Obrazowanie mikrokrążenia nerkowego w terapii komórkowej

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Katerina Apelt et

Łodyga Cistanche na chorobę nerek, kliknij tutaj, aby pobrać próbkę

Abstrakcyjny:

Nerkowyrozrzedzenie mikronaczyniowe odgrywa kluczową rolę w postępującychnerkachoroba. W związku z tym sposoby wizualizacji mikrokrążenia w nerkach pogłębią naszą wiedzę na temat mechanizmów chorobowych, a w konsekwencji mogą dostarczyć nowych podejść do oceny terapii komórkowej. Obecnie jednak w praktyce klinicznej brakuje nieinwazyjnych, bezpiecznych i skutecznych metod obrazowania w celu monitorowania zmian mikronaczyniowych nerek w czasie u pacjentów cierpiących na choroby nerek. Aby podkreślić znaczenie, podsumowaliśmy aktualną wiedzę na temat mikrokrążenia nerkowego i omówiliśmy udział w postępującej chorobie nerek. Ponadto przedstawiono przegląd dostępnych technik obrazowania w celu poznania morfologii, funkcji i zachowania naczyń mikrokrążenia nerkowego wraz z powiązanymi korzyściami i ograniczeniami. Ostatecznie konieczność oceny i badania choroby nerek na podstawie odczytów in vivo z rozdzielczością do poziomu kapilarnego może stanowić zmianę paradygmatu diagnostyki i terapii w zakresienefrologia.

Słowa kluczowe: nerka; mikrokrążenie; mikrokrążenierozrzedzenie; terapia komórkowa; obrazowanie

1. Wstęp

Układ naczyniowy nerek ma złożoną anatomicznie architekturę, co odzwierciedla jego unikalną funkcję fizjologiczną [1]. Pomimo bardzo dynamicznej adaptacji sieci mikronaczyniowej do zmian hemodynamicznych, dysfunkcja naczyń może być konsekwencją lub nawet przyczynąnerkarozwój i progresja choroby [2,3]. W związku z tym dysfunkcja mikronaczyniowa może służyć jako wczesna oznaka włóknistego uszkodzenia nerek, co sugeruje, że nieinwazyjna ocena i walidacja architektury i funkcji naczyń mikrokrążenia nerkowego byłaby wielką poprawą w ocenie skuteczności terapii mających na celu zmniejszenie zwłóknienia nerek.

W praktyce klinicznej nasilenie przewlekłegonerkachoroba (PChN) jest klasyfikowana na podstawie współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR), który odzwierciedla się w stopniu łagodnym (60-89 ml/min/1,73 m2), umiarkowanym (30-59 ml/min/1,73 m2) lub ciężkim (15-29 ml/ min/1,73 m2 ) zmniejszononerkafunkcjonowaćna podstawie predefiniowanych kategorii [4]. Progresję choroby do zaawansowanej PChN i schyłkowej niewydolności nerek (ESRD) definiuje się jako występowanie stwardnienia kłębuszków nerkowych i zwłóknienia kanalikowo-śródmiąższowego z GFR poniżej 15 ml/min/1,73 m2. W kilku badaniach wykazano, że zjawisko utraty naczyń włosowatych nerki, czyli rozrzedzenie naczyń nerkowych, ściśle koreluje z nasileniem choroby nerek i jest zaangażowane w biologię późniejszej progresji w kierunku PChN [3,5–7]. Jako główną cechę takiej utraty naczyń włosowatych okołokanalikowych i wynikającej z tego utraty nabłonka nerkowego uznano powstawanie zwłóknienia nerek. Ochrona lub nawet odbudowa mikrounaczynienia nerki poprawiłaby integralność tkanki strukturalnej nerki i zapobiegłaby progresji choroby [2,8]. Dodatkowo można potencjalnie zdefiniować okno terapeutyczne w celu oceny ciężkości urazu, zanim stopień uszkodzenia nerek stanie się nieodwracalny. W szczególności można ocenić i udoskonalić wykorzystanie terapii komórkowych, takich jak obiecujące zastosowania mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) w leczeniu chorób naczyń nerkowych. Jednak szczegółowe zrozumienie rozrzedzenia naczyń nerkowych jest nadal utrudnione przez brak metod obrazowania, które umożliwiają nieinwazyjne monitorowanie architektury i funkcjonalności naczyń w wysokiej rozdzielczości.

W niniejszym przeglądzie podsumowujemy aktualną wiedzę na temat mikrokrążenia nerek i mechanizmów patologicznych, które mogą wpływać na mikrokrążenie. Omawiamy znaczenie pericytów i zapewniamy wgląd w ich centralną rolę w powodowaniu progresji choroby nerek poprzez dysfunkcję mikrokrążenia i rozrzedzenie, a także rozwójnerkazwłóknienie. Następnie opisujemy nowe osiągnięcia w technikach obrazowania, które mogą monitorować takie zmiany w mikrokrążeniu nerkowym.

2. Naczynia nerkowe

2.1. Krążenie krwi w nerkach

Mikrounaczynienia ciała ludzkiego składają się z tętniczek, naczyń włosowatych i żyłek i powodują wymianę tlenu, składników odżywczych i metabolitów między krwią a otaczającą tkanką [8, 9]. Najwyraźniej funkcja życiowa mikrokrążenia jest ściśle regulowana w oparciu o potrzeby metaboliczne narządu. Głównym obowiązkiem tętniczek jest regulacja przepływu krwi poprzez dostosowanie oporu, aby zapewnić możliwość wymiany życiowej na poziomie naczyń włosowatych [10]. Pod tym względem ciągła adaptacja do homeostatycznego zapotrzebowania tkanki leżącej pod spodem zależy głównie od dynamicznej plastyczności komórek śródbłonka. Jednocześnie zdrowie śródbłonka mikrokrążenia zależy od ścisłej komunikacji międzykomórkowej z perycytami, które fizycznie stabilizują naczynia krwionośne, regulują angiogenezę i kontrolują przepływ krwi [11,12].

Nerka jest wysoce unaczynionym narządem o unikalnych cechach morfologicznych i czynnościowych, które odzwierciedlają niezwykłą niejednorodność sieci naczyniowej [1,10]. Krew dopływa do nerki tętnicą nerkową przez wnękę (ryc. 1), która dalej dzieli się w miedniczce nerkowej na tętnice segmentowe i rozgałęzia się progresywnie na poziomie kielicha mniejszego do tętnic międzypłatowych, które rozciągają się między piramidami nerkowymi [1,13 ]. Na granicy kory i rdzenia tętnice międzypłatowe wpływają do tętnic łukowatych, tworząc anatomiczną separację między obydwoma przedziałami nerkowymi [1]. W korze, tętnice międzypłatkowe, znane również jako tętnice promieniste korowe lub tętniczki penetrujące korę, powstają prostopadle z tętnic łukowatych i rozchodzą się w tętniczki doprowadzające, zaopatrując różne gałęzie drzewa kłębuszkowego. W zależności od umiejscowienia kłębuszków, przefiltrowana krew gromadzi się w korowym splocie włośniczkowym otaczającym kanaliki proksymalne i dystalne lub w splocie włośniczkowym rdzenia kręgowego na poziomie pętli Henlego. W końcu krew spływa do układu żylnego biegnącego równolegle do sieci tętniczej wychodzącej z nerki przez żyłę międzypłatkową, łukowatą, międzypłatkową, odcinkową i ostatecznie żyłę nerkową tuż nad moczowodem. Ogólnie rzecz biorąc, ten podstawowy wzór naczyniowy jest zachowany u ssaków [14,15].

2.2. Sieci kapilarne nerek

Złożoność architektury mikronaczyń nerkowych odzwierciedla zróżnicowana morfologia różnych naczyń krwionośnych nerki (ryc. 2). Strukturalna i funkcjonalna heterogeniczność śródbłonka nerki i otaczających go komórek okołonaczyniowych ściśle wiąże się z rodzajem sieci naczyń włosowatych [15–17]. W rzeczywistości obecność różnych złóż kapilarnych jest niezwykłą cechą zapewniającą filtrację przez sieć kapilar kłębuszkowych, a także wydzielanie i reabsorpcję przez sieć kapilar okołokanalikowych i sieć kapilar rdzeniastych [1,13,14]. Mikrokrążenie korowe zapewnia głównie reabsorpcję przesączu kłębuszkowego, podczas gdy wydalanie soli i wody jest regulowane głównie przez przedział mikronaczyniowy rdzenia kręgowego [14]. Co ciekawe, chociaż rdzeń stanowi około 30 procent całkowitej masy tkanki nerkowej, to tylko 10 procent całkowitego przepływu krwi przez nerki (RBF) obejmuje tę część [10]. Na podstawie anatomicznej pozycji mikrokrążenie nerkowe można podzielić na (i) mikrokrążenie korowe; oraz (ii) mikrokrążenie szpikowe [13,14].

