Część 1: Obniżenie poziomu Hsa-miR w nerkach-127-3p przyczynia się do nadmiernej aktywacji szlaku sygnałowego interferonu typu I w nerce w przebiegu toczniowego zapalenia nerek

Po więcej informacji. kontakttina.xiang@wecistanche.com

MikroRNA są zaangażowane w patogenezę tocznia rumieniowatego układowego (SLE) i rozregulowane wnerkipacjentów z toczniowym zapaleniem nerek (LN), ale ich patogenne role w LN są w dużej mierze nieznane. Kinaza Janusa 1 (JAK1) pośredniczy w aktywacji dalszych ścieżek sygnałowych wieluzapalnycytokiny, w tym szlak sygnałowy interferonu typu I (IFN-I), który ma kluczowe znaczenie dla rozwoju SLE i LN. Zatem JAK1 jest silnym celem terapeutycznym dla tych?choroby autoimmunologiczne. Niewiele jest jednak badań wykazujących rozregulowanie JAK1 w chorobach autoimmunologicznych i mechanizm molekularny, który za tym stoi. W tym zwięzłym raporcie pokazujemy hamujący wpływ hsa-miR-127-3p, mikroRNA, który jest regulowany w dół w tkankach nerek pacjentów z LN, na sygnalizację IFN-I. Odkryliśmy, że nadekspresja hsa-miR-127-3p może hamować indukcję ekspresji genów za pośrednictwem ISRE i GAS, fosforylację STAT1 i STAT2 oraz regulację w górę genów stymulowanych przez IFN (ISG) stymulowanych przez IFN-I. Podczas gdy antagonista hsa-miR-127-3p wzmacniał aktywację sygnalizacji IFN-I w pierwotnych komórkach mezangialnych nerki. Następnie zidentyfikowaliśmy JAK1 jako bona fide gen docelowy hsa-miR-127-3p i wykazaliśmy, że hsa-miR-127-3p kierował JAK1 przez wiązanie z jego 3'UTR i regionem kodującym. Konsekwentnie stwierdziliśmy, że regulacja w dół hsa-miR-127-3p była związana z regulacją w górę JAK1 i ISG w tkankach nerek pacjentów z LN. Nasze dane wskazują, że nerkowa regulacja w dół hsa-miR-127-3p przyczynia się do nadaktywacji szlaku sygnałowego IFN-I w nerkach pacjentów z LN poprzez promowanie ekspresji JAK1, co sugeruje naśladowanie hsa-miR-127-3p mogą być stosowane do hamowania szlaku sygnałowego JAK1 i IFN-I w LN.

Słowa kluczowe: mikroRNA, hsa-miR-127-3p, interferon typu I, kinaza Janus 1, toczeń rumieniowaty układowy, toczniowe zapalenie nerek
Załączone informacje:

Zgodnie z istniejącymi danymi badawczymi w środowisku akademickim można uznać, że funkcja immunoregulacyjna i funkcja przeczyszczająca tradycyjnej medycyny chińskiejCistanchema ogromne znaczenie kliniczne dla wzmocnienia odporności organizmu i powrotu do zdrowia pacjentów z COVID-19. Regulacja funkcji odpornościowych przez Cistanche odbywa się głównie poprzez następujące punkty:

Zwiększenie funkcjonalnej aktywności komórek odpornościowych organizmu (makrofagi, komórki dendrytyczne, limfocyty T, limfocyty B, komórki NK, itp.);

Wzmocnij przetwarzanie antygenu, fagocytozę i funkcje zabijania komórek odpornościowych; regulują wydzielanie cytokin i przeciwciał przez komórki odpornościowe;

Niektórzy uczeni przeprowadzili badania nad Cistanchepolisacharydyjako adiuwanta szczepionki i odkryli, że polisacharydy Cistanche mogą poprawić komórkową odpowiedź immunologiczną humoralnej odpowiedzi immunologicznej na szczepionkę przeciwko grypie, wykazując, że polisacharydy Cistanche mogą wzmacniaćfunkcja odpornościowa; Eksperci potwierdzili, że ma również pozytywny wpływ na regulację odporności.

