CZĘŚĆ A Frakcja Cistanches Herba/𝛽-sitosterol powoduje wrażliwą na redoks indukcję rozprzęgania mitochondriów i aktywację kinazy białkowej zależnej od monofosforanu adenozyny/receptor aktywowany przez proliferatory peroksysomów i koaktywator-1 w miotubach C2C12: możliwy mechanizm ważenia Efekt redukcji

Hoi Shan Wong, Jihang Chen, Pou Kuan Leong, Hoi Yan Leung, Wing Man Chan i Kam Ming Ko

Wydział Nauk Przyrodniczych, Uniwersytet Nauki i Technologii w Hongkongu, Kowloon, Hongkong

Correspondence should be addressed to Kam Ming Ko; bcrko@ust.hk

Otrzymano 29 sierpnia 2014 r.; Zaakceptowano 14 stycznia 2015 Redaktor akademicki: Man Li Copyright © 2015

Hoi Shan Wong i in. Jest to artykuł z otwartym dostępem rozpowszechniany na licencji Creative Commons Attribution License, która zezwala na nieograniczone używanie, dystrybucję i powielanie na dowolnym nośniku, pod warunkiem prawidłowego cytowania oryginalnego dzieła. Wcześniejsze badania wykazały, że HCF1, częściowo oczyszczona frakcjaCistanches Herba, powoduje zmniejszenie masy ciała u myszy karmionych normalną dietą i dietą wysokotłuszczową. Zmniejszenie masy ciała było związane z indukcją rozprzęgania mitochondriów i zmianami aktywności enzymów metabolicznych w mięśniu szkieletowym myszy. Aby dokładniej zbadać mechanizm biochemiczny leżący u podstaw redukcji masy ciała indukowanej przez HCF1-, zbadano wpływ HCF1 i jego aktywnego składnika, 𝛽-sitosterolu (BSS), na miotubule C2C12. Inkubacja z HCF1/BSS spowodowała przejściowy wzrost potencjału błony mitochondrialnej (MMP), prawdopodobnie poprzez fluidyzację błony wewnętrznej mitochondriów. Wzrostowi MMP towarzyszył wzrost produkcji mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS). Z kolei mitochondrialne ROS wywołały wrażliwą na redoks indukcję rozprzęgania mitochondriów przez rozprzęganie białka 3 (UCP3). Analiza biochemiczna wykazała, że ​​HCF1 był zdolny do aktywacji szlaku kinazy białkowej zależnej od monofosforanu adenozyny/koaktywatora 𝛾 receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów-1, a tym samym zwiększał ekspresję oksydazy cytochromu c i UCP3. Badania na zwierzętach z użyciem sprzęgacza mitochondrialnego również potwierdziły rolę rozprzęgania mitochondriów w redukcji masy ciała wywołanej przez HCF1-. Podsumowując, HCF1/BSS powoduje wrażliwą na redoks indukcję rozprzęgania mitochondriów i aktywację AMPK/PGC-1 w miotubulach C2C12, z wynikającą z tego redukcją masy ciała i otyłości poprzez zwiększone zużycie energii.

Aby uzyskać więcej informacji prosimy o kontakt:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ma wiele efektów, kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