Mikrokrążenie korowe jest fizycznie oddzielone łukowatymi tętnicami, z których powstają tętnice międzypłatkowe, które dalej rozgałęziają się z obu stron na kilka tętniczek doprowadzających, zaopatrując sieć naczyń włosowatych kłębuszków [14]. Rozgałęzienie zachodzi pod różnym kątem w zależności od umiejscowienia kłębuszków w korze. Poprzez tętniczkę doprowadzającą do sieci naczyń włosowatych kłębuszków, składającej się z 6–8 pętli włośniczkowych, zaopatrywana jest krew, która po przefiltrowaniu wychodzi przez tętniczkę odprowadzającą [10]. Naczynia włosowate kłębuszków (ryc. 2a) zbudowane są z cienkiego, ciągłego iw większości płaskiego śródbłonka z okienkami, który jest pokryty podocytami. Obszary z okienkami mogą zajmować do 20–50% całej powierzchni komórek [16]. Kłębuszki korowe stanowią 90 procent wszystkich kłębuszków obecnych w nerkach, dlatego nie jest zaskakujące, że większość RBF przepływa głównie przez nerki [13]. Pozostałe 10 procent wszystkich kłębuszków znajduje się na granicy korowo-rdzeniowej i jest większych rozmiarów. Oprócz różnic wielkości kłębuszków, różnice strukturalne tętniczek doprowadzających i odprowadzających zaopatrujących kłębuszki korowe i okołoszpikowe można wyjaśnić znaczeniem zachowania ciśnienia kapilarnego.

Aby zapewnić odpowiednią filtrację krwi, różnica średnic między tętniczkami korowymi doprowadzającymi (ryc. 2b) i korowymi (ryc. 2c) wynosi 15 µm versus 10 µm [13]. Ciśnienie krwi jest regulowane po stronie tętniczek doprowadzających poprzez zmiany oporowe wyjaśniające ciągły śródbłonek, który jest otoczony komórkami mięśni gładkich (SMC) [18]. Bliższe badanie tętniczki doprowadzającej ujawnia raczej obecność dwóch segmentów naczyniowych niż jednorodnego śródbłonka na całej długości naczynia, jak to się zwykle spotyka. Proksymalna część tętniczki doprowadzającej składa się z nieprzepuszczalnego śródbłonka z ciasno rozmieszczonymi SMC, które są wymagane do skurczu naczyń. W przeciwieństwie do części dystalnej, która znajduje się blisko kłębuszka i składa się z przepuszczalnego śródbłonka ze względu na obecność fenestracji. Co ciekawe, ta fenestracja jest raczej rzadką cechą w naczyniach o wysokim ciśnieniu wewnątrznaczyniowym. Poza tym pericyty wytwarzające reninę w kształcie sześcianu otaczają dalszą część tętniczek doprowadzających, aby pośredniczyć w regulacji miejscowego ciśnienia krwi w kłębuszkach [17,19].

Przefiltrowana krew wychodzi z każdego kłębuszka korowego przez tętniczkę odprowadzającą i łączy się w gęsty korowy splot kapilarny otaczający kanaliki nerkowe [10]. Poza kłębuszkowym układem włośniczkowym ten drugi przedział naczyń włosowatych znany jest jako układ włośniczek okołokanalikowych [16]. Kapilary okołokanalikowe (ryc. 2d) są fenestrowane i cienkościenne o średniej średnicy około 7 µm [13,15]. Te naczynia włosowate dostarczają tlen i substancje odżywcze do kanalików znajdujących się w korze nerkowej, ale niekoniecznie do tych, z których pochodzą [10,15]. Włośniczki okołokanalikowe wykazują bardziej ciągły śródbłonek, a także mniejszą średnicę w porównaniu z naczyniami włosowatymi rdzenia nasieniowodu [13,16]. W chorobie nerek uszkodzenie kłębuszków ostatecznie wpłynie na dolne, sekwencyjnie ułożone naczynia włosowate okołokanalikowe, a tym samym przyspieszy progresję choroby nerek [10,20].

Tętnica doprowadzająca przyszpikowa (ryc. 2e) ma średnicę około 20 µm, podczas gdy tętniczka odprowadzająca przyszpikowo (ryc. 2f) ma grubszą średnicę wewnętrzną 20–25 µm [13]. Tętnica odprowadzająca wychodząca z kłębuszka okołoszpikowego jest silnie otoczona przez kilka SMC. Ta zauważalna różnica w średnicy naczyń, a także zwiększone umięśnienie, wzbudza debatę na temat udziału tego typu kłębuszków w niedokrwieniu. Wydaje się, że architektura naczyń nerkowych jest zorganizowana w określony sposób, aby chronić rdzeń przed uszkodzeniem niedokrwiennym. Istnieje hipoteza, że ​​tętniczki aferentne i odprowadzające kłębuszków przyszpikowych mogą nie być odpowiedzialne za regulację MBF, ale byłoby to również potencjalnie sprzeczne z ich rolą w kontrolowaniu szybkości filtracji kłębuszkowej [21]. Wydaje się natomiast, że za kontrolowanie MBF odpowiada zstępujące vasa recta (DVR) pęczków naczyniowych znajdujące się w wewnętrznym pasie rdzenia zewnętrznego, co może wyjaśniać dużą liczbę perycytów otaczających ten przedział naczyniowy. DVR pełni zatem kluczową rolę w długofalowej regulacji ciśnienia tętniczego [13]. Tętnice odprowadzające połączone z kłębuszkami przyszpikowymi przepływają przez pęczki naczyniowe, które znajdują się w wewnętrznym pasie rdzenia zewnętrznego, zamieniają się w rejestrator. DVR daje początek sieci naczyń włosowatych rdzenia kręgowego, która jest podłączona do wznoszącego się naczynia prostego (AVR) [1].

Mikrokrążenie rdzeniowe rozpoczyna się, gdy tętniczki odprowadzające wywodzące się z kłębuszków przyszpikowych wnikają głębiej w tkankę, dostarczając pozostałe 30% tkanki nerkowej zwanej rdzeniem [13,14]. Rdzeń jednej piramidy nerkowej jest anatomicznie podzielony na dwie części: rdzeń zewnętrzny znajdujący się tuż pod korą, a następnie rdzeń wewnętrzny, który rozciąga się aż do wierzchołka miąższu, zwanego brodawką. Ogólnie rzecz biorąc, liczba naczyń włosowatych rdzeniastych wzrasta od wierzchołka piramidy nerkowej. Bliższa obserwacja wskazuje, że rdzeń zewnętrzny może być dalej podzielony na pasek zewnętrzny i silnie unaczyniony pasek wewnętrzny zawierający gęsty splot kapilarny i splot międzypęczkowy [15]. Naczynia włosowate międzypęczkowe charakteryzują się śródbłonkiem z okienkami i są połączone z żyłą łukowatą [14,22].

Każda przyszpikowa tętniczka odprowadzająca dzieli się na kilka pęczków, zwanych pęczkami naczyniowymi, tworząc odgałęzienia DVR (ryc. 2g), które mają większą średnicę w porównaniu z naczyniami włosowatymi okołokanalikowymi kory [15, 23]. Kilka perycytów jest przyczepionych do śródbłonka DVR wiązek naczyniowych [17]. Co ciekawe, liczba perycytów otaczających naczynia zmniejsza się w DVR (ryc. 2h) rdzenia wewnętrznego [15,17]. Takie morfologiczne ułożenie rejestratora DVR w przedziale rdzenia zewnętrznego i wewnętrznego odzwierciedla jego podwójną funkcję [10]. Rozwijając, zwężenie naczyń krwionośnych DVR pojawia się głównie w części proksymalnej, która znajduje się w rdzeniu zewnętrznym [15]. W części dystalnej, czyli rdzeniu wewnętrznym, ma jednak miejsce głównie wymiana elektrolitów. Ta różnica anatomiczna bezpośrednio implikuje odrębną subpopulację perycytów pod względem wyglądu morfologicznego i właściwości funkcjonalnych [15,17].

Głęboko w rdzeniu wewnętrznym różne gałęzie rejestratora DVR dzielą się na złożoną sieć kapilarną przed podłączeniem do znacznie mniejszego odbiornika AVR [10]. Śródbłonek DVR jest ciągły, w przeciwieństwie do komórek śródbłonka AVR (ryc. 2i), które są silnie fenestrowane. Ostatecznie cała krew jest pobierana z AVR, jak również z naczyń włosowatych okołokanalikowych splotu kory naczyń włosowatych do układu żylnego. Na ogół żyły nerkowe mają niezwykle cienką ścianę naczyniową, a żyły międzypłatkowe, łukowate i międzypłatkowe są z okienkami i zawierają przepony. Co zaskakujące, żyły międzyzrazikowe wykazują na ogół większe podobieństwo do naczyń włosowatych okołokanalikowych niż do żył ze względu na cienki i silnie otworowany nabłonek.

Różne segmenty mikrokrążenia nerkowego i ich elegancki wygląd morfologiczny na poziomie komórkowym budzi podejrzenie, że istniejąca złożoność przekłada się na jeszcze bardziej skomplikowany mechanizm chorobowy. W związku z tym poniższa sekcja koncentruje się na podstawowych procesach związanych z nieprawidłowym funkcjonowaniem naczyń mikrokrążenia nerkowego.

