Część 2: Interakcje kwasu askorbinowego, 5-kwasu kawoilochinowego i kwercetyny-3-Rutynozyd w obecności i nieobecności żelaza podczas obróbki termicznej oraz wpływ na aktywność przeciwutleniaczy

Po więcej informacji. kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Kliknij link, aby poznać szczegóły części 1:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-kawiarnia-54916714.html

3. Dyskusja

3.1. Zależność struktura-aktywność kwasu askorbinowego, 5-kwasu kawioilochinowego i kwercetyny-3-rutynozydu

Pierwszy wskaźnik AOA, mierzony dla różnych substancji w zależności od zależności struktura-aktywność, wynikał z liczby grup funkcyjnych. Porównując wszystkie trzy analizowane substancje, kwas askorbinowy miał najniższy AOA, następnie kwas 5-kafeoilochinowy, natomiastkwercetyna-3-rutynozydosiągnął najwyższy AOA. Csepregi i in. [14] stwierdzili tę samą kolejność porównując AOA tych trzech związków. Ten ranking można wyjaśnić całkowitą liczbą grup hydroksylowych: kwercetyna-3-rutynozyd ma dziesięć, kwas 5-kafeoilochinowy ma pięć, akwas askorbinowyma cztery. Doflawonoidy, całkowitą ilość grup hydroksylowych i ich wpływ na mechanizmy AOA wykazali wcześniej Burda i Oleszek[15]. Szczególnie cenne w strukturach enediolowych są grupy hydroksylowe, które łatwo utleniają się do diketonów [8]. W analizowanych substancjach struktura endiolu ma również znaczenie dla zdolności do tworzenia kompleksów z jonami metali [16-18]. Struktura endiolu występuje w cząsteczkach kwercetyny-3-rutynozydu i kwasu 5-kafeoilochinowego w pierścieniu fenylowym, co może również wpływać na silniejszy AOA tych związków. Dalsze badania wykazały, że na AOA mogą również wpływać inne struktury cząsteczek. Na kwasy fenolowe prawdopodobnie wpływają grupy kwasu karboksylowego, np. kwas hydroksyfenylooctowy (R-CH=CH-COOH) jest słabszą grupą odciągającą elektrony w porównaniu z kwasem hydroksycynamonowym (R-CH,-COOH), jako kwas kawowy w kwasie 5-kafeoilochinowym [19]. We flawonoidach aglikony miały wyższe AOA niż odpowiadające im glikozydy [20,21], w przypadku kwercetyny-3-rutynozydu, glikozydu, AOA aglikonukwercetynajest w konsekwencji wyższy [14]. Istnieje wiele różnych grup funkcyjnych, które mogą wpływać na AOA, w związku z czym ważne jest stosowanie różnych testów testowych z różnymi mechanizmami, takimi jak przeniesienie pojedynczego elektronu (SET), przeniesienie atomu wodoru (HAT) i sekwencyjna utrata elektronów transfer (SPLET) do wykrywania. Każdy mechanizm, a nawet zastosowany odczynnik testowy, może wykryć różne struktury związków bioaktywnych [22].

3.2.Wpływ obróbki termicznej i interakcji strukturalnie różnych przeciwutleniaczy na aktywność przeciwutleniającą przy braku żelaza mineralnego

