome Fund i stypendium podoktoranckie UNCF-Merck. C. A jest wspierany przez Fundację JPB. RMR jest obsługiwany przez grant NIH T32 5T32HD09806. Zestaw do przygotowania bibliotek Hi-C został otrzymany jako hojny prezent od DovetailTM (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, USA). Dziękujemy zespołowi Dovetail za pomocną dyskusję i sugestie.