3. Zaburzenia czynności naczyń mikrokrążenia nerek

3.1. Dysfunkcja śródbłonka

W warunkach fizjologicznych śródbłonek nerki jest przeważnie w stanie spoczynku; jednak w odpowiedzi na zmiany mikrośrodowiskowe, tj. stres ścinający, niedotlenienie, stres oksydacyjny lub stan zapalny, dochodzi do aktywacji komórek śródbłonka i produkcji angiogenicznych czynników wzrostu [24]. W zależności od wyzwalacza, aktywacja komórek śródbłonka może indukować fenotyp prozapalny i prozakrzepowy, aby promować adhezję komórek odpornościowych i infiltrację w celu tworzenia mikroskrzeplin. Jednakże, aby utrzymać barierę naczyniową dla odpowiedniej rozległej funkcji regulacyjnej i przepuszczalności dla transportu substancji rozpuszczonej, niezbędna jest ścisła regulacja stanu metabolicznego spoczynku, jak również aktywowanych komórek śródbłonka.

Integralność tkanek i funkcja narządów zależą głównie od odpowiedniej perfuzji sieci mikronaczyniowej [8]. Dlatego nie dziwi fakt, że komórki śródbłonka wykazują wysoką plastyczność, aby zapewnić dynamiczną adaptację do zmian środowiska poprzez dostosowanie liczby naczyń włosowatych, kształtu morfologicznego i funkcji [1,2,8]. Przedłużający się okres podwyższonego ciśnienia krwi powoduje jednak nieodwracalne zmiany w mikrokrążeniu, dając początek uszkodzonym komórkom śródbłonka charakteryzującym się zaburzonymi właściwościami adaptacyjnymi. Ta zaburzona homeostaza jest odzwierciedlona w redukcji tlenku azotu (NO), czynnika indukowanego hipoksją -1 (HIF-1) i czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), wraz ze wzrostem innych czynników, takich jak jako angiostatyna, endostatyna i trombospondyna [1]. Warto zauważyć, że podatność na dysfunkcję śródbłonka w nerkach jest zróżnicowana i zależy od typu komórek śródbłonka znajdujących się w różnych przedziałach mikrokrążenia nerkowego [16,24]. Aby wyjaśnić heterogeniczne fenotypy komórek śródbłonka nerkowego i ich odmienną odpowiedź na zmiany mikronaczyniowe, Dumas i in. [25] niedawno przedstawili atlas śródbłonka nerki o wysokiej rozdzielczości, wykorzystujący sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA.

Dysfunkcja śródbłonka często współwystępuje z ostrym i postępującym pogorszeniem funkcji nerek [24]. Ta nieprawidłowość powoduje wzrost oporu naczyniowego, któremu towarzyszy zmniejszenie RBF [26]. Przedłużający się okres skurczu naczyń powoduje niedostateczną perfuzję tkanek oraz aktywację czynników stresowych i wzrostowych, co prowadzi do zmian morfologicznych [1]. W zależności od nasilenia, a zwłaszcza czasu trwania danego urazu, RBF można nieodwracalnie zmienić, wprowadzając zmiany strukturalne w mikrokrążeniu. Te zmiany morfologiczne są spowodowane procesem znanym jako przebudowa mikronaczyniowa. Remodeling mikronaczyniowy definiuje się jako odpowiedź na zmiany funkcjonalne mikronaczyń, które w konsekwencji mogą powodować zmianę architektury mikronaczyniowej na poziomie strukturalnym w ostatniej próbie osiągnięcia homeostazy hemodynamicznej [1,2,8]. Wreszcie, dysfunkcja śródbłonka może skutkować zjawiskiem zwanym „no-reflow”, w którym perfuzja nie może zostać przywrócona, co ostatecznie prowadzi do uszkodzenia komórek nabłonka kanalików, co skutkuje ostrym uszkodzeniem nerek (AKI) [24].

Niezwykle ważne jest podkreślenie, że dysfunkcja śródbłonka jest nie tylko związana z chorobą nerek, ale także aktywnie wpływa na progresję choroby [24]. Dysfunkcja naczyń mikrokrążenia nerek objawia się dysfunkcją śródbłonka wywołaną uszkodzeniem komórek, co zaburza bliską interakcję pericytów z warstwą śródbłonka i utrudnia komunikację komórkową.

3.2. Zaangażowanie perycytów w zaburzenia czynności nerek

Centralną cechą PChN jest postępująca utrata sieci naczyń włosowatych okołokanalikowych, proces określany jako rozrzedzenie [27]. Zwłóknienie kanalikowo-śródmiąższowe, a także uszkodzenie nabłonka kanalików, są poprzedzone tym włośniczkowym rozrzedzeniem w nerkach [27], podczas gdy to rozrzedzenie mikronaczyniowe jest bezpośrednio skorelowane z nasileniem zwłóknienia [28,29]. Ponadto stwierdzono, że stopień rozrzedzenia pozwala przewidzieć stopień uszkodzenia śródmiąższowego, a także zmiany wskaźnika filtracji kłębuszkowej u pacjentów z CKD [28]. Wyniki te sugerują wczesną, ograniczającą częstość rolę destabilizacji/utraty mikrokrążenia w rozwoju PChN i patogenezie zwłóknienia [30]. Przewlekła aktywacja komórek śródbłonka przez czynniki ryzyka sercowo-naczyniowego może powodować utratę perycytów, które odgrywają kluczową rolę w stabilizacji i proliferacji naczyń włosowatych poprzez interakcje z komórkami śródbłonka [31]. Coraz więcej dowodów wskazuje na znaczenie perycytów i ich udział w zdrowiu naczyń krwionośnych nerek [17].

Pericyty to okołonaczyniowe komórki ścienne z wydłużonymi wyrostkami pokrywającymi śródbłonek, które są osadzone w błonie podstawnej naczyń włosowatych [32]. Są to komórki pochodzenia mezenchymalnego i powstają z Forkhead box D1 (FoxD1) oraz populacji progenitorowej zrębu, które również dają początek innym komórkom ściennym układu naczyniowego nerki, w tym SMC, rezydentnym fibroblastom, komórkom reniny i komórkom mezangialnym [33], natomiast wszystkie komórki śródbłonka układu naczyniowego nerki pochodzą z białaczki z komórek macierzystych (SCL) plus progenitorów [34]. Pericyty różnią się od rezydentnych (okołonaczyniowych) fibroblastów, ponieważ są osadzone w błonie podstawnej naczyń, ale większość badań dotyczących nerek nie rozróżnia pericytów od fibroblastów okołonaczyniowych [31, 35], prawdopodobnie z powodu braku swoistych markerów. Markery powszechnie stosowane do identyfikacji pericytów obejmują receptor płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGFR), proteoglikan siarczanu chondroityny NG2, -aktynę mięśni gładkich (SMA), klaster różnicowania 73 (CD73) i PDGFR, ale te markery identyfikują różne ( nakładające się) podzbiory perycytów zlokalizowane w różnych regionach anatomicznych, odzwierciedlające niejednorodność tej populacji komórek [17], a najprawdopodobniej także niejednorodność funkcjonalną. Pericyty ściśle regulują rozwój naczyń, stabilizację, dojrzewanie i przebudowę [11] oraz kontrolują przepływ krwi poprzez skurcz naczyń. Pericyty są regulowane funkcjonalnie przez czynniki zwężające naczynia, takie jak angiotensyna II i trifosforan adenozyny (ATP), a także czynniki wazodylatacyjne, takie jak NO i prostaglandyny [17]. Dojrzewanie naczyń krwionośnych jest uzależnione od rekrutacji komórek okołonaczyniowych w celu stabilizacji układu naczyniowego i kontroli ciśnienia krwi [12].

W nerce pericyty otaczają dystalne części tętniczek doprowadzających kłębuszków korowych i są obecne głównie w naczyniach włosowatych okołokanalikowych oraz w naczyniu odbytniczym [13,19]. Ponadto komórki mezangialne są (wyspecjalizowanym) podzbiorem perycytów nerkowych, które są ważne w utrzymaniu strukturalnego wsparcia naczyń włosowatych kłębuszków i regulacji hemodynamiki kłębuszków. Ponadto kurczliwe pericyty przykłębuszkowe zlokalizowane przy tętniczkach pośredniczą w miejscowym kłębuszkowym ciśnieniu krwi i wpływają na ciśnienie krwi układowej poprzez wydzielanie reniny [19]. Co ciekawe, komórki prekursorowe reniny pochodzące z przedziału zrębu są czasowo związane z rozwojem naczyń krwionośnych, podczas gdy wykazano, że tworzenie gałęzi tętniczych jest poprzedzone pojawieniem się komórek wykazujących ekspresję reniny w punkcie rozgałęzienia [33, 36]. Co więcej, stosując transgeniczny danio pręgowany reporter reniny, wykazano, że komórki z ekspresją reniny poprzedzają kiełki angiogeniczne [37]. W nerce dorosłego myszy komórki pochodzenia reninowego obserwuje się również w lokalizacjach okołonaczyniowych i współbarwią się one markerami perycytowymi (PDGFR /NG2) [38], co sugeruje prawdopodobnie istotną rolę tego podzbioru w utrzymaniu naczyń.