Stabilny AOA w wydłużonym czasie 40 min obróbki termicznej wskazuje, że degradacja termiczna ma mniejsze znaczenie niż początkowo zakładano. Ponadto dane HPLC wykazały, że czysty kwas 5-kafeoilochinowy i kwercetyna-3-rutynozyd były stabilne, z maksymalną degradacją wynoszącą 20 procent podczas obróbki termicznej. Poprzednie badania wykazały stabilność kwasu 5-kafeoilochinowego do normalnej temperatury wrzenia wody [23], podczas gdy Dawidowicz i Typek [24] znaleźli dziewięć pochodnych związków, po ogrzewaniu kwasu 5-kafeoilochinowego przez 5 godzin w odpływ. Dla stężenia kwasu askorbinowego stwierdzono degradację po 40 minutach gotowania. Czynnikami wpływającymi, powodującymi degradację kwasu askorbinowego bez żelaza w roztworze wodnym, mogą być wartości pH, ekspozycja na światło, utlenianie, temperatura i różne stężenia [25,26]. W tym badaniu główną rolę najprawdopodobniej odegrały temperatura i stężenie, ponieważ procesy utleniania zostały zredukowane do minimum ze względu na minimalną przestrzeń gazową w mikrorurkach. Możliwe, że pozostała faza gazowa wciąż wystarcza do degradacji w warunkach tlenowych. Różne warunki skutkują różnymi produktami [27,28], więc w tym badaniu, po 40 minutach gotowania, można było znaleźć produkty w obu warunkach. Yuan i Chen [28] poinformowali, że furfural, kwas 2-furoowy, 3-hydroksy-2-piron i nieznana substancja są głównymi produktami degradacji kwasu askorbinowego w roztworze wodnym w zależności od wartości pH . Shinoda i in. [29,30] znaleziono w soku pomarańczowym produkty rozkładu furfural, kwas 2-furoesowy, 5-hydroksymaltol, 3-hydroksy-2-piron i 5-(hydroksymetyl )furfural. Hsu i in. [31] przeanalizowali kwas askorbinowy w roztworach etanolowych i wykryli kwas 2-furoowy i 3-hydroksy-2-piron. W zależności od warunków tlenowych lub beztlenowych wykrytymi pochodnymi kwasu askorbinowego (piki 3 i 4) mogą być furfural, kwas 2-furoesowy, 3-hydroksy-2-piron lub półprodukty. Kwas askorbinowy obniżył się w relacji dawka-odpowiedź, a wyższe stężenia kwasu askorbinowego wykazywały niższe współczynniki degradacji podczas gotowania. Kwas askorbinowy wydaje się stabilizować w wyższych stężeniach, prawdopodobnie dzięki wiązaniom wodorowym i energii van de Waalsa [32].

W mieszaninach binarnych i trójskładnikowych stwierdzono głównie dodatkowy wpływ na AOA. W mieszaninach binarnych, jeśli substancja o wyższym AOA wzrosła w swoim stężeniu, AOA ich kombinacji również wzrosła. Inne badania wykazały również działanie addytywne między (plus)-katechiną (200 μm) a kwasem askorbinowym (50-200 mg/L)[33] oraz między binarnymi mieszaninami różnych monoterpenów[34]. Jedynie w teście DPPH stwierdzono antagonistyczne efekty w kwasie 5-kafeoilochinowym połączonym z kwercetyną-3-rutynozydem oraz w mieszaninach trójskładnikowych z podwojonymi stężeniami kwercetyny-3-rutynozydu. Mogło to być spowodowane orientacją cząsteczek w przestrzeni, zwłaszcza kwercetyny-3-rutynozydu, jako dość dużej cząsteczki, oraz steryczną dostępnością cząsteczki rodnika DPPH [35]. W teście TPC połączenie kwasu askorbinowego i kwasu 5-kafeoilochinowego skutkowało silnymi efektami antagonistycznymi w stosunku 1:2, podczas gdy odwrócone mieszaniny o stosunku 2:1 skutkowały silnymi efektami synergistycznymi, przekraczającymi sumę odpowiednie AOA. Kwas askorbinowy o podwójnym stężeniu może w tych warunkach dodatkowo wzmocnić AOA, ze względu na samostabilizację, po której następuje stabilizacja innych cząsteczek, co wykazano w tym eksperymencie za pomocą kwasu 5-kafeoilochinowego. W soku granatowo-nektarynowym pomiędzy naturalnymi fenolami a kwasem askorbinowym stwierdzono takie samo oddziaływanie, natomiast w soku winogronowym zaobserwowano nasilanie działania antagonistycznego poprzez zwiększenie stężenia kwasu askorbinowego [36]. Wyniki te sugerują, że mieszaniny kwasu askorbinowego, 5-kafeoilochinowego i kwercetyny-3-rutynozydu osiągają najwyższy potencjał AOA, gdy są najsilniejszeprzeciwutleniaczesą obficie dostępne.

Kliknij, aby dowiedzieć się więcej o produktach

3.3. Wpływ żelaza mineralnego

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>kwas askorbinowy. Jednak dodatek żelaza do mieszanin miał wpływ na wyniki testów TEAC i DPPH, podczas gdy testy TPC pozostały bez zmian. Z tego powodu ważne jest, aby podczas pracy z próbkami bogatymi w żelazo stosować różne testy testowe o różnych mechanizmach działania.

