CZĘŚĆ I.: Podawanie synbiotyku Lactobacillus Bulgaricus 6c3 Szczep, inulina i fruktooligosacharyd zmniejsza stężenie siarczanu indoksylu i uszkodzenie nerek
Mar 23, 2022
ali.ma@wecistanche.com
AlonsoJerez-Morales,JoseS.Merino,Sindy T.Diaz-Castillo & et al.
1. Wprowadzenie
Przewlekła choroba nerek(PChN) uważa się za trwałą zmianęnerkastruktura, jego funkcja lub, w najcięższych przypadkach, oba. PChN bezpośrednio wpływa na zdrowie i jakość życia danej osoby [1,2]. Na poziomie fizjologicznym często obserwowane zmiany spowodowane PChN to podwyższony poziom kreatyniny w surowicy, cystatyny Cor azotu mocznikowego [2]. Wzmożona inwigilacja i świadomość w populacji zwiększyły diagnozy PChN, osiągając na przykład ustalenie, że 15% populacji USA jest dotknięte tą patologią [3]. Postęp choroby, a także działanie wyżej wymienionych metabolitów, mają poważny wpływ na wiele układów organizmu, w tym układ sercowo-naczyniowy i żołądkowo-jelitowy, będąc obecnością tych metabolitów związanych ze zwiększoną śmiertelnością w pierwszym i wpływających na asymilację, ruchliwość i przepuszczalność w tym drugim [4,5]. Zmiany żołądkowo-jelitowe wywołują zwiększone wchłanianie metabolitów w jelicie, przyczyniając się do podtrzymania ogólnoustrojowego stanu zapalnego, który z kolei wpływa na skład prawidłowej mikrobioty i jej funkcje metaboliczne oraz może powodować dysbiozę jelitową [6].
Kliknij, aby cistanche skutki uboczne i produkt Cistanche dla nerek
Związek między PChN a dysbiozą jelitową można wytłumaczyć nie tylko zmianami w diecie, ale także wzrostem pH luminalnego, wtórnym do zwiększonego stężenia amonu [7]. Pacjenci ze schyłkową fazą PChN mają wyraźne różnice w liczebności kilku taksonów bakteryjnych w kale w porównaniu ze zdrowymi osobnikami [8]. W szczególności na poziomie rodzaju bakterii pacjenci z PChN wykazują wzrost Enterorhabdus, Blautia, Ruminococcus, Parasutterella, Bacteroides, Clostridium (sensu stricto), Escherichia, Shigella i Allobaculum oraz zmniejszenie Akkermansia, Bifidobacterium, Clostridium IV, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Alkaliphilus i Pseudomonas [9-11]. Albo przez słabe oczyszczenie nerek, albo przez dysbiozę jelitową, następuje zmniejszenie rodzajów bakterii zdolnych do metabolizowania i hamowania patogenów wytwarzających toksyczne metabolity, co powoduje ich wzrost [12]. Wong i in. [8] wykazali, że pacjenci cierpiący na zaawansowaną PChN wykazywali wzrost grup bakteryjnych posiadających enzymy, takie jak ureaza, urykaza oraz te wytwarzające p-krezol i indol.
Nagromadzenie metabolitów retencji mocznicowej (URM) we krwi, w tymsiarczan indoksylu(IS), siarczan p-krezylu (pCS), trietyloamina i N-tlenek trimetyloaminy (TMAO)[5] są postulowane jako akceleratory CKD [13]. JEST(Siarczan indoksylu), najbardziej znany indol mocznicowy, jest wydzielany przez proksymalne zawiłe kanalikinerkai pochodzi z metabolizmu tryptofanu przez bakteryjną tryptofanazę. Dowody z modeli zwierzęcych pokazują, że IS(Siarczan indoksylu)może wpływać na czynność nerek i może uszkadzać komórki kanalików, generując stres oksydacyjny w komórkach śródbłonka, hamując mechanizmy naprawcze i sprzyjając śródmiąższowemu zwłóknieniu kanalików, ponieważ zwiększa ekspresję genową TGF-1, tkankowego inhibitora metaloproteinaz (TIMP-1) i kolagenu [14]. Niemniej jednak można zmodyfikować nierównowagę mikrobioty jelitowej i jednoczesną produkcję toksycznych metabolitów. Opisano, że suplementacja niektórymi probiotykami i prebiotykami może zmniejszyć produkcję niektórych toksyn mocznicowych i przywrócić normalną mikroflorę [5]. Na przykład badania metaanalityczne wykazały, że pacjenci z PChN otrzymujący suplementację szczepami probiotycznymi zwiększyli swoje przeciwzapalne cy-tokiny i zmniejszyli poziom toksyn mocznicowych [15,16]. Niektóre badania wykazały, że podawanie synbiotyków, kombinacji probiotyków i prebiotyków, jest w stanie zmniejszyć postęp PChN z korzystnymi wynikami [12]. W kontekście niniejszej pracy fruktany typu inulinowego są istotnymi prebiotykami, ponieważ wykazały swoją zdolność do zmniejszania progresji PChN [17] i zmniejszania URM, takich jak pCS i IS.