1. Wstęp

Otyłość, która jest definiowana jako nienormalne nagromadzenie tkanki tłuszczowej, pojawiła się jako zagrożenie dla zdrowia publicznego. Stwierdzono, że niezależnie od stanu metabolicznie zdrowego lub upośledzonego metabolicznie otyłość wiąże się ze zwiększonym ryzykiem chorób współistniejących i śmiertelności [1]. Otyłość centralna, nieprawidłowości w profilach cholesterolu i podwyższone poziomy triglicerydów w osoczu, które są wspólnymi cechami osób otyłych, przyczyniają się do wysokiej zachorowalności na cukrzycę typu 2, choroby sercowo-naczyniowe, zgon z przyczyn innych niż sercowo-naczyniowe i nowotwory związane z otyłością u osób otyłych [ 2]. Dlatego też zmniejszenie masy ciała i otyłości zostało uznane za kluczowe w zapobieganiu skutkom zdrowotnym związanym z otyłością. W leczeniu otyłości kładzie się nacisk głównie na ustanowienie optymalnego bilansu energetycznego poprzez zwiększenie wydatku energetycznego i/lub zmniejszenie spożycia energii. Modyfikacje stylu życia, w tym zwiększenie aktywności fizycznej i rozwój zdrowych nawyków żywieniowych, są ogólnie uważane za bezpieczne metody wywoływania utraty wagi. Jednak ogólnie uznano, że takie podejścia są nieskuteczne. Medycyna alternatywna w celu zwiększenia wydatkowania energii lub zmniejszenia spożycia energii [3]. Dlatego strategie oparte na wykorzystaniu środków farmakologicznych są obecnie aktywnie badane. W związku z tym nasze poprzednie odkrycie wykazało, że HCF1, częściowo oczyszczona frakcjaCistanchesHerba(suszona cała roślina zCistanche deserticolaYC Ma, scharakteryzowany jako zioło wzmacniające Yang w tradycyjnej medycynie chińskiej), okazał się skuteczny w zapobieganiu otyłości wywołanej dietą i związanym z nią nieprawidłowościom metabolicznym [4]. Doustne podawanie HCF1 powodowało zmniejszenie masy ciała myszy karmionych dietą normalną (ND-) i dietą wysokotłuszczową (HFD- ), prawdopodobnie przez indukcję rozprzęgnięcia mitochondriów w mięśniach szkieletowych, co prowadziło do zwiększenia wydatku energetycznego [4 ]. Jednak mechanizm leżący u podstaw takiego rozprzęgnięcia mitochondriów wywoływanego przez HCF1- (a tym samym zmniejszenie masy ciała) pozostaje niejasny. Rozprzęganie mitochondrialne rozprasza gradienty protonów poprzez wprowadzenie alternatywnego szlaku przewodnictwa protonowego przez wewnętrzną błonę mitochondrialną (IMM), co prowadzi do zmniejszenia potencjału błony mitochondrialnej i generowania mitochondrialnego ATP. Ten daremny cykl transportu protonów pochłania dużą część energii metabolicznej w różnych tkankach i jest odpowiedzialny za znaczną część dziennego wydatkowania energii, z późniejszym wzrostem wykorzystania cząsteczek paliwowych (takich jak kwasy tłuszczowe), powodując w ten sposób utratę wagi i zmniejszenie otyłości [5, 6]. Aby potwierdzić mitochondrialny efekt rozprzęgania wytwarzany przez HCF1, wpływ HCF1 na ekspresję MMP i UCP3 zbadano w miotubulach C2C12, które są zróżnicowanymi komórkami mięśniowymi pochodzącymi z mięśnia uda myszy C3H. Naszym celem było zbadanie mechanizmu biochemicznego leżącego u podstaw redukcji masy ciała zapewnianej przez HCF1. Dla porównania zbadano również 𝛽-sitosterol (BSS), aktywny składnik HCF1. Możliwy udział rozprzęgnięcia mitochondrialnego w indukowanym przez HCF 1- zmniejszeniu masy ciała u otyłych myszy karmionych HFD był dalej badany przez jednoczesne podawanie HCF1 ze sprzęgaczem chemicznym, 6-ketocholestanolem (kCh). Kinaza białkowa zależna od monofosforanu adenozyny (AMPK), powszechnie eksprymowana kinaza białkowa serynowo/treoninowa, stanowi ważny ośrodek kontroli metabolizmu energii w komórce. Po aktywacji AMPK integruje sygnały wewnątrz/z zewnątrzkomórkowe i wywołuje odpowiedzi komórkowe poprzez pośrednictwo różnych komórkowych kaskad sygnalizacyjnych [7, 8]. AMPK jest zdolna do modulowania metabolizmu komórkowego poprzez regulowanie aktywności enzymów metabolicznych poprzez bezpośrednią fosforylację. AMPK wywołuje również długoterminowe skutki na poziomie transkrypcyjnym poprzez fosforylację 𝛾koaktywatora-1 receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PGC-1), co prowadzi do adaptacyjnych zmian w ekspresji genów związanych z metabolizmem energetycznym i funkcją mitochondriów [9, 10]. W związku z tym zbadaliśmy również wpływ HCF1/BSS na szlak sygnałowy AMPK/PGC-1 w miotubulach C2C12.