Kliknij, aby dowiedzieć się więcej o korzeniu i ekstrakcie cistanche

WPROWADZANIE

Niewłaściwa i nadmierna produkcja pewnych zapalnych cytokinezy, krytycznych dla rozwoju tocznia rumieniowatego układowego (SLE). Blokowanie aktywacji dalszych ścieżek sygnalizacyjnych tych patogennych cytokin może być obiecującą strategią terapeutyczną dla SLE(1). Zgodnie z tym poglądem, antyfrolumab, przeciwciało monoklonalne przeciwko podjednostce 1 receptora interferonu typu I (IFN-I) (IFNAR1), okazał się obiecujący w leczeniu SLE poprzez blokowanie aktywacji szlaku sygnałowego IFN-I(2) , który jest krytyczny dla patogenezy SLE i toczniowego zapalenia nerek (LN)(3).

Kinazy Janusa (JAK) to kinazy tyrozynowe, wiążące się z wewnątrzkomórkowymi domenami receptorów cytokin i przekazujące sygnał aktywacji poprzez fosforylację transdukcji sygnału i aktywator czynników transkrypcyjnych (STAT) transkrypcji (TF). Szlak sygnałowy JAK-STAT jest wykorzystywany przez wiele cytokin, takich jak IFN-I, IL6 i IL10, które są zaangażowane w patogenezę chorób autoimmunologicznych, w tym SLE. Do leczenia chorób autoimmunologicznych opracowano drobnocząsteczkowe inhibitory JAK zdolne do jednoczesnego hamowania wielu szlaków sygnałowych cytokin (4). Warto zauważyć, że w porównaniu z inhibitorami pan-JAK pierwszej generacji, ostatnie badania pokazują, że wysoce selektywne inhibitory JAKI mogą również osiągnąć zadowalającą skuteczność terapeutyczną w przypadku kilku chorób autoimmunologicznych z mniejszym ryzykiem wywoływania działań niepożądanych(4,5), co wskazuje na istotną rolę JAK1 w rozwój chorób autoimmunologicznych. Jednak mniej badań koncentruje się na regulacji JAK1 podczas rozwoju chorób autoimmunologicznych, takich jak SLE czy LN.

MicroRNA (miRNA) to rodzaj małych niekodujących RNA. Poprzez komplementarne parowanie zasad ich regionu zarodkowego z 3'UTR lub regionem kodującym docelowego mRNA, miRNA rozpoznają i hamują ekspresję ich docelowych genów, a zatem regulują różne funkcje biologiczne(6). MiRNA zostały uznane za krytyczne regulatory odpowiedzi immunologicznych, a rozregulowanie miRNA jest zaangażowane w patogenezę SLE (7). Nasze poprzednie nerkowe profile miRNA ujawniły wiele rozregulowanych miRNA w tkankach nerek pacjentów z LN (8). Jednak funkcje tych rozregulowanych miRNA są w dużej mierze nieznane.

Tutaj przeprowadziliśmy badanie przesiewowe 9 konserwatywnych, regulowanych w dół miRNA w nerkach pacjentów z LN pod kątem ich ról regulacyjnych w ścieżce sygnalizacyjnej IFN-I i zidentyfikowaliśmy hsa-miR-127-3p jako negatywny regulator szlaku sygnalizacyjnego IFN-I, oraz zweryfikował tę rolę w komórkach mezangialnych nerek. Udowodniliśmy, że JAK1 jest prawdziwym celem hsa-miR-127-3p. Nasze dane sugerują, że obniżenie poziomu hsa-miR-127-3p przyczynia się do nadmiernej aktywacji szlaku sygnałowego IFN-I w tkankach nerek pacjentów z LN, a naśladownictwo hsa-miR-127-3p może służyć jako alternatywa dla JAKl inhibitor w leczeniu LN.