Jedynie w teście DPPH AOA czystej kwercetyny-3-rutynozydu oraz w połączeniu z kwasem askorbinowym, równomolowe lub nierównomolowe z podwojonymi stężeniami kwercetyny-3-rutynozydu, miały niższe wartości w obecności żelaza. Boligon i in. [351] wyjaśnił, że test DPPH lepiej wykrywa mniejsze antyoksydanty, ze względu na steryczną dostępność tych rodników. Przypuszczalnie, kwercetyna-3-rutynozyd z dwoma stronami wiążącymi może tworzyć całkiem duże kompleksy z żelazem, a zatem być niedostępnym w teście. Jak wspomniał Kejic i in. [8] można to wyjaśnić tworzeniem kompleksów supramolekularnych poprzez koordynację jonów metali. W połączeniu z kwasem askorbinowym, który jest zdolny do tworzenia kompleksów o mieszanej wartościowości w stosunku 1:2 [12], przypuszczalnie te większe mieszane kompleksy nie mogą oddziaływać z rodnikiem DPPH. W przeciwieństwie do wyników w tym badaniu, inne badania [18,37,38] wykazały, przy użyciu testu DPPH, że kompleksy kwercetyny-3-rutynozydu są skuteczniejszymi przeciwutleniaczami niż czysta kwercetyna-3-rutynozyd. Wiadomo, że kompleksy chelatowe flawonoidów i jonów metali mogą negować rodnikową aktywność skompleksowanych jonów metali [39]. Jedyna różnica polegała na tym, że w badaniu tym zastosowano siarczan amonowo-żelazowy (II) zamiast chlorku lub siarczanu żelaza (ⅡI) stosowanego w pracy Symonowisa i Kolandka [39].

Stwierdzono działanie synergistyczne między kwasem askorbinowym i kwasem 5-kafeoilochinowym w obecności żelaza w stosunku 2:1 oraz działanie antagonistyczne w stosunku 1:2. Połączenie kwasu 5-kafeoilochinowego z żelazem nie było zalecane in vivo [6]. Jednak to badanie wykazało, że in vitro podwojona ilość kwasu askorbinowego w porównaniu z kwasem 5-kafeoilochinowym może mieć nawet synergistyczny wpływ na AOA. Dalsze badania dotyczące wskaźników mogą wykazać, czy pozytywne efekty można osiągnąć również in vivo.

Zgodnie z danymi HPLC, dodanie żelaza do próbki będzie miało minimalny wpływ na jej aktywność katalityczną, ponieważ zmniejszyło się tylko stężenie kwasu askorbinowego w 0 min gotowanych próbkach. W próbkach gotowanego kwasu askorbinowego, w przeciwieństwie do próbek bez żelaza, wyższe stężenia kwasu askorbinowego prowadziły do ​​wyższego współczynnika degradacji.5-Kwas kofeowlinowy i kwercetyna-3-rutynozyd wymagają dodatkowych czynników temperatury i czasu, a także oddziaływania w mieszaninach, aby katalityczna aktywność żelaza działała. Rutynozyd kwercetyny-3-, w obecności żelaza, po obróbce termicznej zmniejszał się jedynie w mieszaninach binarnych z kwasem askorbinowym. Może to wynikać z faktu, że flawonoid działa jako główny przeciwutleniacz, a następnie powstały rodnik związku reaguje z kwasem askorbinowym, regenerując pierwotny związek [18]. 5-Kwas kawoilochinowy wydaje się być wyjątkowy, ponieważ chroni kwercetynę-3-rutynozyd, podczas gdy kwas askorbinowy nie jest w stanie chronić kwercetyny-3-rutynozydu. Stąd kwas 5-kafeoilochinowy może być kluczową cząsteczką do stabilizacji układu w połączeniu z żelazem i obróbką termiczną. Ta hipoteza o kwasie 5-kafeoilochinowym jako cząsteczce stabilizującej została dodatkowo potwierdzona w mieszaninach trójskładnikowych. Tutaj kwercetyna-3-rutynozyd była zawsze stabilizowana kwasem 5-kafeoilochinowym, tak że nawet w obecności kwasu askorbinowego nie zaobserwowano zmniejszenia stężenia kwercetyny-3-rutynozydu. W innym badaniu kwas 5-kafeoilochinowy wykazał właściwości ochronne przed degradacją antocyjanów poprzez mechanizm kopigmentacji [40]. Nowe produkty degradacji, o prawdopodobnie wyższym AOA, pojawiły się ze wszystkich trzech substancji w obecności żelaza. Kwas kawowy (pik 6) zidentyfikowano jako produkt rozpadu kwasu 5-kafeoilochinowego (dane nie pokazane). Doprowadziło to do założenia, że ​​inną substancją może być kwas chinowy lub jedna z dziewięciu możliwych pochodnych opisanych przez Dawidowicza i Typeka [24]: kwas chinowy;(1S,3R,4R,5R)-5-[{24 }}(3,4-dihydroksyfenyl)-2-hydroksypropanoil]-1,4,5-trihydroksycykloheksanokarboksylowy;(1S3R,4R,5R)-5- Kwas [3-(3,4-dihydroksyfenylo)-3-hydroksypropanoilo]-1,4,5 trihydroksycykloheksanokarboksylowy; kwas trans 3-O-kafeoilochinowy; kwas trans 5-O-kafeoilochinowy; kwas trans 4-O-kafeoilochinowy; kwas kawowy; kwas cis-5-O-kafeoilochinowy; 4,5-kwas dikawoilochinowy. W przypadku kwercetyny-3-rutynozydu na chromatogramie pojawia się produkt degradacji, którego nie można było zidentyfikować.