3.3. Interakcje sygnalizacyjne między komórkami śródbłonka i perycytami

Pericyty oddziałują z komórkami śródbłonka poprzez wiele wzajemnych interakcji, które regulują szlaki sygnałowe wymagane do stabilizacji i kiełkowania angiogenicznego. Sygnał perycytów do śródbłonka poprzez wydzielane czynniki, takie jak VEGF, PDGF, transformujący czynnik wzrostu- (TGF- ) i angiopoetyna-1 (Ang-1), a także przez bezpośredni przenik śródbłonkowy-perycytowy [39 ]. Podobnie, śródbłonek wysyła sygnały do ​​otaczających komórek zrębu za pomocą czynników takich jak angiopoetyna-2 (Ang-2) ​​i PDGF. Ang-2 ujemnie zakłóca sygnalizację Tie, w której pośredniczy Ang-2, co skutkuje zakłóceniem interakcji pericytów z komórkami śródbłonka, a następnie destabilizacją naczyń i nieprawidłową przebudową naczyń krwionośnych [40,41]. O krytycznym znaczeniu interakcji między okołonaczyniowymi komórkami zrębu a komórkami śródbłonka w utrzymaniu sieci naczyń włosowatych świadczą również badania na myszach, wykazujące, że gdy inwestycja perycytów jest utrudniona, sieć naczyń włosowatych ulega destabilizacji i dochodzi do rozrzedzenia [42]. Na przykład hiperglikemia zwiększa ekspresję Ang-2 w śródbłonku, powodując migrację komórek zrębu okołonaczyniowego z naczyń włosowatych [43]. Ostatnie badania z naszego laboratorium wykazały, że zarówno u szczurów [44], jak i u ludzkich dawców [45] uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne prowadzi do szybkiego podniesienia równowagi Ang-2/Ang-1, co jest związane z utratą integralności mikronaczyniowej. Ponadto u pacjentów z cukrzycą w ciągu 12 miesięcy po równoczesnym przeszczepie nerki i trzustki zaobserwowano odwrócenie stanu naczyń włosowatych i zmniejszenie stosunku Ang-2/Ang-1 oraz rozpuszczalnej trombomoduliny (marker uszkodzenia komórek śródbłonka) [46 ]. Oprócz szlaków angiopoetyna/Tie2 [47], przesłuchy między śródbłonkiem a perycytami są regulowane przez szlaki sygnalizacyjne nadrodziny TGF [48], VEGF [49] i szlaki sygnalizacyjne fosforanu sfingozyny (S1P) [50].

3.4. Pericyty jako prekursor miofifibroblastów

Modele śledzenia linii genetycznych myszy wykazały, że pericyty (i inne komórki okołonaczyniowe) są głównym źródłem miofifibroblastów -SMA-dodatnich w mysich modelach zwłóknienia nerek [51,52]. W rzeczywistości, ostatnie eleganckie badanie obejmujące sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA wskazało trzy główne źródła miofibroblastów w ludzkich nerkach: (i) NOTCH3 plus RGS5 plus PDGFR – pericyty; (ii) MEG3 plus PDGFR plus fibroblasty; oraz (iii) COLEC11 plus CXCL12 plus fibroblasty [53]. Podczas różnicowania pericytów do miofibroblastów zaobserwowano zmiany cyklu komórkowego, które są zgodne z różnicowaniem i ekspansją, a wzbogacone szlaki obejmowały kanoniczną sygnalizację WNT i białka aktywującego -1 (AP-1), a także aktywację transkrypcji czynnik 2 (ATF2), PDGFR, integryna, interakcja z receptorem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i szlaki sygnałowe TGF [53]. Wykazano wcześniej, że niewielka część populacji komórek PDGFR plus składa się z okołonaczyniowych komórek progenitorowych Gli1 plus, które oznaczają populację komórek okołonaczyniowych podobnych do MSC, która, jak wykazano, jest również kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do zwłóknienia narządów wywołanego urazem poprzez wytwarzanie miofifibroblastów [54]. . Ponadto wykazano, że homolog 1 onkogenu związany z glejakiem (Gli1) plus utrata perycytów indukują rozrzedzenie naczyń włosowatych i uszkodzenie kanalików proksymalnych [55]. Warto zauważyć, że ponieważ pericyty były wcześniej powiązane i są blisko spokrewnione z MSC [56], rodzi to również pytanie, czy podzbiór pericytów może być MSC i jako taki przyczyniać się do regeneracji nerek. W rzeczywistości wiele badań wykazało multipotencjalną rolę progenitorową pericytów w różnych tkankach [35,57,58].

Podsumowując, rozrzedzenie mikronaczyniowe bezpośrednio przyczynia się do tworzenia puli miofibroblastów odpowiedzialnych za nadmierne wytwarzanie białek ECM, które są głównym składnikiem tkanki bliznowatej w zwłóknieniu. Ponadto przejście pericyty-miofibroblasty powoduje oderwanie się perycytów od ściany naczynia, co skutkuje niestabilnymi naczyniami włosowatymi, co samo w sobie powoduje rozrzedzenie [52]. Niemniej jednak główny wpływ rozrzedzenia na patogenezę przewlekłej niewydolności nerek jest spowodowany utratą perfuzji nerek, która dodatkowo zaostrza niedokrwienie rdzenia kręgowego i prowadzi do rozwoju zwłóknienia śródmiąższowego, w którym pośredniczy zwiększona ekspresja TGF- i czynnika wzrostu tkanki łącznej (CTGF) [59]. W związku z tym rozrzedzenie mikronaczyniowe może dobrze funkcjonować jako ograniczający częstość pro-fibrotyczny przełącznik w patogenezie przewlekłej niewydolności nerek. Rzeczywiście, terapie ukierunkowane na interakcję między komórkami śródbłonka i perycytami, np. ukierunkowane na sygnalizację receptora PDGFR lub VEGF, mogą zapobiegać przejściu miofibroblastów i ograniczać rozwój zwłóknienia [60–62], ilustrując kluczową rolę sieci naczyń włosowatych w uszkodzeniu nerek i jako potencjalny cel terapeutyczny.

Na podstawie powyższego jasno widać, że złożona architektura naczyniowa nerki generuje wiele przedziałów okołonaczyniowych, z których każdy ma swoje specyficzne funkcje i wymagania. Dlatego wymagane są przyszłe badania skupiające się na dogłębnej klasyfikacji perycytów nerek poprzez scharakteryzowanie subpopulacji na podstawie ich lokalizacji, morfologii komórek i funkcji. W związku z tym nowe metody obrazowania, które mają na celu nieinwazyjny dostęp do małych naczyń krwionośnych, mogą dostarczyć tych niezbędnych informacji. Przykładem może być neurobiologia [12], dobrze zdefiniowana kategoryzacja różnych podtypów perycytów może zapewnić nowe możliwości rozwoju ukierunkowanej terapii zaburzeń naczyniowych.

4. Metody obrazowania naczyniowego

Różne choroby nerek odzwierciedlają charakterystyczny wzór zmian ultrastrukturalnych. W wyniku postępu technologicznego w dziedzinie obrazowania biomedycznego w ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat ujawniono mechanizmy fizjologiczne i patofizjologiczne nerek [63]. Koncentrując się na anatomicznych i morfologicznych zmianach architektury tkanek, nasza wiedza na temat chorób nerek stopniowo się powiększała, co poprawia diagnostykę i zapewnia innowacyjne możliwości leczenia. Jednak dynamiczna zmiana naczyń krwionośnych została zignorowana głównie ze względu na wyzwanie, jakim jest zbadanie zachowania naczyń w eksperymentach szeregów czasowych. W rezultacie istnieje niezaspokojona potrzeba medyczna opracowania nieinwazyjnych technik obrazowania w celu monitorowania hemodynamiki mikrokrążenia nerkowego [16].

Interesujące byłoby również powiązanie wyników obrazowania z (nowymi) biomarkerami w dziedzinie nefrologii naczyniowej. Na przykład wykazaliśmy, że niekodujące RNA są ściśle powiązane z uszkodzeniem naczyń [64,65]. Połączenie tych pomiarów może zaowocować nowymi (przyczynowymi) relacjami i nowymi możliwościami diagnozy. Co więcej, gdy nowe modalności obrazowania zostaną połączone z niedawnym rozwojem technik opartych na pojedynczej komórce, takich jak sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA i transkryptomika przestrzenna [53,66,67], może to umożliwić bezprecedensową dogłębną analizę składu i dynamiki unaczynienia nerek. Poniższe sekcje podsumowują już dostępne metody obrazowania ex vivo i in vivo do badania morfologicznych i funkcjonalnych aspektów mikronaczyń nerek.

4.1. Ex Vivo

Duża część naszej wiedzy na temat mikrounaczynienia nerek pochodzi z kompleksowej analizy ex vivo biopsji tkanek. W związku z tym terapia komórkowa jest często oceniana przez wycinanie i barwienie tkanek. Mimo że istnieje wiele badań dotyczących terapeutycznego wpływu MSCs na unaczynienie nerek [68], niewiele grup badawczych wykorzystało wyrafinowane metody obrazowania, takie jak tomografia mikrokomputerowa (micro-CT), do oceny terapii MSC poprzez badanie architektury 3D unaczynienia nerek [69–74].

4.1.1. Tomografia mikrokomputerowa (Micro-CT)

Wprowadzenie tomografii mikrokomputerowej (micro-CT) przez Flannery et al. [75] w 1987 roku otworzyli nowe możliwości badania nienaruszonego układu naczyniowego gryzoni w celu zdobycia wiedzy o mechanizmach chorobowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Ta modalność ex vivo umożliwiła wizualizację architektury mikrokrążenia nerkowego oraz ilościową ocenę liczby kłębuszków nerkowych, rozmieszczenia przestrzennego i objętości, co może być wykorzystane jako wskaźnik stanu patofizjologicznego całego narządu [76]. Rozdzielczość w jednym polu widzenia 3D z 10 243 wokselami pozwoliła na wizualizację tętniczek doprowadzających i odprowadzających, a także naczyń włosowatych kłębuszków nerek gryzoni. U szczurów stosowano zrekonstytuowany woksel o wielkości 21 µm [77], au świń układ naczyniowy nerek badano przy wielkości woksela 40 µm i polu widzenia 1,2 mm [78]. Postępy w dziedzinie mikrotomografii umożliwiły obrazowanie naczyń krwionośnych nefronu szczura z rozdzielczością woksela 1 µm w polu widzenia 2 mm [79].