cistancheKorzyści z Deserticoli

2. Materiały i metody

2.1. Ekstrakcja ziołowa.

Cistanches Herba, suszona cała roślina zCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae) został zakupiony od lokalnego sprzedawcy ziół (Lee Hoong Kee). Zioło zostało uwierzytelnione przez dostawcę, a wzór kuponu (HKUST00301) został zdeponowany w Wydziale Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Nauki i Technologii w Hongkongu (HKUST). ACistanchesEkstrakt z ziół otrzymano przez ekstrakcję etanolem zmielonego materiału ziołowego przez ogrzewanie w temperaturze wrzenia w temperaturze 78∘C przez 2 godziny, jak opisano wcześniej [11], z wydajnością wynoszącą 14% (wag./wag.). Ekstrakt dalej frakcjonowano stosując chromatografię na żelu krzemionkowym [12]. HCF1 otrzymano z wydajnością 1,14% (wag./wag.). Ekstrakt suszono przez odparowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 50∘C, a wysuszony ekstrakt przechowywano w temperaturze -20∘C przed użyciem.

2.2. Chemikalia.

Przeciwciało przeciw 𝛽-aktynie, BSS (CAS 83-46- 5), koktajl inhibitorów proteazy i koktajl inhibitorów fosfatazy 3 zakupiono od Sigma (St Louis, MO). Przeciwciało anty-AMPK𝛼1/2, przeciwciało anty-p-AMPK𝛼1/2, przeciwciało anty PGC-1 (H-300), przeciwciało anty-UCP3 (E-18), {{16} }[4- (2-piperydyna-1-ylo-etoksy)-fenyl)]-3-pirydyn-4-ylo-pirrazolo[1,5-a ]-pirymidynę (CC) i 6-ketocholestanol (kCh) zakupiono z Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Przeciwciało anty-COX zakupiono od Cell Signaling (Danvers, MA). Przeciwciało anty-lamina B1 zakupiono z Abcam (Cambridge, MA). Odczynnik do testu Bio-Rad zakupiono z Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, USA). Wszystkie inne chemikalia zakupiono w firmie Sigma (St. Louis, MO, USA).

2.3. Hodowlę komórkową.

C2C12, kultura mioblastów pochodzących z mięśni szkieletowych myszy C3H [13] z American Type Culture Collection (ATCC), została udostępniona dzięki uprzejmości profesora Zhenguo Wu (Wydział Nauk Przyrodniczych, HKUST). Linię komórkową hodowano w pożywce Eagle'a w modyfikacji Dulbecco (DMEM) (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY), uzupełnionej 10% (obj./obj.) płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 IU/ml penicyliny i 100 µg /ml streptomycyny i 17 mM NaHCO3. Różnicowanie mioblastów C2C12 do miotubul C2C12 indukowano przez zastąpienie kompletnej pożywki hodowlanej pożywką różnicującą zawierającą 2% (v/v) surowicy końskiej (HS) zamiast 10% (v/v) FBS. Komórki hodowano w atmosferze 5% (obj./obj.) CO2 w powietrzu w temperaturze 37°C.

Cistanchemaefekt utraty wagi

2.4. Analizy biochemiczne w miotubulach C2C12

2.4.1. MMP.

Potencjał błony mitochondrialnej mierzono za pomocą fluorescencyjnego barwnika kationowego, jodku 5,5,6,6 -tetrachloro- 1,1,3,3 -tetraetylobenzimidazolilo-karbocyjaniny (JC- 1) [14]. Komórki hodowano w gęstości 1.0 × 104 komórek w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania. Po stabilnym przyłączeniu, komórki wybarwiono wstępnie 20 ?M JC-1 (rozpuszczonym w pożywce hodowlanej) w 37°C przez 10 min. Po wstępnym zabarwieniu komórki przemyto dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS), uzupełnionym 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Pomiar MMP rozpoczęto przez dodanie pożywki zawierającej HCF1/BSS. Ilość agregatu J cząsteczek JC-1, który tworzy się w błonie wewnętrznej mitochondriów o wysokim potencjale błonowym, określono poprzez monitorowanie czerwonej fluorescencji JC-1 (Ex 485 nm/Em 580 nm) Dowód -Oparta na medycynie komplementarnej i alternatywnej 3 w 37°C przez 1 godz. MMP oszacowano przez odjęcie intensywności fluorescencji próbek ślepych (tj. zawierających tylko pożywkę) od intensywności fluorescencji badanych próbek. Wartości MMP komórek inkubowanych z HCF1/BSS znormalizowano względem odpowiednich wartości kontrolnych nieinkubowanych z HCF1/BSS i wyrażono jako procent kontroli.