3.4. Zdolność do tworzenia chelatów z żelazem (Fe3 plus ) i żelazem (Fe2 plus )

We wszystkich próbkach zawierających kwas askorbinowy żelazo żelazowe zostało zredukowane do żelaza żelazawego. W tym procesie,kwas askorbinowypobiera elektron z żelaza żelazowego i redukuje go do żelaza żelazawego i sam staje się rodnikiem. Niestabilny rodnik szybko przekształca się w kwas dehydroaskorbinowy i dalsze produkty degradacji [12]. Ze względu na brak nadtlenku hydroksylowego, reakcja z powrotem do żelaza w cyklu Fentona nie jest możliwa. W 0 min gotowanych dwuskładnikowych mieszaninach ponad 20 procent żelaza było związane w obecności kwasu askorbinowego. Wiadomo, że kwas askorbinowy tworzy kompleksy z cząsteczkami żelaza i innymi jonami metali poprzez chelatowanie przez jądra 3-O i 2-O po przesunięciu wodoru z 3-OH i 2- Grupy OH [16,17,41. Może również tworzyć kompleksy żelazowo-askorbinianowe o mieszanej wartościowości [42]. Jednak kwas askorbinowy jest słabym środkiem chelatującym i po gotowaniu w czystych i mieszanych próbkach, w których obecny był kwas askorbinowy, wykryto jedynie śladowe ilości związanego żelaza. Ponadto w wyniku procesu gotowania kwas askorbinowy rozkłada się na produkty degradacji, które wydają się niezdolne do chelatowania z żelazem.

5-Kwas kawioilochinowy jest stosunkowo słabym środkiem redukującym. Żelazo żelazowe zostało zredukowane przez kwas 5-kafeoilochinowy, a przy dłuższym gotowaniu, redukcja wzrosła.5-Chelaty kwasu kawoilochinowego z żelazem żelazowym w przenoszeniu ładunku ligand-metal [17].5-Kwas kawoilochinowy niesie jedną możliwą stronę wiązania w strukturze 3,4-endiolowej kwasu kawowego. Może to wskazywać, dlaczego kwas kawowy jest bioaktywną częścią kwasu 5-kafeoilochinowego, podczas gdy kwas chinowy prawie nie ma AOA [43]. Endiole hamowały tworzenie OH dzięki tworzeniu kompleksu żelaza[41]w stosunku jeden do jednego [44,45]. Lamy i in. [46] doszli do wniosku, że kwas 5-kafeoilochinowy tworzy kompleksy monomeryczne, podczas gdy Kiss i in. [47] znaleźli gatunki oligomeryczne. W przeciwieństwie do poprzednich badań [17,48], w obecności kwasu 5-kafeoilochinowego przed i po obróbce termicznej znaleziono tylko ślady związanego żelaza. Można to wytłumaczyć obojętnymi warunkami pH w tym badaniu, podczas gdy inne badania działały w środowisku kwaśnym, w oparciu o wartość pH z 1-2.5 w ludzkim żołądku [48]. Po kilku godzinach w przechowywanych próbkach znaleziono czarny osad, który jest wskaźnikiem kompleksów kwas 5-kafeoilochinowy-żelazo. Do analizy użyto niedawno zmieszanych próbek, więc tworzenie się tych kompleksów przy obojętnym pH wymaga dłuższego czasu. Kompleksy żelaza z kwasem kawowym wykazywały niewielką aktywność zmiatania [49]. Co więcej, nie ma dowodów spektrofotometrycznych na reakcję między kwasem chinowym a żelazem żelazowym [48]. W przeciwieństwie do kwasu 5-kafeoilochinowego, w próbce kwercetyny-3-rutynozydu, znaleziono związane żelazo, nawet po obróbce termicznej.