W oparciu o technikę kwantyfikacji opracowaną przez Hillmana i in. [80] za pomocą konwencjonalnej TK, architekturę naczyń i objętość naczyń w różnych przedziałach tkanki nerkowej określono zgodnie z podobnymi badaniami, w których oceniano naczynia nerkowe na podstawie histologicznych przekrojów tkanek [77]. Co ciekawe, stosując techniki obrazowania, takie jak mikrotomografia komputerowa, zwrócono uwagę na badanie naczyń włosowatych okołokanalikowych i ich udział w stanach patologicznych, oprócz konwencjonalnego sposobu myślenia o roli sieci naczyń włosowatych kłębuszków.

Wczesne zmiany strukturalne mikronaczyń można uwidocznić i wykryć za pomocą mikrotomografii komputerowej, dlatego nie jest zaskakujące, że za pomocą mikrotomografii zidentyfikowano kilka mechanizmów molekularnych na poziomie naczyń związanych z chorobą nerek. W różnych modelach chorób nerek, takich jak policystyczna choroba nerek (PKD), opisano korelację między patologią a obniżonym mikrokrążeniem, co określono za pomocą mikrotomografii komputerowej z rozdzielczością 17 µm woksela [81]. Ponadto w hipercholesterolemii jako wczesny objaw postępującego uszkodzenia morfologicznego nerek obserwowano zwiększoną gęstość mikrokrążenia korowego [78]. U szczurów z przewlekłym podwiązaniem dróg żółciowych za pomocą mikro-TK wykryto hipoperfuzję korową, co może tłumaczyć zaburzenie retencji soli i wody z dalszą progresją choroby [82]. Poza tym w zwężonych nerkach zwiększony stres oksydacyjny wiązał się z przebudową naczyń mikrokrążenia nerkowego, a możliwości leczenia zaproponowano poprzez przewlekłą interwencję antyoksydacyjną [83].

Główną zaletą mikro-TK jest możliwość określenia geometrii osiowej i promieniowej układów naczyniowych [84]. Oprócz wizualizacji architektury naczyń nerkowych w 3D, można docenić gęstość przestrzenną mikronaczyń [78,83], gęstość i wielkość naczyń można określić przy średnicy do 80 µm w różnych anatomicznych przedziałach nerkowych [77,78,83,85 ] i można zaobserwować krętość naczyń [83]. Ponadto w korze można było rozróżnić i określić ilościowo objętość naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych oraz naczyń włosowatych okołokanalikowych [82].

Standardowy protokół ilościowy jest szeroko stosowany do badania zmian mikronaczyniowych w dobrze zdefiniowanych przedziałach korowych i rdzeniowych na poziomie strukturalnym w celu określenia gęstości i średnicy naczyń [77, 82]. Ngo i in. [84] przeprowadzili badanie porównawcze mikro-CT i mikroskopii świetlnej i doszli do wniosku, że ilościowe określenie geometrii naczyń nerkowych uzyskanej za pomocą mikro-CT jest techniką wykonalną i dokładną. Jedyną wartością dodaną obrazowania pod mikroskopem świetlnym w porównaniu z mikrotomografią komputerową jest to, że umożliwia odróżnienie tętnic od żył poprzez możliwość wizualizacji ściany naczynia. Jednak dzięki zastosowaniu mikro-CT tętnice szczurów i królików o średnicy 100 i 60 µm można było wizualizować w 3D. Jednak małe naczynia krwionośne, mniejsze niż 10 µm, nie mogą być prawidłowo zidentyfikowane za pomocą mikrotomografii, co skłania do powrotu do immunohistochemii w celu wychwycenia nawet najmniejszych naczyń włosowatych nerek [85].

4.1.2. Mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego (LSFM)

Wraz z wprowadzeniem mikroskopii fluorescencyjnej lekkich arkuszy (LSFM), obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dużych objętości można obecnie uzyskać w rozsądnym czasie [86,87]. Dzięki dostępności LSFM zainteresowanie przesunięto z rutynowo stosowanych konwencjonalnych technik histologicznych, które obejmują cięcie tkanki, a następnie barwienie mikronaczyń, w kierunku obrazowania tkanki jako całości. Analiza wolumetryczna jest korzystna, ponieważ badana jest nie tylko wybrana część tkanki, ale także dynamiczny charakter architektury i zachowania naczyń jest zachowany w widoku 3D.

Aby zachować informacje 3D, próbka biologiczna staje się przezroczysta za pomocą różnych protokołów optycznego oczyszczania tkanek (OTC), aby zminimalizować rozpraszanie światła i jego absorpcję w celu dalszego barwienia fluorescencyjnego FL [87]. W ostatnich latach metody OTC zyskały popularność, ponieważ obrazowanie 3D daje możliwość badania nienaruszonych narządów dzięki nowoczesnym postępom LSFM. Konstrukcję nienaruszonego organu lub nawet całego zwierzęcia z rozdzielczością na poziomie komórkowym w 3D można uzyskać w ciągu kilku minut [88]. Przy porównywalnej rozdzielczości do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej FL, LSFM ma jednak o dwa rzędy wielkości lepszy stosunek sygnału do szumu, radykalnie zmniejszając wybielanie fluoroforów FL i fototoksyczność, umożliwiając przetwarzanie obrazowania na dużą skalę wymagane w przypadku OTC [89]. Dodatkowymi zaletami jest to, że rejestrowana liczba klatek i prędkość nagrywania są większe, a całkowity czas trwania obrazowania jest znacznie krótszy.

Od czasu wprowadzenia LSFM kilka protokołów OTC zostało ulepszonych i udoskonalonych dla różnych próbek tkanek i narządów pochodzących z kilku gatunków. W ostatnich latach nietoksyczne, oparte na rozpuszczalnikach oczyszczanie za pomocą cynamonianu etylu (ECi) jest szeroko stosowane do oczyszczania nerek myszy [88,90,91]. Protokół ten jest mniej czasochłonny, jak na przykład pionierskie protokoły CLARITY (bezbarwne obrazowanie sztywne z akryloamidem z wymianą lipidów), CUBIC (jasne, niezakłócone koktajle obrazowania mózgu/ciała i analiza obliczeniowa) i/lub DISCO (obrazowanie trójwymiarowe narządy oczyszczone rozpuszczalnikiem), ale zapewnia stosunkowo rozsądne oczyszczenie nerek z niewielką ilością pozostałej autofluorescencji. Niezwykłą pracę wykonali Ertürk i współpracownicy [92], którzy z powodzeniem oczyścili całą ludzką nerkę za pomocą nowego podejścia do permeabilizacji tkanek o nazwie SHANEL (efektywne oczyszczanie i znakowanie narządów ludzkich za pośrednictwem małych miceli). Stwierdzono, że strefa korowa ma wymiary około 2742 ± 665 mm (średnia ± SD), która zawiera kapilary kłębuszkowe o średnicy 221 ± 37 mm, a tętniczki doprowadzające mają średnicę 71 ± 28 mm. Co więcej, w dziedzinie neuronauki opracowano wysoce wyrafinowane ramy oparte na głębokim uczeniu do ilościowego określania unaczynienia neuronalnego po OTC, zwane VesSAP (ang. Vessel segmentation & analysis pipeline) [93].

Pomimo faktu, że w ostatnich latach osiągnięto duży postęp w dziedzinie OTC, nadal pozostają pewne wady, ponieważ ekspresja endogennych fluoroforów FL w większości nie jest zachowana w zadowalający sposób, co ogranicza wykorzystanie zwierząt transgenicznych. Jednak głównym problemem jest to, że rozmiar morfologiczny tkanki, a w konsekwencji układu naczyniowego, jest zmieniany przez agresywne rozpuszczalniki wymagane dla OTC. Ponadto ogromna ilość danych generowanych przez LSFM pozostaje wyzwaniem nie tylko dla prawidłowego przechowywania i obsługi danych, ale także dla analizy ilościowej [87].

Krótko mówiąc, jedną z ważnych zalet stosowania technik, takich jak mikrotomografia komputerowa lub SFM, jest to, że można uchwycić przestrzenny rozkład naczyń i zidentyfikować rozrzedzenie strukturalne sieci naczyniowej z odpowiednią rozdzielczością, aby zobrazować prawie wszystkie struktury naczyń włosowatych nerek. Jednak obie techniki wymagają utrwalenia i dlatego mogą być wykonywane tylko ex vivo. Aby monitorować zmiany morfologiczne i funkcjonalne mikronaczyń nerkowych, pożądane są strategie obrazowania w czasie in vivo.