2.4.2. Aktywacja kinazy białkowej zależnej od monofosforanu adenozyny (AMPK).

Miotubki C2C12 wysiano (1,5 x 105 komórek) na 6-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania. Po stabilnym przyłączeniu komórki wstępnie inkubowano z pożywką zawierającą HCF1/BSS przez 8 godzin. Wstępnie inkubowane komórki poddano następnie lizie za pomocą 300 µl buforu do lizy siarczanu dodecylosiarczanu sodu (SDS-) (20 mM Tris-Cl, 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 3 mM kwasu glikolowego etylenowo-tetraoctowego (EGTA), 1% (w/ v) Triton X- 100, 10% (wag./obj.) glicerol, 5% SDS, 1 mM ditiotreitol (DTT), koktajl inhibitorów proteazy i koktajl inhibitorów fosfatazy 3, pH 7,5). Lizat dalej wirowano przy 12000 xg w 4°C przez 10 min w celu usunięcia resztek komórek. Zakres aktywacji AMPK oszacowano na podstawie względnego stosunku fosfor-AMPK𝛼 (p-AMPK) i AMPK𝛼 za pomocą analizy Western blot przy użyciu przeciwciała anty-p-AMPK𝛼1/2 i przeciwciała anty-AMPK𝛼1/2 po analizie SDS-PAGE, z żel rozdzielający 10 procent (obj./obj.) akryloamidu. Załadowano lizat komórkowy (20 ?g) i ?-aktynę zastosowano jako marker odniesienia. Prążki białek barwionych immunologicznie analizowano densytometrycznie (Quantiscan, Biosoft), a ilości (jednostki arbitralne) p-AMPK𝛼 i AMPK𝛼 normalizowano w odniesieniu do poziomu 𝛽-aktyny (jednostki arbitralne) w próbce.

2.4.3. PGC-1 Translokacja Jądrowa.

Miotubki C2C12 hodowano przy gęstości komórek 20×106 na płytkach hodowlanych 100 mm. Po 8 godzinach wstępnej inkubacji HCF1/BSS komórki trypsynizowano i inkubowano z 1 ml lodowatego buforu hipotonicznego (10 mM HEPES, 1,5 mM KCl i 1,5 mM MgCl2, pH 7,9) w 4∘C przez 10 min. Po inkubacji komórki zebrano przez odwirowanie przy 500 xgw 4°C przez 10 min. Zebrane komórki ponownie zawieszono w 300 ?l buforu hipotonicznego, uzupełnionego 0,5 mM DTT, 0,1% (wag./obj.) nonylofenoksy-polietoksyletanolem (NP-40) i koktajlem inhibitorów proteazy, aby ułatwić ekstrakcję rozpuszczalnych białek cytozolowych . Powstały lizat wirowano przy 12000 xgw 4°C przez 1 min, aby uzyskać frakcję cytozolową (supernatant) i jądrową (peletka). Izolację białek jądrowych osiągnięto przez inkubację osadu z 25 ?l lodowatego buforu hipertonicznego (20 mM HEPES, 25% (wag./obj.) glicerolu, 400 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT i Koktajl inhibitora proteazy, pH 7,9) w 4°C przez 30 min, a następnie wirowanie przy 12000 xg w 4°C przez 5 min. Zakres translokacji jądrowej PGC-1 oszacowano na podstawie względnego stosunku poziomu PGC-1 we frakcjach cytozolowej i jądrowej, stosując analizę Western blot po analizie SDS-PAGE, jak opisano powyżej. Załadowano zarówno frakcję cytozolową, jak i jądrową (20 μg), przy czym jako cytozolowe i jądrowe markery odniesienia zastosowano odpowiednio 𝛽-aktynę i laminę B1. Ilości (jednostki arbitralne) PGC-1 zostały znormalizowane w odniesieniu do poziomów odpowiednio 𝛽-aktyny i laminy B1 (jednostki arbitralne) w próbce.