(Siarczan indoksylu)[18]. Panza i in. (2017) podawali probiotyki L.acidophlilus i Bifidobacterium longum plus fruktooligosacharydy (FOS) u pacjentów z PChN w stadium 2-5 i zgłosili, że nieleczeni pacjenci mieli znacznie więcej pCS i są(Siarczan indoksylu)we krwi niż pacjenci, którzy otrzymali leczenie synbiotyczne [19]. W tej pracy najpierw oceniliśmy zdolność szczepów probiotycznych do redukcji IS(Siarczan indoksylu)in vitro, aby wybrać najbardziej obiecujący. Następnie szczep ten połączono z prebiotykami inuliną i fruktooligosacharydami (FOS) w celu uzyskania domniemanego synbiotyku. Te prebiotyki zostały wybrane, ponieważ wykazały, że mogą zmniejszyć pCS i IS(Siarczan indoksylu)stężenie we krwi [17,18]. Na koniec skuteczność domniemanego synbiotyka została przetestowana in vivo, oceniając IS we krwi(Siarczan indoksylu)i stężenia kreatyniny oraznerkai uszkodzenie serca przy użyciu modelu szczura (szczury Sprague-Dawley), w tymnerkaniedobór (nefrektomia) i nieleczone zwierzęta.
2. Wyniki
2.1.Izolacja szczepów zdolnych do redukcji IS(Siarczan indoksylu)In Vitro
Z 36 próbek produktów mlecznych wyizolowano 84 szczepy w agarze MRS uzupełnionym błękitem bromofenolowym (MRS-BFB), stosowanym jako pożywka różnicowa. Pożywka ta umożliwia różnicowanie bakterii kwasu mlekowego. Przy pH 3 kolonie będą miały kolor żółty, a przy pH bliskim 5 będą miały kolor niebieski [19]. Wszystkie 84 wyizolowane szczepy zostały przetestowane in vitro w celu określenia ich zdolności do pośredniczenia w redukcji IS(Siarczan indoksylu). W tym celu szczepy hodowano w bulionie MRS uzupełnionym 2,8 mM IS(Siarczan indoksylu)przez 48 h, a następnie IS(Siarczan indoksylu)mierzono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Szczepy lc2, 6c3 i VIc2 były w stanie znacznie zmniejszyć (p<0.05) the="" concentration="" of="" the="" compound="" (table="" 1).="" furthermore,="" the="" three="" strains="" were="" cultured="" together="" for="" 48="" h="" in="" the="" presence="" of="">(Siarczan indoksylu)aby ocenić, czy działali synergistycznie w celu zmniejszenia IS(Siarczan indoksylu). Kiedy wszystkie trzy szczepy były hodowane razem w obecności IS(Siarczan indoksylu), koncentracja IS(Siarczan indoksylu)była również znacznie zmniejszona, ale mniejsza niż osiągnięta przez same szczepy, wykluczając możliwość synergistycznego działania (tabela 1).
Tabela 1.Zmniejszenie in vitro, jeślisiarczan indoksylu(IS), jest oceniany za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), w której pośredniczą szczepy bakterii.
2.2. Identyfikacja wybranych szczepów
Trzy szczepy wybrane ze względu na ich zdolność do redukcji IS(Siarczan indoksylu)zidentyfikowano poprzez sekwencjonowanie 16S rRNA po amplifikacji DNA PCR. Szczep 1c2 był łańcuchem Gram-dodatnim tworzącym koks, który w analizie molekularnej amplifikowano starterami LacZ dla Streptococcus thermophilus. Szczepy 6c3 i VIc2 były pałeczkami Gram-dodatnimi i wzmocnione starterami LbG w celu identyfikacji rodzaju Lactobacillus. Analiza sekwencjonowania 16SrRNA pozwoliła zidentyfikować szczep lc2 jako Streptococcus thermophilus (97,3% podobieństwa; Numer dostępu: AY188354.1), szczep 6c3 jako Lactobacillus bulgaricus (99,7% podobieństwa; Numer dostępu: CR954253) i szczep VIc2 jako Lactobacillus acidophilus (99,5% podobieństwa; Numer dostępu: AY773947.1). Tylko jeden z trzech szczepów został wybrany do przygotowania synbiotyku i przeprowadzenia następujących testów. Szczep Streptococcus thermophilus 1c2 został odrzucony, ponieważ wykazywał niskie tempo wzrostu. Z pozostałych dwóch szczepów wybrano szczep Lactobacillus bul-garicus 6c3, ponieważ wykazywał on lepszą funkcjonalność probiotyczną i właściwości bezpieczeństwa niż szczep Lactobacillus acidophilus VIIc2.