4.2. W Vivo

Zastosowanie metod obrazowania in vivo dałoby możliwość oceny terapii opartej na komórkach w czasie rzeczywistym i walidacji możliwych efektów terapeutycznych na poziomie naczyń. W związku z tym postępy w dziedzinie obrazowania biomedycznego in vivo wymagają zbadania wpływu MSC na układ naczyniowy nerek. Tylko garstka badań wykorzystała obrazowanie in vivo do zbadania działania MSC, wykorzystując mikroskopię wielofotonową (MPM) [94], CT [95,96] i rezonans magnetyczny (MRI) [95–97].

4.2.1. Mikroskopia wielofotonowa (MPM)

Mikroskopia wielofotonowa (MPM) polega na jednoczesnej absorpcji dwóch lub więcej fotonów tylko w płaszczyźnie ogniskowej, która stała się dostępna w 1995 roku [98]. Dynamiczne procesy można wizualizować in vivo na poziomie komórkowym, a poza badaniem przepływu krwi w naczyniach nerkowych [63], MPM daje możliwość monitorowania różnych odcinków naczyń mikrokrążenia nerkowego w czasie rzeczywistym. Wysoka rozdzielczość umożliwia wizualizację tętniczek doprowadzających i odprowadzających oraz naczyń włosowatych kłębuszków. Mimo że technicznie możliwy jest dostęp do mikrokrążenia szpikowego, pozostaje on jednak wyzwaniem ze względu na głębokość penetracji [98]. Jednak możliwe jest zwizualizowanie całego kłębuszka o przybliżonej średnicy 100 µm i uzyskanie dostępu do dynamicznych procesów na poziomie komórkowym.

Co ważne, przeciek mikronaczyniowy in vivo można uwidocznić i oszacować ilościowo poprzez wynaczynienie błękitem Evansa w zwłóknionych nerkach za pomocą MPM [99]. Liczbę perfundowanych kapilar określono ilościowo, a średnicę określono znacznie poniżej 10 µm. Niedawno nasza grupa badawcza zastosowała MPM, aby dostarczyć dowodów in vivo, że organoidy nerkowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) tworzą funkcjonalne połączenie z istniejącym wcześniej układem naczyniowym nerki u myszy po przeszczepie podtorebkowym nerki [100, 101].

Zaletami MPM jest brak pozaogniskowej fluorescencji FL i ograniczone fotowybielanie w obszarze ogniskowym [98]. Jednak jedną z wad jest ograniczona głębokość obrazowania, która wymaga zastosowania okienka obrazowania jamy brzusznej w celu uzyskania dostępu do układu naczyniowego nerki in vivo [102,103]. To okienko brzuszne umożliwia obrazowanie in vivo przez kilka tygodni do jednego miesiąca; jednak wprowadzenie takiego okienka obrazowego wymaga inwazyjnej operacji i wiąże się z ryzykiem zapalenia. Ponadto czasami dochodzi do utraty okien obrazowania i może dojść do martwicy tkanek [102]. Oczywiście tej metody obrazowania nie można przełożyć na praktykę kliniczną.

Interesującą alternatywę dla nieinwazyjnego monitorowania przepływu krwi włośniczkowej przy łóżku pacjenta można osiągnąć od czasu wprowadzenia do praktyki klinicznej ręcznej mikroskopii życiowej (HVM) [104]. Mimo że ta modalność obrazowania jest oparta na zupełnie innej technologii, tj. wideomikroskopach strumienia bocznego i padającego ciemnego pola, oferuje ocenę w czasie rzeczywistym powierzchownie zlokalizowanych naczyń włosowatych. Nowatorskie algorytmy wdrażane klinicznie, znane jako pakiety oprogramowania MicroTools, umożliwiają zautomatyzowaną analizę obrazowania mikronaczyniowego całkowitej i perfundowanej gęstości naczyń w celu uzyskania dostępu do angiogenezy, rozszerzenia/zwężenia naczyń i bilansu płynów, a także zdolności dostarczania tlenu na podstawie hematokrytu włośniczkowego i prędkości erytrocytów [105 ]. Jednak do badania mikronaczyń nerkowych metody te nie są odpowiednie ze względu na ograniczoną głębokość penetracji.

4.2.2. Tomografia komputerowa (CT)

Nieinwazyjne metody obrazowania zdolne do monitorowania i ilościowego określania zmian morfologicznych i czynnościowych mikronaczyń nerkowych są bardzo potrzebne do określenia roli mikronaczyń w progresji choroby do PChN. Mimo że związek przyczynowy między rozrzedzeniem naczyń włosowatych a postępem zwłóknienia nerek jest znany od wielu lat, Ehling et al. [3] jako pierwsi wykonali nieinwazyjne jakościowe i ilościowe analizy anatomicznych i czynnościowych zmian naczyniowych podczas progresji PChN. W trzech mysich modelach z postępującym zwłóknieniem nerek, tj. z uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym (IRI), jednostronną niedrożnością moczowodu i u myszy Alport, zaobserwowano postępujący spadek objętości krwi w nerkach za pomocą mikro-TK in vivo ze wzmocnieniem kontrastowym. Oprócz funkcjonalnych zmian mikronaczyń, utrata naczyń okołokanalikowych korelowała z powstawaniem tkanki włóknistej we wszystkich trzech mysich modelach CKD. Jednak aby uzyskać informacje na temat punktów rozgałęzień, średnicy naczyń i krętości, wymagana była mikrotomografia ex vivo, co wskazuje na potrzebę opracowania nowych technologii obrazowania biomedycznego, które zapewniają dostęp do mikronaczyń in vivo z rozdzielczością zbliżoną do komórkowej.

Główną zaletą CT jest to, że wizualizację naczyń nerkowych uzyskuje się w ciągu kilku minut z rozsądną rozdzielczością, zapewniając trójwymiarową informację o organizacji naczyń. Stosując środki kontrastowe na bazie jodu, kontrast jest wzmocniony i uzyskuje się jeszcze bardziej szczegółowy obraz mikronaczyń. Ostatnio jakościowa i ilościowa ocena za pomocą mikrotomografii mysich nerek w warunkach fizjologicznych i patologicznych została udoskonalona przez perfuzję kwasem fosfowolframowym (PTA) w celu wzmocnienia kontrastu w obrębie naczyń krwionośnych [106]. Pomimo ograniczenia polegającego na tym, że tętnic i żył nie można było wyraźnie odróżnić od siebie, rozdzielczość przy wielkości woksela 40 µm in vivo i wielkości woksela 12,5 µm ex vivo uchwyciła organizację do poziomu łukowatych naczyń krwionośnych.

Inną poważną wadą stosowania CT do monitorowania choroby nerek jest jednak konieczność stosowania jodowych radiograficznych środków kontrastowych. Wiadomo, że te środki kontrastowe powodują nefrotoksyczność, co jest przeciwwskazaniem do zastosowania klinicznego u pacjentów z istniejącą wcześniej niewydolnością nerek [107–109]. Ostre upośledzenie czynności nerek spowodowane podawanym środkiem kontrastowym zmienia hemodynamikę nerek i powoduje niedotlenienie rdzenia kręgowego, które jest szczególnie niepożądane przy badaniu rozrzedzenia naczyń mikrokrążenia nerkowego. Podobnie środki kontrastowe na bazie gadolinu, szeroko stosowane w MRI, są eliminowane przez nerki i wydają się powodować zaburzenia czynności nerek [110].

4.2.3. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)

MRI został wprowadzony do praktyki klinicznej w latach 80. i od razu stał się jedną z najczęściej stosowanych technik obrazowania [111]. MRI jest nieinwazyjną i niejonizującą metodą obrazowania, w której stosuje się silne pole magnetyczne i stosując zmianę środka kontrastowego T1 i T2 można wykryć właściwości relaksacyjne krwi. Ponadto angiografia rezonansu magnetycznego (MRA) wizualizuje architekturę naczyniową małych zwierząt przy użyciu środka kontrastowego na bazie gadolinu. Jednak główną wadą MRA jest trudność w stosowaniu wymaganego środka kontrastowego. Na szczęście perfuzję nerek można określić bez konieczności stosowania środków kontrastowych, co daje zarówno korzyści, jak i ograniczenia [112].

Bez użycia środka kontrastowego, znakowanie spinowe wykorzystuje wodę endogenną jako dyfundujący znacznik, który umożliwia jedynie ilościową ocenę perfuzji w korze nerkowej, ponieważ czas przejścia przez rdzenia jest zbyt długi, aby można go było uchwycić. Ponadto, aby określić przepływ krwi przez nerki, mierzy się przesunięcia fazowe spinów w jednym kierunku, co implikuje potrzebę prostopadłej płaszczyzny obrazowania w kierunku interesujących tętnic, aby uzyskać dokładny pomiar [112]. Nic więc dziwnego, że technika ta stanowi duże wyzwanie, jeśli chodzi o wizualizację tętnic nerkowych, nie mówiąc już o małych naczyniach włosowatych korowych.