2.4.4. Ekspresja mitochondrialnego białka rozprzęgającego 3 (UCP3) i oksydazy cytochromu c (COX).

Miotubki C2C12 wysiano (2.0 x 106 komórek) na 100 mm płytkach hodowlanych. Po stabilnym przyłączeniu komórki wstępnie inkubowano z pożywką zawierającą HCF1/BSS w 37°C przez 48 godzin. Po usunięciu pożywki zawierającej HCF1/BSS, komórki poddano trypsynizacji i lizie przez dodanie 300 µl buforu do lizy SDS. Lizat komórkowy wirowano przy 12000 xgw 4°C przez 10 min w celu usunięcia resztek komórek. Poziomy UCP3 i COX w supernatancie określono za pomocą analizy Western blot przy użyciu przeciwciała anty-UCP3 (E- 18) i przeciwciała anty-COX po analizie SDS-PAGE, jak opisano powyżej. Załadowano lizat komórkowy (50 ?g) i 𝛽-aktynę zastosowano jako marker odniesienia. Ilości (jednostki arbitralne) UCP3 i COX znormalizowano w odniesieniu do poziomu 𝛽-aktyny (jednostki arbitralne) w próbie.

2.5. Opieka nad zwierzętami.

Myszy ICR (8 tygodni; 30 do 35 g dla samców i 25 do 30 g dla samic) utrzymywano w 12-godzinnym cyklu ciemno/światło w środowisku kontrolowanym powietrze/wilgotność w około 22∘C i pozwalano na jedzenie i wodę ad libitum w Instytucie Opieki nad Zwierzętami i Roślinami (APCF) na Uniwersytecie Nauki i Technologii w Hongkongu (HKUST). Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Research Practice Committee (HKUST) (numer zatwierdzenia protokołu zwierzęcego 2013049; data zatwierdzenia: 25 września 2013; czas trwania eksperymentu: 3 lata).

2.6. Protokół leczenia.

Aby zbadać wpływ 6-keto-cholestanolu (kCh) na redukcję masy ciała indukowaną przez HCF1- u myszy karmionych HFD, zwierzęta losowo przydzielono do 6 grup, po 10–15 myszy w każdej: (1 ) dieta normalna (ND, 13 procent energii pochodzącej z tłuszczu, zakupiona od LabDiet, numer produktu 5010); (2) ND plus kCh (w dziennej dawce 9 mg/kg); (3) kontrola HFD (60 procent energii pochodzącej z tłuszczu; zakupiona od Research Diet Inc., numer produktu D12492); (4) HFD plus HCF1 (w dziennej dawce 45 mg/kg); (5) HFD plus kCh; oraz (6) HFD plus HCF1 plus kCh. Wykazano, że HCF1 w dziennej dawce 45 mg/kg powoduje znaczną redukcję masy ciała samców myszy [4], podczas gdy kCh w dziennej dawce 9 mg/kg znosi HCF1- indukowany efekt rozprzęgania w mitochondriach izolowanych z mięśnia szkieletowego myszy (dane nie pokazane). Zwierzętom podawano dożołądkowo kCh, HCF1 lub HCF1/kCh, 5 dni w tygodniu przez 8 tygodni (tj. w sumie 40 dawek). Myszy kontrolne otrzymywały tylko nośnik (oliwa z oliwek). Masę ciała i spożycie pokarmu myszy monitorowano co tydzień w trakcie doświadczenia. Zmiany masy ciała określono ilościowo przez obliczenie powierzchni pod krzywą (AUC) wykresu wykreślającego procent początkowej masy ciała w funkcji czasu (tydzień 1 do 8) i wyrażono w jednostkach arbitralnych. Myszy uśmiercono przez zwichnięcie szyjki macicy 24 godziny po ostatniej dawce (z kCh, HCF1 lub HCF1/kCh) po całonocnym poście. Próbki mięśnia brzuchatego łydki wycięto do pomiaru oddychania mitochondrialnego. Wycięto i zważono poduszeczki tłuszczowe (tłuszcz gonadalny, zaotrzewnowy i krezkowy). Oszacowano stosunek ciężaru poszczególnych poduszek tłuszczowych do masy ciała i wyrażono jako „wskaźnik poduszek tłuszczowych”.