MATERIAŁY I METODY

Odczynniki

Uniwersalny interferon typu I pochodził z R&D Systems (Kat. 11200-1). miRNA naśladujące, naśladujące kontrole i zmutowany hsa-miR-127-3p (5'UgccuagCGUCUGAGCUUGGCU3') pochodziły z Gene-

Pharma.Hsa-miR-127-3p antagomir pochodził z firmy ReboBio. Szczegóły plazmidów są następujące:

Plazmidy reporterowe pISRE- i pGAS-lucyferazy pochodziły z Clontech Laboratories. Wektory psiCHECK2 i pRL-TK pochodziły z firmy Promega Biotech. a wektory pcDNA3.1 pochodziły z firmy Invitrogen.

Do konstrukcji plazmidu reporterowego psiCHECK2-JAK1-3'UTR, fragment (zawierający przewidywane miejsce wiązania hsa-miR-127-3p) ludzkiego JAK1 3'UTR był amplifikowany przy użyciu standardowych technik PCR (startery są wymienione w Tabeli S1), a następnie wstawiony do wektora psiCHECK2.

Do konstrukcji plazmidu reporterowego zmutowanego psiCHECK2-JAK1-3'UTR, przewidywane miejsce wiązania hsa-miR-127-3p (5'GATCTGA3')na psiCHECK2-JAK 1-3'Plazmid reporterowy UTR został zmutowany do (5'CTAGACT3') przy użyciu zestawu KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO) (startery są wymienione w Tabeli S1).

W celu skonstruowania plazmidu pcDNA3.1-JAKlt fragment (zawierający przewidywane miejsca wiązania hsa-miR-127-3p) regionu kodującego ludzką JAK1 amplifikowano przy użyciu standardowych technik PCR (startery wymieniono w tabeli S1), a następnie wstawiony do wektora pcDNA3.1(plus)-5'HA.

W celu konstrukcji pcDNA3.1-JAKlt-zmutowany plazmid, przewidywane miejsca wiązania hsa-miR-127-3p (5tcgAtcGgaGcctcaaga aggAtcTggt3') na pcDNA3.1-JAKlt zmutowano do (5 'tcgTtcCgaCcctcaagaaggTtcAggt3) przy użyciu zestawu KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO) (startery wymieniono w Tabeli S1).

Wszystkie plazmidy zweryfikowano przez sekwencjonowanie.

Hodowlę komórkową

Komórki Hela, komórki HepG2 i komórki K562 pochodziły z banku komórek, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Shanghai, Chiny. Komórki U4A ze zmutowanym JAK1(9) były darem od Y.Eugene Chin z Uniwersytetu Soochow. Przywierające komórki (Hela, HepG2 i U4A) hodowano w DMEM (Gibco) uzupełnionym 10% FBS (Gibco) i 100 ug/ml penicyliny-streptomycyny (Gibco). Zawiesinowe komórki (K562) hodowano w RPMI 1640（Gibco） z 10% FBS（Gibco） i 100 ug/ml penicyliny-streptomycyny (Gibco). Pierwotne ludzkie komórki mezangialne nerek (HRMCs) (kat. 4200, ScienCellTM Research Laboratories) hodowano w Mesangial Cell Medium (Cat.4201, ScienCellTM Research Laboratories) zgodnie z instrukcją producenta. Wszystkie komórki utrzymywano w 37°C w 5% CO2.

Transfekcja i stymulacja

W przypadku testu reporterowego lucyferazy komórki Hela lub HRMC wysiano na płytkę 96-dołkową i transfekowano reporterem ISRE- lub GAS-lucyferazy (100 ng/dołek), plazmidem pRL-TK (10 ng/dołek) wraz ze wskazanymi naśladowcami miRNA (100 nM) lub antagomiry (500 nM) przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 12 godzin później transfekowane komórki stymulowano interferonem Universal typu I (1000 U/ml) przez 8 godzin przed pomiarem.

