Część 2: Niedobór DHHC21 łagodzi zaburzenia czynności nerek podczas urazu septycznego

Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Dyskusja

W niniejszej pracy opisujemy DHHC21 jako nowy regulator perfuzji nerek i funkcji podczas uszkodzenia septycznego. Nasze nowe odkrycia wskazują: (1) Zdhhc21devde? myszy wykazują lepszą czynność nerek i mniejsze uszkodzenie nerek po uszkodzeniu septycznym w porównaniu z myszami WT; (2) Niedobór czynnościowy DHHC21 zachowuje perfuzję tkanki nerek, wysycenie tlenem i RBF w uszkodzeniu septycznym; (3) Katalizowana palmitoilacja alAR DHHC jest wymagane do aktywacji szlaku sygnałowego alAR i wywołanego przez alAR zwężenia tętnic nerkowych. Badanie to dostarcza nowych mechanistycznych wglądów w regulację perfuzji nerek i czynności podczas uszkodzenia septycznego. Sugerujemy, że niedobór czynnościowy DHHC21 nadaje efekt ochronny nafunkcja nerkiw uszkodzeniu septycznym i że hamowanie DHHC21 może służyć jako strategia terapeutyczna do zwalczaniaNiewydolność nerekpodczas urazu septycznego.

Kliknij tutaj, aby poznać zalety ekstraktu z Cistanche tubulosa

Hipoperfuzja/niedotlenienie tkanki nerkowej jest jedną z głównych przyczyn dysfunkcji nerek podczas urazu septycznego3-5. Wykryliśmy hipoperfuzję nerek u myszy po CLP, o czym świadczy osłabienie intensywności sygnału MSOT całkowitej hemoglobiny, zmniejszenie wysycenia tlenem w tkance nerek i zmniejszenie RBF po uszkodzeniu septycznym. Zgodnie z naszymi ustaleniami, zmniejszenie RBF zaobserwowano u pacjentów z sepsą z uszkodzeniem nerek, a także w modelach urazu septycznego na dużych zwierzętach7,1011. Warto zauważyć, że kilka badań donosi, że dysfunkcja nerek może rozwinąć się u zwierząt z sepsą bez zmian lub nawet zwiększył RBF334. Te rozbieżne wyniki można przypisać różnym modelom zwierzęcym i metodom stosowanym do pomiaru przepływu krwi. Na przykład, chociaż powszechnie stosuje się wywołane przez CLP wielodrobnoustrojowe uszkodzenie septyczne, w niektórych badaniach wykorzystuje się dożylną iniekcję Escherichia coli35.

Ostatnio opisano palmitoilację białek jako nowy regulator funkcji białek, zaangażowany w patogenezę i progresję wielu chorób. Po raz pierwszy została zidentyfikowana jako nowy typ modyfikacji potranslacyjnej przez Schmidta i wsp.3637. Odkrycie rodziny DHHC od tego czasu sprzyjało gwałtownej ekspansji tej dziedziny38,39. Rolę palmitoilacji i PAT opisano w wielu stanach fizjologicznych i patologicznych, w tym w metabolizmie lipidów,nowotwór, choroby sercowo-naczynioweoraz zaburzenia neurologiczne23,0,4. Chociaż wcześniej donoszono o zaangażowaniu palmitoilacji w policystyczną chorobę nerek i raka nerki23., przeprowadzono bardzo ograniczone badania dotyczące funkcjonalnej roli PAT wchoroby nerek, szczególnie w zaburzeniach czynności nerek podczas urazu septycznego. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jako pierwsi zbadaliśmy rolę DHHC2l w dysfunkcji nerek w uszkodzeniu septycznym. Nasze odkrycia wskazują, że hamowanie DHHC21 znacznie ratuje funkcję nerek i zachowuje strukturę nerek w przypadku uszkodzenia septycznego.