Cistancheto naturalne zioło o działaniu odchudzającym

2.7. Analizy biochemiczne u myszy

2.7.1. Przygotowanie próbek.

Rozdrobnione tkanki mięśnia brzuchatego łydki zmieszano z 10 ml roztworu kolagenazy (00,075 procent (wag./obj.)) w buforze (100 mM KCl, 50 mM MOPS, pH 7,2) i mieszaniny poddano inkubowano w 4∘C przez 20 min. Trawione mieszaniny tkanek wirowano przy 600 xg w 4°C przez 20 min. Supernatant usunięto; strawione tkanki zmieszano z 20 ml lodowatego buforu do homogenizacji (50 mM sacharoza, 200 mM mannitol, 5 mM KH2PO4, 1 mM EGTA i 5 mM MOPS, pH 7,2) i homogenizowano na lodzie za pomocą homogenizatora ze szkła teflonowego przy 4000 obr./min dla 25 do 30 pełnych skoków. Homogenaty następnie wirowano przy 600 xgw 4°C przez 10 min, uzyskując frakcję wolną od jąder (supernatant). Peletki mitochondrialne przygotowano z homogenatów mięśniowych przez wirowanie przy 9200 xgw 4°C przez 30 min. Frakcje mitochondrialne otrzymano przez zawieszenie osadu w buforze zawierającym 125 mM KCl, 10 mM Tris-Base, 2 mM KH2PO4, 0,5 mM EGTA i 20 mM MOPS, pH 7,5 [15].

2.7.2. Oddychanie mitochondrialne.

Tempo oddychania w mitochondriach izolowanych z mięśnia szkieletowego myszy określano w sposób opisany przez Wonga i Ko [12]. W skrócie, oddychanie mitochondrialne mierzono polarograficznie za pomocą elektrody typu Clark (Hansatech Instruments, Norfolk) w temperaturze 30 C. Frakcje mitochondrialne (1 mg białka/ml) inkubowano w buforze oddechowym (3{{17}). } mM KCI, 6 mM MgCI2, 75 mM sacharoza, 1 mM EDTA i 20 mM KH2PO4, pH 7,0). Dodano roztwór substratu zawierający 15 mM pirogronian sodu i 5 mM jabłczan sodu. Po zrównoważeniu zainicjowano oddychanie stanu 3 przez dodanie ADP (stężenie końcowe 0,6 mM). Gdy cały dodany ADP został zużyty do wytworzenia ATP, dodano oligomycynę w celu wywołania oddychania w stanie 4. Współczynnik kontroli oddechu (RCR) oszacowano obliczając stosunek częstości oddechów w stanie 3 do 4 [16].

2.7.3. Mitochondrialna ekspresja UCP3 w mięśniach szkieletowych myszy.

Poziomy mitochondrialnego UCP3 oszacowano za pomocą analizy Western blot przy użyciu przeciwciała anty-UCP3 (E-18) po analizie SDS PAGE frakcji mitochondrialnej, przy użyciu żelu rozdzielającego zawierającego 10% akryloamidu. Frakcje mitochondrialne wyizolowane z mięśnia szkieletowego myszy (~60 ?g) nałożono na żel, a oksydazę cytochromu c (COX) zastosowano jako marker referencyjny. Wybarwione immunologicznie prążki białkowe analizowano densytometrycznie i ilości (jednostki arbitralne) UCP3 znormalizowano w odniesieniu do poziomu COX (jednostki arbitralne) w próbce.