2.3. Wpływ synbiotyku na kreatyninę i IS we krwi(Siarczan indoksylu)Poziomy
Probiotyk L. bulgaricus 6c3 został liofilizowany w połączeniu z prebiotykami Inuline i FOS, będąc stężeniem probiotyku 10° CFU/g liofilizowanego produktu. Dziesięć gramów synbiotyku podawano codziennie, w wodzie pitnej, grupie leczonych nefrektomią synbiotycznych szczurów Sprague-Dawley (Lac). Nieleczona grupa nefrektomijna (Nef) i nienefektomizowana grupa kontrolna nie otrzymywały synbiotyku. Stężenie kreatyniny w surowicy i IS(Siarczan indoksylu)poziomy szczurów mierzono za pomocą HPLC na początku (tydzień po nefrektomii) i na końcu testu. Ponadto zarejestrowano hematokryty zwierząt wszystkich grup. Zmienność stężenia kreatyniny w surowicy pod koniec testu była istotnie różna (p<0.05) in="" the="" nef="" and="" lac="" groups,increasing="" 127%and="" 121%,="" respectively,="" when="" compared="" to="" their="" initial="" values(figure="" 1).="" the="" control="" group="" showed="" a="" non-significant="" creatinine="" increase="" of="" only="" 2%.="" the="" increase="" of="" creatinine="" serum="" levels="" in="" the="" nef="" and="" lac="" groups="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" control="" group="" but="" not="" significantly="" different="" between="" the="" nef="" and="" lac="" groups.="" nevertheless,="" all="" three="" groups="" maintained="" their="" creatinine="" levels="" within="" de="" normal="" limits="" for="" these="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" serum="">(Siarczan indoksylu)istotnie wzrosła tylko w grupie Nef odpowiadającej nefrektomii (z niedoborem nerek) zwierzętom, którym nie podawano synbiotyku (38,8%)(p<0.05).>(Siarczan indoksylu)wykazały nieistotny wzrost o 0,5% w grupie kontrolnej i nieistotny spadek o 0,8% w grupie Lac (ryc. 2). Kiedy porównywano grupy zwierząt nefrektomizowanych, grupa nie spożywająca synbiotyku (Nef) wykazała znacznie wyższy poziom IS(Siarczan indoksylu)w porównaniu z grupą, która spożywała synbiotyk (Lac). Nie było istotnej różnicy między grupą Lac a grupą kontrolną. Analiza danych w poszukiwaniu możliwej korelacji między kreatyniną a IS(Siarczan indoksylu)poziomy wykazały, że korelacja ta nie była obecna (materiały uzupełniające: rysunki S1-S3). Wreszcie, wyniki hematokrytów nie wykazały istotnych różnic między trzema grupami (ryc. 3).
Rysunek 1. a) Stężenie kreatyniny w surowicy szczurów Sprague-Dawley na początku i na końcu 16-tygodniowego podawania synbiotyku. b) Różnice w średnich końcowych stężeniach kreatyniny z 95% Tukey jednoczesne przedziały ufności (Jeśli przedział nie zawiera zera, odpowiednie środki są znacząco różne). Nef: nefrektomizowane szczury nie otrzymujące synbiotyku, Lac: nefrektomizowane szczury otrzymujące synbiotyk, Kontrola: szczury poddane nefrektomii.
Ryc. 2.a) Surowicasiarczan indoksylu(IS) poziomy szczurów Sprague-Dawley na początku i na końcu 16-tygodniowego podawania synbiotyku. b) Różnice w środkach dla ostatecznego IS(Siarczan indoksylu)stężenia z 95% równoczesnymi przedziałami ufności Tukeya (Jeśli przedział nie zawiera zera, odpowiednie środki są znacząco różne). Nef: nefrektomizowane szczury nie otrzymujące synbiotyku, Lac: nefrektomiczne szczury otrzymujące synbiotyk, Kontrola: pozornie nefrektomizowane szczury.