Nasze badanie z wykorzystaniem Zdhhc21dp/d4? myszy wykazują, że korzystny wpływ niedoboru czynnościowego DHHC21 na czynność nerek przypisuje się jego zdolności do poprawy perfuzji tkanki nerek podczas uszkodzenia septycznego. W warunkach podstawowych myszy Zdhhc21ewaeP nie wykazują oznak nierównowagi soli/wody ani strukturalnego/funkcjonalnego uszkodzenia nerek5. Jednak utrata funkcji DHHC21 hamuje wywołane uszkodzeniem septycznym zmniejszenie RBF, perfuzji nerek i nerkowego wysycenia tlenem. Zwiększony opór naczyń nerkowych spowodowany nadmiernym skurczem naczyń nerkowych jest uważany za główną przyczynę upośledzenia perfuzji tkanki nerkowej w uszkodzeniu septycznym6.9. Nasze wyniki wskazują na udział alAR w pośredniczeniu w hipoperfuzji tkanki nerkowej wywołanej uszkodzeniem septycznym, o czym świadczy wzrost palmitoilacji alAR i aktywacja szlaku sygnałowego alAR w uszkodzeniu septycznym. Jednakże, niedobór czynnościowy DHHC21 hamuje palmitylację alAR i powoduje osłabienie zdolności alAR do aktywacji jego efektora w dół i pośredniczenia w indukowanym fenylefryną skurczu naczyń w tętnicach nerkowych.

„Mechanizm molekularny leżący u podstaw regulacji funkcji alAR przez DHHC21 wciąż nie został w pełni wyjaśniony. Defekt funkcji alAR spowodowany utratą funkcji DHHC21 można przypisać zmianie konformacji alAR. Konformacja wewnątrzkomórkowa, Przyłączony palmitynian w ogonach C-końcowych GPCR wstawia się do błony komórkowej, tworząc czwartą pętlę wewnątrzkomórkową, która jest niezbędna do interakcji GPCR z białkami partnerskimi i propagacji sygnałów GPCR17,4. wykazali, że palmitoilacja Albar występuje również w jego regionie C-końcowym 44. Dlatego brak palmitoilacji lAR, w której pośredniczy DHHC21-, może zmienić konformację wewnątrzkomórkową alAR, blokując w ten sposób propagację sygnałów lAR. nasze wyniki pokazujące, że aktywacja ERK, późniejsze zdarzenie sygnalizacyjne aktywacji alAR, jest hamowana u myszy Zdhhc21devider poddanych sept uraz lodem. Jednakże topologia regulowana przez DHHC21-terminalu karboksylowego alAR wymaga dalszego potwierdzenia za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Innym nowatorskim aspektem naszych badań jest wykorzystanie MSOT do oceny perfuzji nerek i funkcji podczas urazu septycznego. Opisano, że MSOT jest nieoznakowaną metodą pomiaru perfuzji różnych narządów i wiarygodną techniką obrazowania w celu określenia czynności nerek2832,45. W porównaniu z przepływomierzem dopplerowskim, który nie pozwala na wizualizację mikrounaczynienia45, MSOT generuje obrazy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej przy 150 µm, zapewniając jednocześnie ilościową ocenę stanu perfuzji w układzie mikronaczyń nerkowych. Rozpuszczalny w wodzie IRDye800CW jest bezpiecznym wskaźnikiem do pomiaru klirensu nerkowego i nie wywołuje toksyczności przy dawce tak wysokiej jak 20 mg/kg. Zaobserwowany przez nas dwufazowy ruch IRDye800CW jest zgodny z wcześniej opublikowanymi badaniami. Nasze zapisy MSOT wskazują na większe opóźnienie Tmax w nerkach z posocznicą, co sugeruje upośledzony klirens nerkowy. Badanie nefropatii wykazało, że zaburzenia czynności nerek wykryte przez MSOTis istotnie korelowały z kłębuszkowym uszkodzeniem histologicznym30. Nasze dane, zgodne z wcześniejszymi publikacjami, sugerują, że MSOT jest małoinwazyjną i niezawodną techniką monitorowania perfuzji i funkcji nerek.

Obecnie nie są dostępne żadne specyficzne inhibitory DHHC21-. Najczęściej stosowanym inhibitorem PAT jest 2-BP, który ma szeroki wpływ na wiele DHHC, a także zaburza metabolizm kwasów tłuszczowych47. Tak więc opracowanie inhibitorów drobnocząsteczkowych, które są ukierunkowane konkretnie na DHHC21, byłoby obiecującym kierunkiem. Warto również zaznaczyć, że alAR nie jest jedynym substratem DHHC21. Ostatnio zidentyfikowano kilka innych substratów DHHC21, w tym cząsteczkę adhezji komórek śródbłonka płytek krwi (PFCA M-1), kaweolinę receptora estrogenowego-1, śródbłonkową syntazę tlenku azotu (eNOS), Fyn, dysmutazę ponadtlenkową (SOD{{). 8}}) oraz PLCB122,41,4s,49. Mimo że wykracza poza zakres niniejszego badania, nie możemy wykluczyć, że te substraty mogą również wpływać na czynność nerek podczas urazu septycznego.