2.8. Test białka.

Stężenia białka określono przy użyciu zestawu do oznaczania białek Bio-Rad. Porcję (10 ?L) próbki lizatu mitochondrialnego/komórkowego rozcieńczono 40 ?L wody. Porcję (10 ?l) rozcieńczonej próbki dodano następnie do dołka 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania, po czym dodano 200 ?l rozcieńczonego odczynnika testowego Bio-Rad (5-krotne rozcieńczenie). Mieszaninę pozostawiono w temperaturze pokojowej na 5 minut, a następnie zmierzono absorbancję mieszaniny reakcyjnej przy 570 nm. Stężenie białka określono z krzywej kalibracyjnej, stosując jako standard albuminę surowicy bydlęcej (BSA).

2.9. Analiza statystyczna.

Wszystkie dane wyrażono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM), o ile nie określono inaczej. Dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (jednoczynnikowa ANOVA), o ile nie określono inaczej, a różnice międzygrupowe wykryto za pomocą testu zakresu Tukeya, z 𝑃<>

CistancheDeserticola mawiele efektów

3. Wyniki

3.1. Wpływ HCF1/BSS na MMP w miotubulach C2C12.

Inkubacja chemicznego środka rozprzęgającego, cyjanku karbonylu {{0}} (trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP), w stężeniu 1 𝜇M, spowodowała zależną od czasu redukcję MMP, przy czym zakres redukcji wyniósł 29% przy koniec pomiaru (rysunki 1 i 2). W przeciwieństwie do tego, HCF1 i BSS, w stężeniach 30 ng/ml i 10 𝜇M, zwiększały MMP odpowiednio o 5 i 4 procent w ciągu pierwszych 10 minut inkubacji HCF1/BSS (ryc. 1 i 2) . Po początkowych wzrostach wywołanych HCF1/BSS następowały stopniowe spadki MMP odpowiednio do 95 i 93% odpowiedniej wartości początkowej pod koniec pomiaru (60 minut inkubacji HCF1/BSS) (Figury 1 i 2). Zmiany w MMP wywołane HCF1/BSS scharakteryzowano przez zastosowanie specyficznych inhibitorów. Rotenon (0,1 nM), inhibitor mitochondrialnego kompleksu I, oraz cholesterol (0,3 ?M), środek wzmacniający sztywność błony, hamowały zmiany MMP indukowane przez HCF1/BSS w trakcie pomiaru (Figury 1 i 2). Z drugiej strony, koinkubacja ze specyficznym inhibitorem UCP, GDP, sprzęgaczem chemicznym, 6-ketocholestanolem (kCh) lub przeciwutleniaczem, dimetylotiomocznikiem (DMTU), zmniejszyła redukcję wywołaną przez HCF1- MMP w późniejszym czasie inkubacji HCF1 (ryc. 1). GDP, kCh i DMTU zmniejszyły również wywołane przez BSS zmniejszenie MMP w późniejszym czasie inkubacji BSS, przy wartości MMP wynoszącej 110 procent w porównaniu z odpowiednią kontrolą dopasowaną w czasie (Rysunek 2)

3.2. Wpływ HCF1/BSS na aktywację AMPK w miotubulach C2C12.

Wpływ HCF1 na AMPK badano mierząc stosunek ufosforylowanej AMPK𝛼 (p-AMPK𝛼) do całkowitej AMPK𝛼 (AMPK𝛼), co wskazuje na zakres aktywacji AMPK. Inkubacja z HCF1 w stężeniach 30 i 100 ng/ml powodowała zależny od czasu wzrost aktywacji AMPK, przy czym zakres tych wzrostów wynosił odpowiednio 32 i 43% po 8 godzinach inkubacji HCF1, w porównaniu z odpowiednim czasem. dopasowana kontrola (rysunek 3). Równolegle do HCF1 preinkubacja z BSS (10 µM) znacząco zwiększyła zakres aktywacji AMPK o 25% w porównaniu z niepreinkubowaną kontrolą (Figura 5). Aktywacja AMPK indukowana przez HCF1/BSS w miotubulach C2C12 została całkowicie zniesiona przez koinkubację z kCh (odsprzęgacz) lub DMTU (ryc. 4 i 5, tabele 1 i 2 materiałów uzupełniających dostępnych online