W celu weryfikacji miejsc docelowych hsa-miR-127-3p w 3'UTR mRNA JAK1 komórki Hela wysiano na płytkę 96-studzienkową i transfekowano psiCHECK2-JAK1-3 Plazmidy 'UTR(lub psiCHECK2-JAK1-3'UTR-mutant lub psiCHECK2)(20ng/studzienkę)wraz ze wskazanymi naśladowcami miRNA (100nM) przy użyciu

Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Transfekowane komórki hodowano przez 24 godziny przed pomiarem.

Aktywność lucyferazy mierzono za pomocą Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega Biotech) zgodnie z instrukcją.

W celu weryfikacji miejsc docelowych hsa-miR-127-3p w regionie kodującym mRNA JAK1, komórki U4A wysiano na płytkę 6-studzienkową i transfekowano pcDNA3.1-JAKlt (lub pcDNA3. 1-Zmutowane plazmidy JAK1t) (lug/studzienkę) wraz ze wskazanymi naśladowcami miRNA (100 nM) przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

W innych celach komórki Hela lub HRMC transfekowano miRNA mimikami (100nM) lub antagomirami (500nM) przy użyciu Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen). 24 godziny później transfekowane komórki stymulowano interferonem Universal typu I (1000U/ml) przez 6 godzin (do oznaczania ilościowego mRNA lub mikromacierzy) lub przez 10 min lub 15 min (w przypadku analizy Western blot).

Kwantyfikacja ekspresji genu

Całkowity RNA wyekstrahowano odczynnikiem TRIzol (Invitrogen). cDNA zsyntetyzowano przy użyciu zestawu odczynników PrimeScript RT (Takara). Ekspresję genu oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu SYBR Premix ExTaq (Takara). RPL13a zastosowano jako gen odniesienia do ilościowego oznaczenia mRNA. Ekspresję hsa-miR-127-3p oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems). RNU48 zastosowano jako gen referencyjny do ilościowego oznaczenia miRNA. Amplifikację przeprowadzono w systemie ABI vii7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Wyrażenie względne zostało obliczone przy użyciu metody 2-. Współczynnik indukcyjności obliczono dzieląc względną ekspresję genu próbki w grupach eksperymentalnych (grupy naśladujące miRNA lub grupy z transfekcją antagomir ze stymulacją IFN-I) przez względną ekspresję tego samego genu w niestymulowanej próbce kontrolnej (bez transfekcji, bez Stymulacja IFN-I). Startery wymieniono w Tabeli S2.

Zachodni Blot

Zastosowano lizaty pełnokomórkowe. Białka rozdzielono przez 10% SDS-PAGE, przeniesiono elektrycznie na membrany PVDF (EMD Millipore) i sondowano wskazanymi przeciwciałami. Pasma uwidoczniono za pomocą Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo ScientificTM). Informacje o przeciwciałach były w Tabeli S3.

Mikromacierz

Całkowite RNA wyekstrahowano odczynnikiem TRIzol (Invitrogen) z próbek wskazanych w sekcji WYNIKI i poddano analizie mikromacierzy. Wszystkie eksperymenty z mikromacierzami przeprowadzono przy użyciu macierzy Affymetrix U133 plus 2.0 firmy Shanghai Biotechnology Corporation. W skrócie, całkowity RNA sprawdzono pod kątem numeru RIN w celu sprawdzenia integralności RNA za pomocą Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US). Zakwalifikowany całkowity RNA był dalej oczyszczany za pomocą mikrozestawu RNeasy (nr kat. 74004, QIAGEN, GmBH, Niemcy) i zestawu DNaz wolnych od RNaz (nr kat. 79254, QIAGEN, GmBH, Niemcy). Następnie próbki RNA amplifikowano, znakowano i oczyszczano za pomocą zestawu GeneChip 3'IVT Express Kit (nr kat. 901229, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta w celu uzyskania cRNA znakowanego biotyną. Hybrydyzację macierzy i płukanie przeprowadzono przy użyciu zestawu GeneChip①Hybridization, Wash and Stain Kit (nr kat. 900720, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) w Hybridization