Funkcjonalność naczyń można określić poprzez ilościowe określenie RBF przez perfuzję MR i monitorowanie stanu natlenienia za pomocą obrazowania kontrastem zależnym od poziomu tlenu we krwi (BOLD) [112, 113]. Jednak głównym ograniczeniem czynnościowego rezonansu magnetycznego jest uzyskanie wiarygodnych i powtarzalnych wyników w narządach dotkniętych ruchami oddechowymi, w tym w nerce, mimo że jest ona mniej podatna na artefakty ruchowe w porównaniu z wątrobą czy jelitami [112]. Pomimo faktu, że badania wykonalności wykonane przy użyciu 1,5 tesli funkcjonalnego rezonansu magnetycznego były bardzo obiecujące podczas przeprowadzania kwantyfikacji wokselowej [114], nieprawidłowości perfuzji można było wykryć tylko w obszarach patologicznych, co rodzi pytanie, czy niewielkie zmiany naczyniowe zostaną wystarczająco wykryte. Wraz z wprowadzeniem skanera MRI o sile pola magnetycznego 3,0 Tesli, stosunek sygnału do szumu został znacznie poprawiony [115, 116], jednak uzyskana rozdzielczość pozostaje problemem.

Rozdzielczość zapewniana przez MRI zależy głównie od natężenia pola magnetycznego i może być zoptymalizowana dla dowolnego pola magnetycznego poprzez dostosowanie sekwencji impulsów [111]. Rozdzielczość przestrzenna jest głównie ograniczona przez stosunek sygnału do szumu, który wymaga szybkiego czasu akwizycji i ogólnie osiąga rozdzielczość 3 × 4 mm w rozmiarze piksela [117]. Nawet przy zastosowaniu wysokiego pola magnetycznego 7 Tesli, najlepsza rozdzielczość jaką można osiągnąć za pomocą BOLD wynosi około 500 µm. Oprócz niezadowalającej rozdzielczości i ograniczeń w wizualizacji najbardziej dynamicznych procesów, kolejną poważną wadą jest to, że MRI wiąże się z wysokimi kosztami i wymaga specjalnych urządzeń oraz konserwacji.

4.2.4. Ultradźwięk

Postępy w ultrasonografii wprowadziły zmianę paradygmatu nieinwazyjnego monitorowania strukturalnych i funkcjonalnych zmian mikronaczyniowych nerek oraz otworzyły nowe możliwości badania małych naczyń za pomocą przenośnego systemu przy stosunkowo niskich kosztach. W szczurzym modelu ostrego niedokrwienia spowodowanego ciężką hipoperfuzją przez 1 godzinę, nerkowy przepływ krwi oceniano w czasie rzeczywistym za pomocą ultrasonografii dopplerowskiej w kolorze i fali pulsacyjnej (PW) [118]. Obrazowanie za pomocą kolorowego Dopplera ujawniło również trudności w wizualizacji tętnic łukowatych ze względu na ich stosunkowo mały rozmiar i prostopadłe ustawienie sondy w celu uchwycenia przepływu w tętnicy wymaganego do obliczenia prędkości krwi i zastosowania korekcji kąta Dopplera. Jednak prędkość krwi można było obliczyć tylko w tętnicach wewnątrznerkowych, tj. tętnicach segmentowych, międzypłatowych i łukowatych. W związku z tym nie można było uzyskać informacji o mikrokrążeniu ze względu na ograniczenie rozdzielczości zapewnianej przez konwencjonalne ultradźwięki.

Wraz z wprowadzeniem ultraszybkiej technologii ultradźwiękowej Dopplera można uzyskać większą rozdzielczość dzięki transmisji fal nieostrych, która wysyła jednocześnie kilka fal synchronicznych z dużą liczbą klatek na sekundę w jednym całym polu widzenia, zamiast skanowania linia po linii poprzez zastosowanie transmisja wiązki skupionej [119]. Ta płaska transmisja fali jest podstawową koncepcją ultraszybkiego ultrasonografii dopplerowskiej i umożliwia wykrycie naczyń korowych przeszczepionej nerki ludzkiej o średnicy poniżej 1 mm [120]. Ponadto ultraszybka ultrasonografia dopplerowska zapewnia bardzo korzystną technikę in vivo do monitorowania rozrzedzenia naczyń nerkowych w badaniach przedklinicznych (ryc. 3A). Pomimo postępu ultraszybkiego ultrasonografii dopplerowskiej, dostęp do poziomu naczyń włosowatych nadal zależy od zastosowania środków kontrastowych [121]. Niemniej jednak nie ma wartych wzmianki obaw dotyczących bezpieczeństwa przy stosowaniu środka ze wzmocnionym kontrastem do ultrasonografii dopplerowskiej, szczególnie w porównaniu ze środkami kontrastowymi CT i MRI, które często wykazują nefrotoksyczność [122]. Jednakże, in vivo można osiągnąć niewiarygodną rozdzielczość układu naczyniowego nerki myszy (Figura 3B).

Ultradźwiękowa mikroskopia lokalizacyjna (ULM) rozwiązała kompromis między rozdzielczością przestrzenną a głębokością penetracji, z jednej strony stosując ultraszybkie obrazowanie ultrasonograficzne Doppler, a z drugiej strony wykorzystując ultradźwiękowe środki kontrastowe w postaci mikropęcherzyków wypełnionych gazem [121123124]. Między innymi Errico i in. [123] zaproponowali ULM obrazowanie mikronaczyń czaszkowych o średnicy 10 µm na całej głębokości mózgu myszy o grubości około 10 mm. W niedawnej publikacji Demené et al. [125] mogli uchwycić dynamikę przepływu krwi w naczyniach mózgowych na poziomie mikroskopowym głęboko w ludzkim mózgu, śledząc indywidualnie wstrzykiwane dożylnie mikropęcherzyki, aby poprawić obrazowanie w super rozdzielczości i umożliwić rozdzielczość naczyniową do 25 µm. Aby zrozumieć to niesamowite osiągnięcie, należy wspomnieć, że żadna inna nieinwazyjna metoda obrazowania nie jest w stanie zwizualizować mikronaczyń in vivo w skali milimetrowej. Aby osiągnąć tę niezwykłą rozdzielczość przestrzenną in vivo, trzeba było przezwyciężyć dwa główne wyzwania: aberrację czaszki i artefakty ruchu. Chociaż zastosowanie ULM do narządów jamy brzusznej, takich jak nerki, nie jest utrudnione przez aberrację struktur kostnych, artefakty ruchu stanowią dużą trudność. Jednak ostatnie badania in vivo z powodzeniem dostarczyły pierwszych prób obrazowania unaczynienia nerek za pomocą ULM [5,126,127].

Można było wyróżnić różne przedziały naczyniowe w nerce szczura, a dzięki zastosowaniu mikropęcherzyków zwiększono rozdzielczość, aby uwidocznić cienkie wiązki naczyń waza odbytnicy, które są oddzielone od siebie odległością 400 µm [5]. Dodatkowo oszacowano osiową prędkość krwi, tj. poniżej 2 mm/s, związaną z przepływem mikronaczyń nerkowych, śledząc wstrzykiwane mikropęcherzyki o średnicy 1 µm, które mogą osiągnąć średnicę naczynia mniejszą niż 20 µm. Song i in. [127] wykonali obrazowanie mikronaczyń kory nerkowej królików i mogli wyraźnie oddzielić naczynia in vivo o średnicy 76 µm. Chociaż ruchy oddechowe można korygować, artefakty ruchu poza płaszczyzną pozostają trudne i niemożliwe do skorygowania, ponieważ informacji obrazowych nie można w pełni uzyskać [5].

Ostatnio progresję AKI do PChN badano za pomocą ultraszybkiego ultrasonografii dopplerowskiej ze wzmocnieniem kontrastowym w mysim modelu jednostronnej IRI [6]. Za pomocą wstrzykiwania mikropęcherzyków zidentyfikowano małe naczynia krwionośne nerki o średnicy 32 µm i określono ilościowo zmiany naczyniowe w nerkach, tj. objętość krwi w nerkach, gęstość naczyń i krętość. Gęstość naczyń kory i połączenia korowo-rdzeniowego uzyskana za pomocą ultradźwięków podczas obrazowania in vivo była zgodna z oznaczeniem ilościowym uzyskanym po immunobarwieniu CD31, które jest uznawane za złoty standard w biologii naczyniowej. Jest to zgodne z innym badaniem przeprowadzonym przez Cao et al. [128], który pokazał, że ciężkość AKI można określić za pomocą ultradźwięków ze wzmocnieniem kontrastowym za pomocą wstrzyknięcia mikropęcherzyków. Pomiary perfuzji nerek in vivo są ściśle skorelowane z uszkodzeniem nerek określanym na poziomie histologicznym.

Zgodnie z tymi badaniami USG Hueper i in. [7] wcześniej sugerowali, że perfuzja nerek może przewidywać progresję AKI do PChN w ocenie MRI.

Obrazowanie ultrasonograficzne układu naczyniowego nerek z użyciem mikropęcherzyków zostało już z powodzeniem przeprowadzone u ludzi w celu określenia perfuzji mikronaczyniowej nerek i wykazało duże perspektywy diagnostyczne [129–133]. Co ciekawe, ta metoda obrazowania została zastosowana w transplantacji nerki w celu określenia stanu perfuzji przeszczepów nerki, co może zapewnić odpowiedni nieinwazyjny odczyt w celu przewidzenia ostrego odrzucenia [134]. Poza zależnością od operatora, która może stanowić ograniczenie podczas korzystania z ultrasonografii, siła porozumienia między obserwatorami była bardzo wysoka między dwoma czytelnikami, co odzwierciedla dużą wykonalność w przypadku zastosowania w warunkach klinicznych [132]. Ze względu na przenośność oraz oszczędność czasu i prostą aplikację dostosowaną do indywidualnych potrzeb, ultrasonografia z mikropęcherzykami ze wzmocnionym kontrastem zapewnia wspaniałe perspektywy oceny mikronaczyń nerkowych w praktyce klinicznej, zwłaszcza u pacjentów na OIT [135]. Technologia ta oferuje zatem wielką obietnicę przełożenia na praktykę kliniczną po pomyślnym opanowaniu korekcji artefaktów ruchu brzucha w celu niezawodnego śledzenia mikropęcherzyków z dużą precyzją.