Podsumowując, niniejsze badanie pokazuje po raz pierwszy, że DHHC21 odgrywa kluczową rolę w regulacji perfuzji nerek podczas uszkodzenia septycznego poprzez mechanizmy obejmujące palmitoilację alAR i zwężenie naczyń za pośrednictwem alAR. Ponadto hamowanie DHHC21 wywiera działanie ochronne na czynność nerek podczas uszkodzenia septycznego.

Materiały i metody

Odczynniki. Wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli Uzupełniającej S1.

Zwierząt. Myszy Zdhhc21depher i ich myszy kontrolne typu dzikiego (B6C3Fe) zakupiono z Jackson Laboratory. Genotyp Zdhhc21dephe? myszy potwierdzono przez sekwencjonowanie (Genewiz, Inc., NJ, USA). Startery zastosowane do sekwencjonowania to: AGCTGACTGAAGGGCACC (przód) i AAAACCTGTAACGCATTTCCA (odwrotny)23. Zwierzęta utrzymywano w 12/12-h cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. W tym badaniu użyto myszy (16-20 tygodni) obu płci. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zatwierdzone przez instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania przy Uniwersytecie Południowej Florydy i są zgodne z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania laboratorium

Podwiązanie i nakłucie kątnicy. Myszy znieczulono izofluranem (3% indukcji i 1% podtrzymania). Wykonano nacięcie w linii środkowej w ogolonym obszarze brzusznym i jelito ślepe wyprowadzono na zewnątrz, ciasno podwiązano 5 mm poniżej zastawki krętniczo-kątniczej i dwukrotnie przedziurawiono igłą {{3}gauge dystalną do miejsca podwiązania. Z każdego nakłucia wyciskano 1 mm kału. Następnie przeniesiono kątnicę, a brzuch zamknięto w dwóch warstwach. 37 C Roztwór Ringera z dodatkiem mleczanu zastosowano miejscowo, aby zapobiec wysychaniu kątnicy. Myszom następnie podawano podskórnie roztwór soli fizjologicznej o stężeniu 37 stopni 0 9,9% w celu resuscytacji płynowej. W celu znieczulenia podano przedoperacyjną dawkę 0.5-1.5 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu. Myszy pozorowane poddano tej samej procedurze chirurgicznej, ale bez podwiązania kątnicy i nakłucia50,51.

Wielospektralna tomografia optoakustyczna. Ocena wydalania nerkowego IRDye800CW. Myszy znieczulono izofluranem i poddano depilacji w okolicy tułowia. Myszy obrazowano za pomocą systemu obrazowania Altera Medical MSOT (Monachium, Niemcy) przy wielu długościach fal:700,730,760,775,785,800,850 nm z szybkością 10 klatek/s. Myszy umieszczano w pozycji leżącej na plecach w uchwycie i przesuwano wzdłuż poziomego stolika liniowego, aby umieścić nerki na górze wklęsłego przetwornika o stałej pozycji. Po zarejestrowaniu linii podstawowej, 60 nmol RDve800CW rozpuszczonego w 100 ul 0,9% soli fizjologicznej wstrzykiwano dożylnie przez 10 sekund. Obrazy zostały zrekonstruowane przy użyciu wzoru projekcji wstecznej i przetworzone za pomocą analizy wielospektralnej. Obszary zainteresowania (ROI) narysowano wokół kory nerkowej i regionu rdzenia/miednicy, a także przedstawiono czasowe zmiany sygnału MSOT w obszarach ROI.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Histopatologia nerek. Nerki utrwalono, pocięto wzdłuż płaszczyzny strzałkowej i poddano obróbce do zatapiania w parafinie. Skrawki 5 μm odparafinowano, ponownie uwodniono i utleniano kwasem nadjodowym przez 8 min w temperaturze pokojowej (RT), a następnie inkubowano z roztworem Schiffa przez 25 min. Skrawki następnie wybarwiono kontrastowo hematoksyliną. Obrazy wykonano przy użyciu Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, USA). Uszkodzenie strukturalne nerek oceniano na podstawie następujących cech: nieprawidłowości kłębuszków nerkowych, utraty rąbka szczoteczkowego kanalika bliższego, wakuolizacji, poszerzenia nabłonka kanalików, odwarstwienia/martwicy komórek kanalików oraz nacieku neutrofili. Każda funkcja została oceniona w skali 0-5 na podstawie wagi.