2.4.Analiza histologiczna wykazała, że podawanie sybiotyku zmniejszało postęp PChN
Pod koniec eksperymentu szczury poddano eutanazji w celu uzyskania próbek z lewej strony.Nerkii serca do przetworzenia do analizy histologicznej. Obszar zwłóknienia został określony przez plamę trichromową Massona (MT) za pomocą narzędzia informatycznego Image-Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) w celu obliczenia procentu uszkodzonego (tj. Zwłóknienia) obszaru (Tabela 2) oraz za pomocą mikroskopii wzbudzenia dwufotonowego, metody, która wykrywa kolagen poprzez emisję dwóch fotonów, powodując, że kolagen generuje drugą harmoniczną, które można wizualizować za pomocą mikroskopii konfokalnej uzyskując określony obraz zbliżony do organizacji i dystrybucji kolagenu wewnątrz tkanki. Porównując obszary zwłóknieniowe nerek, ocenione przez plamę MT, można było zaobserwować, że obszary zwłóknieniowe były o 25% większe w grupie Nef, ale tylko o 12% większe w grupie Lac, podawały snbiotyk w porównaniu do zwierząt kontrolnych poddanych pozorowanej nefrektomii. Zmiany obserwowane podczas tej procedury barwienia znajdowały się w warstwie ciemieniowej kapsułki Bowmana i błonie podstawnej bliższych i dystalnych zawiłych kanalików zwierząt z grup Nef i Lac. W przypadku grupy Nef, w tym zwierząt, którym nie podawano synbiotyku, zaobserwowano utratę cytoplazmy komórek zawiłych kanalików przy jednoczesnym rozwoju tkanki zwłóknieniowej. Kiedy tkanki nerek zostały przeanalizowane za pomocą mikroskopii wzbudzenia dwufotonowego, kolagen zaobserwowano we wszystkich próbkach o konformacji typu siatki. Grupy Nef i Lac wykazały więcej zmian niż grupa kontrolna, w której znaleziono tylko jeden obszar zwłóknieniowy (ryc. 4). Nie stwierdzono żadnych zmian w krwinkach nerek w żadnej próbce, gdy obserwowano je pod mikroskopią wzbudzenia dwufotonowego.
Tabela 2.Procent obszaru zwłóknieniowego w trichromie Massona zabarwionegonerkasekcje histologiczne. Wyniki są wyrażone jako średnia + błąd standardowy.
 |  |
| Ryc. 3.Wartości hematokrytu szczurów Sprague-Dawley pod koniec 16-tygodniowego podawania synbiotyku. Nef: nefrektomizowane szczury nie otrzymujące synbiotyku, Lac: nefrektomiczne szczury otrzymujące synbiotyk, Kontrola: pozornie nefrektomizowane szczury. | Ryc. 4.Histologiczne odcinki nerek szczurów Sprague-Dawley. (A-C):Trichromowa plama Nefronów Massona. Obszary zwłóknieniowe obserwuje się na niebiesko (strzałki). (D-F): ta sama tkanka obserwowana za pomocą mikroskopii wzbudzenia dwufotonowego. Tkankę zwłóknieniową obserwuje się na zielono. Nef: nefrektomizowane szczury nie otrzymujące synbiotyku, Lac: nefrektomiczne szczury otrzymujące synbiotyk, Kontrola: pozornie nefrektomizowane szczury. Pasek skali∶ 100 μum dla mikrografów (A-C) i 50 μm dla mikrografów (D-F). |
2.5.Podanie synbiotyku nie osłabiło zwłóknienia kardowego
W sercu plama MT wykazała obecność obszarów zwłóknieniowych w tkance nefrektomizowanych szczurów, podczas gdy obszary te były nieobecne u zwierząt kontrolnych. Indukcja PChN u szczurów powoduje zwłóknienie serca, któremu nie zapobiegło podawanie leczenia synbiotycznego u nefrektomicznych szczurów (ryc. 5).
Ryc. 5.Trichromowe (MT) barwienie przez Massona serca szczurów Sprague-Dawley. Obszary zwłóknieniowe są zabarwione na niebiesko (strzałki). Nef: nefrektomizowane szczury nie otrzymujące synbiotyku, Lac: nefrektomiczne szczury otrzymujące synbiotyk. Kontrola: szczury poddane nefrektomii. Pasek skali 100 um.