W ślad za Instrukcja producenta. Slajdy zostały zeskanowane za pomocą oprogramowania GeneChipScanner 3000 (nr kat.00-00212, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) i oprogramowania Command Console 3.1 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) z ustawieniami domyślnymi. Surowe dane znormalizowano algorytmem MAS5.0 i zaimportowano do Gene Spring Software 11.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Wykorzystano analizę testu niesparowanego z poprawką Benjaminiego-Hochberga w celu uzyskania genów o zróżnicowanej ekspresji z skorygowaną wartością P wynoszącą<0.05. overlapping="" differentially="" expressed="" genes="" in="" ifn-α="" treated="" hela="" cells(upregulated="" or="" downregulated="" by="" 1.5-fold)="" between="" different="" comparison="" pairs="" (hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" mock,="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" negative="" control="" mimics,="" and="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" hsa-mir-127-3p="" mutant="" mimics)="" were="" calculated.="" all="" the="" hsa-mir-127-3p="" inhibited="" genes="" were="" retrieved="" and="" subjected="" to="" the="" enrichment="" analysis="" of="" the="" cis-regulatory="" motifs="" at="" the="" upstream="" of="" these="" genes="" using="" the="" iregulon="" plugin="" on="" the="" cytoscape="" platform(10).="" the="" effect="" of="" hsa-mir-127-3p="" on="" the="" induction="" of="" the="" interferon-stimulated="" genes="" (isgs)from="" a21-gene="" ifnsignature="" (8)by="" ifn-α="" in="" hela="" cells="" was="" also="">

Immunoprecypitacja RNA wiążącego Ago2 Komórki Hela wysiano na 10 cm szalce i transfekowano mutantem hsa-miR-127-3p lub hsa-miR-127-3p w stężeniu 100 nM. Transfekowane komórki hodowano przez noc. Następnie komórki przemyto zimnym PBS i zeskrobano. Immunoprecypitację przeprowadzono przy użyciu zestawu EZ-Magna RIPRNA-Binding Protein Immunoprecipitation kit (kat.17-701, Millipore) i RIPAb plus Ago2 (kat. 03-110, Millipore). 10% całkowitego lizatu zostało użyte jako wsad, a pozostałe 90 procent całkowitego lizatu użyto do immunoprecypitacji. Próbki RNA z każdej grupy wykorzystano do zsyntetyzowania komplementarnego DNA za pomocą zestawu odczynników PrimeScript RT (Takara). Ekspresję JAK1 oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu SYBR Premix ExTag (Takara). Ekspresję hsa-miR-127-3p oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems). Amplifikację przeprowadzono w systemie ABI vii7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Sekwencje starterów podano w Tabeli S2.

Próbki nerek

Biopsje nerek (n=14) pobrano z biobanku szpitala Shanghai Ren Ji. Od wszystkich pacjentów uzyskano pisemną świadomą zgodę. Badanie zostało zatwierdzone przez Radę Etyki Badawczej Szpitala Ren Ji w Szanghaju. Wszyscy pacjenci z LN (klasa IV-V) spełniali kryteria American College of Rheumatology dla LN(11). Próbki w normalnej grupie kontrolnej (n=11) pochodziły z normalnych tkanek para-rakowych nerek pacjentów z rakiem nerki (stadium I-II), którzy nie mieli historii chorób autoimmunologicznych. Informacje kliniczne na wszystkich tematach zostały opisane w naszym poprzednim artykule (8).

Statystyka

Dane zostały przeanalizowane i wykreślone za pomocą GraphPad Prism (wersja 6.02). Do porównania dwóch lub więcej niezależnych grup zastosowano test U Manna-Whitneya i jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA). Do badań korelacji wykorzystano test korelacji Spearmana. Za statystycznie istotne uznano wartości p poniżej 0,05.