Pomiar kreatyniny i azotu mocznikowego we krwi. Krew myszy pobierano przez nakłucie serca 24 godziny po uszkodzeniu septycznym. Osocze wytworzono przez odwirowanie krwi przy 2500 g przez 15 min w RT. Pomiar kreatyniny: osocze odbiałczono przy użyciu kolumny wirowej 10-kDa; poziomy kreatyniny w przesączu mierzono następnie za pomocą zestawu do oznaczania kreatyniny. Poziom azotu mocznikowego we krwi (BUN) określono przy użyciu zestawu do wykrywania kolorymetrycznego azotu mocznikowego zgodnie z instrukcjami producenta.

Pomiar RBF i MAP. Myszy znieczulono izofluranem. Przetwornik ciśnienia krwi wprowadzono do tętnicy szyjnej. Wykonano nacięcie pośrodkowe w okolicy brzucha, a następnie lewe nacięcie poprzeczne w celu odsłonięcia tętnicy nerkowej. RBF mierzono za pomocą ultradźwiękowego przepływomierza czasu przejścia (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA). Po umieszczeniu sondy przepływowej wokół odsłoniętej tętnicy nerkowej, myszy pozostawiono do ustabilizowania przez co najmniej 30 min. RBF i MAP rejestrowano jednocześnie przy użyciu PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA). Dane analizowano za pomocą oprogramowania LabChart Pro w wersji 74,55

Przechwytywanie wspomagane żywicą. Tętnice nerkowe zebrano i poddano lizie w buforze do lizy (100 mM HEPES.25 mM NaCl,1 mM EDTA,10 μM palmostatyny B, inhibitory proteazy, pH 7,4）22, 56. Lizaty tkankowe inkubowano z buforem blokującym (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5% SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7,4) w temperaturze 50°C przez 30 minut z ciągłym worteksowaniem. Po wytrąceniu zimnym acetonem białka były osadzony przez odwirowanie przy 5000 g przez 30 min i przemyty pięciokrotnie 70% zimnym acetonem. Osady białkowe ponownie zawieszono w buforze wiążącym (100 mM HEPES, 1,0% SDS, 1 mM EDTA, pH 7,4). Stężenie białka określono i znormalizowano pomiędzy grupami Każda próbka białka została podzielona na dwie równe części, z których każda otrzymała taką samą ilość kulek izopropylo-sefarozy 6B, do każdej części dodano odpowiednio hydroksylaminę (0,2 M, pH 7,4) i NaCl (0,2 M). Po 4 h inkubacji w temperaturze pokojowej przy stałej rotacji, palmitoilowane białka eluowano 50 mM DTT w 1x buforze próbki i zbierano do SDS-PAGE.

Western blotting. Pomiar palmitoilowanego LAR. Próbki zebrane z RAC załadowano na 4-20 procent żel Tris-Glycine i przeniesiono na membranę nitrocelulozową po elektroforezie. Po blokowaniu przez 1 hw RT, alAR sondowano pierwszorzędowym przeciwciałem króliczym anty-lAR (1:500) przez noc w 4 stopniach. Po trzykrotnym przemyciu TBST, membranę inkubowano z drugorzędowym ośle przeciwciałem przeciwkróliczym IRDye800CW (1:20, 000) przez 45 min w temperaturze pokojowej.

Pomiar fosforylacji ERK. Tętnice nerkowe poddano lizie w 1xRIPA zawierającym inhibitory proteazy i fosfatazy. Membranę sondowano króliczymi przeciwciałami anty-ERK (1:1000) i mysimi anty-fosforylowanymi ERK (1:1000). Do wtórnej inkubacji (1:20 000) użyto ośle anty-mysie przeciwciała IRDye800CW oraz ośle anty-królicze przeciwciała IRDye680RD. Błony zostały zobrazowane i przeanalizowane przy użyciu Li-COR Odyssey CLx.