3.3. Wpływ HCF1/BSS na translokację jądrową PGC-1 w miotubulach C2C12.

Aktywacja PGC-1 może być mierzona pośrednio przez zakres translokacji jądrowej PGC-1. Preinkubacja z HCF1 i BSS znacząco zwiększyła translokację jądrową PGC-1 odpowiednio o 25 i 28 procent, o czym świadczą podwyższone stosunki PGC-1 w jądrze do cytoplazmy (Figury 6 i 7). Specyficzny inhibitor AMPK, 6-[4-(2-piperydyna-1-ylo-etoksy)-fenylo)]-3-pirydyna-4-ylpirrazolo[ 1,5-a]-pirymidyna (CC), w stężeniu 10 𝜇M hamowała indukowany przez HCF1/BSS wzrost translokacji jądrowej PGC-1 odpowiednio o 156 i 235 procent w miotubulach C2C12 ( Tabele 1 i 2). Indukowanej przez HCF1/BSS translokacji jądrowej PGC-1 również zapobiegano przez koinkubację z kCh lub DMTU (Figury 6 i 7, Tabele 1 i 2 Materiału Uzupełniającego).

3.4. Wpływ HCF1/BSS na mitochondrialną ekspresję UCP3 i oksydazy cytochromu c (COX) w miotubach C2C12.

Aby określić znaczenie aktywacji indukowanej HCF1/BSS w szlaku AMPK/PGC-1, wpływ HCF1/BSS na rozprzęganie i biogenezę mitochondriów, oceniany na podstawie poziomów UCP3 i COX (wiarygodny wskaźnik masy mitochondrialnej w komórkach). Preinkubacja z HCF1/BSS znacząco zwiększyła poziomy mitochondrialnego UCP3 i COX, przy czym zakres tego wzrostu wynosi 37 i 23 procent (w miotubulach inkubowanych z HCF1-) (ryc. 8) oraz 52 i 24 procent (w miotubulach inkubowanych BSS ) (Figura 9), odpowiednio, w porównaniu z odpowiednią niepreinkubowaną kontrolą. Wywołanym przez HCF1/BSS podwyższeniom poziomów UCP3 i COX całkowicie zapobiegano przez koinkubację HCF1 z kCh, DMTU lub

CC (tabele 1 i 2 materiałów uzupełniających). Należy zauważyć, że stężenia kCh i CC stosowane w tym eksperymencie dostosowano odpowiednio do 20 i 1 ?M, aby uniknąć cytotoksycznego wpływu kCh i CC na miotubule C2C12 (obserwacja nieopublikowana).

3.5. Rola rozprzęgnięcia mitochondriów w redukcji masy ciała wywołanej przez HCF1- u otyłych myszy wywołanych przez HFD.

Możliwa rola rozprzęgania mitochondriów w redukcji masy ciała wywołanej przez HCF1- była dalej badana przy użyciu sprzęgacza chemicznego kCh (Tabela 3 w Materiałach Uzupełniających). HCF1 indukował rozłączenie mitochondrialne w mysich mięśniach szkieletowych, o czym świadczy zmniejszenie wskaźnika mitochondrialnej kontroli oddechowej (RCR) i wzrost ekspresji mitochondrialnego UCP3, zarówno u myszy karmionych ND, jak i HFD. kCh per se (w dziennej dawce 9 mg/kg) znacząco zwiększył mitochondrialne RCR o 23% u myszy karmionych ND (ale nie u myszy karmionych HFD). Rozprzęganie mitochondrialne indukowane przez HCF1-u myszy karmionych HFD było całkowicie hamowane przez jednoczesne traktowanie kCh. HCF1 powodował zmniejszenie masy ciała myszy karmionych zarówno ND, jak i HFD. Efekt ten był związany z tłumieniem indukowanego przez HFD wzrostu wskaźnika trzewnej tkanki tłuszczowej. W przeciwieństwie do HCF1, kCh nie powodował wykrywalnego wpływu na przyrost masy u zwierząt ND- i HFD podczas 8-tygodniowego przebiegu doświadczenia. Jednoczesne podawanie kCh z HCF1 znosiło indukowane przez HCF 1- efekty hamujące na indukowany przez HFD wzrost masy ciała i wskaźnika trzewnej tkanki tłuszczowej u myszy (Tabela 3 Materiału Uzupełniającego).