5. Wnioski i perspektywy

Uderzająca heterogeniczność architektury naczyń nerkowych odzwierciedla jej złożoną funkcjonalną różnorodność i kompartmentalizację, z logiczną konsekwencją, że badanie zmian mikronaczyniowych i rozrzedzenia wymaga zaawansowanych metod obrazowania. Opracowanie, zastosowanie i udoskonalenie metod obrazowania in vivo do badania chorób naczyń nerkowych zapewni lepsze zrozumienie działania terapii komórkowych, takich jak MSC, na poziomie naczyń i może wyjaśnić specyficzne biomarkery, które można monitorować podczas progresji choroby.

Bibliografia

1. Cierń, AR Struktura naczyń krwionośnych i rozrzedzenie nerek. kompr. Fizjol. 2013, 3, 817-831. [Odsyłacz] [PubMed]

2. Cierń, małe naczynia AR, duża rola: mikrokrążenie nerkowe i progresja uszkodzenia nerek. Nadciśnienie 2017, 69, 551–563. [Odsyłacz] [PubMed]

3. Ehling, J.; Bábícková, J.; Gremse, F.; Klinkhammer, BM; Baetke, S.; Knochel, R.; Kiessling, F.; Floege, J.; Lammers, T.; Boor, P. Ilościowe obrazowanie tomografii mikrokomputerowej dysfunkcji naczyń w postępujących chorobach nerek. J. Am. Soc. Nefrol. 2016, 27, 520–532. [Odsyłacz] [PubMed]

4. Chen, TK; Gładko, DH; Grams, ME Diagnostyka i leczenie przewlekłej choroby nerek: przegląd. Fizjol. Zachowuj się. 2019, 322, 1294–1304. [Odsyłacz] [PubMed]

5. Foiret, J.; Zhang, H.; Iłowisz, T.; Mahakian, L.; Tam, S.; Ferrara, KW Ultradźwiękowa mikroskopia lokalizacyjna do obrazowania i oceny mikrounaczynienia w nerce szczura. Nauka. Rep. 2017, 7, 13662. [CrossRef] [PubMed]

6. Chen, Q.; Yu, J.; Pośpiech, BM; Stocker, SD; Tan, RJ; Kim, K. Nerka Int. 2020, 98, 355–365. [Odsyłacz] [PubMed]

7. Hueper, K.; Gutberlet, M.; Rong, S.; Hartung, D.; Mengel, M.; Lu, X.; Hallera, H.; Wacker, F.; Meier, M.; Gueler, F. Ostre uszkodzenie nerek: znakowanie spinów tętniczych w celu monitorowania upośledzenia perfuzji nerek u myszy — porównanie z wynikami histopatologicznymi i czynnością nerek. Radiologia 2014, 270, 117-24. [Odn.]

8. Opłata, BI; Schiffrin, EL; Mourad, JJ; Agostini, D.; Vicaut, E.; Safar, ja; Struijker-Boudier, HA Upośledzona perfuzja tkankowa to patologia powszechna dla nadciśnienia, otyłości i cukrzycy. Nakład 2008, 118, 968-976. [Odn.]

9. Carmeliet, P.; Jain, RK Mechanizmy molekularne i kliniczne zastosowania angiogenezy. Natura 2011, 473, 298–307. [Odn.]

10. Molema, G.; Aird, WC Niejednorodność naczyń w nerkach. Nasienie. Nefrol. 2012, 32, 145-155. [Odn.]

11. Armulik, A.; Abramson, A.; Betsholtz, C. Interakcje śródbłonek/perycyt. Okr. Res. 2005, 97, 512-523. 03.16652.d7. [Odn.]

12. Attwell, D.; Mishra, A.; Hala, CN; O'Farrell, FM; Dalkara, T. Co to jest perycyt? J. Cereb. Metab. przepływu krwi. 2016, 36, 451–5. [Odn.]

13. Evans, RG; Eppel, GA; Andersona, WP; Denton, KM Mechanizmy leżące u podstaw zróżnicowanej kontroli przepływu krwi w rdzeniu i korze nerkowej. J. Nadciśnienie. 2004, 22, 1439-1451. [Odn.]

14. Pallone, TL; Silldorffa, PE; Turner, MR Przepływ krwi wewnątrznerkowej: Anatomia mikronaczyniowa i regulacja perfuzji rdzeniowej. Clin. Do potęgi. Pharmacol. Fizjol. 1998, 25, 383–392. doi:10.1111/j.1440-1681.1998.tb02220.x. [Odn.]

15. Pallone, TL; Edwards, A.; Mattson, DL Krążenie rdzenia kręgowego nerek. kompr. Fizjol. 2012, 2, 97-140. [Odsyłacz] [PubMed]

16. Guerci, P.; Ergin, B.; Ince, C. Makro- i mikrokrążenie nerek. Najlepsza praktyka. Res. Clin. Znieczulenie. 2017, 31, 315–329. [Odn.]

17. Shaw, I.; Jeździec, S.; Mullins, J.; Hughes, J.; Péault, B. Pericytes w unaczynieniu nerek: role w zdrowiu i chorobie. Nat. Wielebny Nefrol. 2018, 14, 521-534. [Odn.]

18. Rosivall, L.; Peti-Peterdi, JJ Niejednorodność tętniczek doprowadzających — korelacje między morfologią a funkcją. Nefrol. Wybierz. Przeszczep. 2006, 21, 2703–2707. [Odn.]

19. Stefańska A.; Kenyon, C.; Chrześcijanin, HC; Buckley, C.; Shaw, I.; Mullins, JJ; Péault, B. Pericyty nerek człowieka wytwarzają reniny. Nerka wewn. 2016, 90, 1251–1261. [Odn.]

20. Schlondorff, DO Przegląd czynników wpływających na patofizjologię postępującej choroby nerek. Nerka wewn. 2008, 74, 860–866. [Odn.]

21. Pallone, TL; Zhang Z.; Rhinehart, K. Fizjologia mikrokrążenia rdzenia nerkowego. Jestem. J. Physiol. Ren. Fizjol. 2003, 284, F253-66. [Odsyłacz] [PubMed]

22. Pallone, TL Złożone wiązki naczyniowe, grube kończyny wstępujące i akwaporyny: wykręcanie rdzenia zewnętrznego. Jestem. J. Physiol. Ren. Fizjol. 2014, 306, 505-506. [Odsyłacz] [PubMed]

23. Zimmerhackl, BL; Robertson, CR; Jamison, RL Mikrokrążenie szpikowe. Nerka wewn. 1987, 31, 641-647. [Odsyłacz] [PubMed]

24. Dumas SJ; Meta, E.; Borri, M.; Luo, Y.; Li, X.; Rabelink, TJ; Carmeliet, P. Różnorodność fenotypowa i metaboliczna. Nat. Wielebny Nefrol. 2021, 1-24. [Odn.]

25. Dumas SJ; García-Caballero, M.; Carmeliet, P. Metaboliczne sygnatury odrębnych fenotypów śródbłonka. Trendy Endokrynol. Metab. 2020, 31, 580-595. [Odn.]

26. Jourde-Chiche, N.; Fakhouri, F.; Dou, L.; Bellini, J.; Burley, S.; Format, M.; Jarrot, PA; Kapański, G.; Le Quintrec, M.; Pernin, W.; i in. Budowa i funkcja śródbłonka w zdrowiu i chorobie nerek. Nat. Wielebny Nefrol. 2019, 15, 87-108. [Odn.]

27. Długi, DA; Normana, JT; Świetnie, LG Przywracanie mikrounaczynienia nerek w leczeniu przewlekłej choroby nerek. Nat. Wielebny Nefrol. 2012, 8, 244-250. [Odn.]

28. Choi, YJ; Chakraborty, S.; Nguyen, V.; Nguyen, C.; Kim, BK; Podkładka, SI; Suki, WN; Truong, LD Utrata włośniczek okołokanalikowych jest związana z przewlekłym uszkodzeniem kanalikowo-śródmiąższowym w ludzkiej nerce: Zmieniona ekspresja czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Szum. Patol. 2000, 31, 1491-1497. [Odn.]

29. Ishii, Y.; Sawada, T.; Kubota K.; Fuchinoue, S.; Teraoka, S.; Shimizu, A. Uraz i postępująca utrata naczyń włosowatych okołokanalikowych w rozwoju przewlekłej nefropatii przeszczepu allogenicznego. Nerka wewn. 2005, 67, 321-332. [Odn.]

30. Serón, D.; Alexopoulos, E.; Raftery, MJ; Hartley, B.; Cameron, JS Liczba przekrojów śródmiąższowych naczyń włosowatych ocenionych przez przeciwciała monoklonalne: Związek z uszkodzeniem śródmiąższowym. Nefrol. Wybierz. Przeszczep. 1990, 5, 889–893. [Odn.]