Ocena wazoreaktywności za pomocą miografu przewodowego. Tętnice nerkowe myszy. Tętnice nerkowe o średnicy {{0}} μm wyizolowano od myszy WT i Zdhhc21dp/de i zanurzono w lodowato zimnym, natlenionym (95% O,/5 procent CO.) fizjologicznym roztworze soli fizjologicznej (PSS,13{). {47}} mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,18 mM KH,PO,1,17 mM MgSO.7H,O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glukoza, 0,026 mM EDTA i 1,6 mM CaCl, pH 7,4). Segmenty naczynia (~ 2 mm długości) zamontowano na drucianej komorze miografu (Living Systems Instrumentation, VT, USA) pomiędzy dwoma drutami wolframowymi (o średnicy 30 μm). Napięcie izometryczne rejestrowano za pomocą kondycjonera sygnału Living Systems (MYO-SC-1) sprzężonego z oprogramowaniem LabScribe v4 iWorks. Po doprowadzeniu do stanu równowagi przez 30 min przy 37 stopniach Cin PSS przeprowadzono procedurę normalizacji w celu określenia optymalnego obwodu wewnętrznego L,=0.9×L(Lo=obwód wewnętrzny, który odpowiada ciśnieniu przezściennemu 100 mmHg) . Następnie żywotność naczynia badano za pomocą 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,18 mM KH, PO1,17 mM MgSO.7H,O,14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glukozy, 0,026 mM EDTA, 1,6 mM CaCl, pH 7.4). Tętnice, które nie odpowiedziały na KPSS, zostały odrzucone. Tętnice leczono wzrastającymi stężeniami fenylefryny – 10 nM-30 μM）. Integralność śródbłonka oceniano następnie stosując acetylocholinę (10 μM). Skonstruowano krzywe stężenie-odpowiedź.

Małe tętnice z ludzkich nerek. Małe tętnice (o średnicy ~1000 μm) wycięto z nienaruszonych, żywotnych ludzkich nerek, które odrzucono do operacji przeszczepu. Segmenty naczynia (o długości ~2 mm) zostały zamontowane na dwuteownikach (o średnicy 250 um) drucianej komory miografu. Podobne procedury równoważenia i normalizacji przeprowadzono na tętnicach ludzkich. Następnie tętnice inkubowano z kontrolą nośnika (0,02% DMSO w PSS) przez 1 godzinę. Naczynia testowano następnie pod kątem żywotności za pomocą 60 mM KPSS i traktowano rosnącymi stężeniami fenylefryny (10 nM-30 uM). Po wypłukaniu naczynia inkubowano z 2-BP (100 uM) przez 1 godzinę; żywotność naczynia była następnie ponownie testowana z 60 mM KPSS z 100 uM 2-BP. Małe tętnice z brakiem lub zmniejszoną odpowiedzią na KPSS zostały odrzucone. Następnie tętnice poddano prowokacji tymi samymi stężeniami fenylefryny, a następnie acetylocholiny (10 uM). Skonstruowano i porównano krzywe stężenie-odpowiedź dla tętnic traktowanych nośnikiem lub tętnic traktowanych 2-BP.

Immunofluorescencja. Tętnice nerkowe człowieka utrwalano w 10% formalinie przez 48 godzin, zatapiano w parafinie i dzielono na skrawki. Szkiełka zostały następnie odparafinowane, uwodnione i permeabilizowane PBS zawierającym 0,05% Triton X-1002. Po zablokowaniu szkiełka znakowano króliczymi przeciwciałami anty-DHHC21 i kozim anty-lAR (1:100) przez noc w 4 st. C. Po przemyciu przeprowadzono inkubację przeciwciał wtórnych z ośle anty-króliczy Alexa Fluor 488 i oślą anty-kozie Alexa Fluor 568 (1:500). Po zamocowaniu za pomocą podłoża montażowego ProLong Diamond z DAPI, szkiełka zostały zobrazowane za pomocą odwróconego spektralnego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP8.

Analiza statystyczna. Szczegółowe informacje (np. nazwa testu, test post-hoc, wartość n, poziom alfa, wartość p) dla każdego testu statystycznego są wymienione w tabeli uzupełniającej S2. Wszystkie dane spełniają założenie rozkładu normalnego. Test normalności wykonano testem Shapiro-Wilka z poziomem alfa ustawionym na 0.05. Porównania między dwiema grupami analizowano za pomocą testu t-Studenta (dwustronnego), a trzy lub więcej grup porównywano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji ANOVA z analizą post-hoc Tukeya. Porównanie dla krzywych miografów przewodowych przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej ANOVA.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">