Kwercetyna-3-rutynozyd redukował żelazo żelazowe do żelaza żelazawego przy minimalnym wzroście przez dłuższy czas gotowania. Ta umiarkowana aktywność redukująca kwercetyny-3-rutynozydu została wcześniej opisana przez Mira i in. [50]. Aktywność redukującą żelazo kwercetyny-3-rutynozydu wykryto w 3-rutynozydzie, 5,7,3',4'-OH [50]. Umiarkowane oddziaływanie z żelazem żelazowym można wyjaśnić mniejszą liczbą grup -OH, co skutkowało mniejszą gęstością ładunku ujemnego po stronie chelatacji [50]. Flawonoidy mogą chelatować z jonami metali po trzech potencjalnych stronach koordynacyjnych: (i) między grupami 5-hydroksy i 4-karbonylowymi, (ii) między grupami 3-hydroksy i 4-karbonylowymi, oraz (ii) pomiędzy 3', A'-hydroksy grupami w Bring [39]. Kwercetyna-3-rutynozyd wykorzystuje strony wiążące (i) i (i)[9], a do grupy 3-hydroksy dołączony jest rutynozyd. Dane spektralne wykazały nawet, że jony metali są związane tylko z grupą 3',A'-hydroksylową [18]. Chelaty są bardziej efektywne z żelazem w postaci dwuwartościowej [50]. W mieszaninach binarnych kwercetyna-3-rutynozyd nie jest w stanie tworzyć kompleksów, gdy obecny jest kwas askorbinowy, w przeciwieństwie do mieszanin trójskładnikowych. Jeśli obecny jest kwas 5-kafeoilochinowy, znajdują się niewielkie ilości związanego żelaza. Wskazuje to, że 5-caffeoylquinic chroni cząsteczki kwercetyny-3-rutynozydu w obecności kwasu askorbinowego, więc kwercetyna-3-rutynozyd może tworzyć kompleksy z żelazem.

4. Materiały i metody

4.1.Chemikalia

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 procent), dodekahydrat siarczanu amonu żelazowego i heksahydrat siarczanu amonu żelazowego zakupiono od Carl Roth (Karlsruhe, Niemcy).

4.2.Próbki

Wodne roztwory i mieszaniny autentycznych wzorców kwasu askorbinowego, kwasu {{0}}kafeoilochinowego i kwercetyny-3-rutynozydu zostały przygotowane jako czyste roztwory i mieszaniny w różnych proporcjach. Wszystkie możliwe mieszaniny binarne sporządzono w stosunkach równomolowych, a stosunki nierównomolowe z podwojonym jednym związkiem. Mieszaniny trójskładnikowe przygotowano również w stosunkach równomolowych, jak również w stosunkach nierównomolowych z odpowiednio jednym lub dwoma związkami podwojonymi. Stężenia końcowe przeciwutleniaczy wynosiły 0,3 mM dla każdego roztworu testowego. Dodatkowo, wszystkie eksperymenty powtórzono po dodaniu 0.3 mM żelaza ({{10}}.15 mM żelaza żelazawego i 0,15 mM żelaza żelazawego) w sumie na mieszaninę. Wybrane ilości przeciwutleniaczy i żelaza nie są oparte na poziomach fizjologicznych lub pokarmowych, są oparte na masach molowych w celu zbadania wpływu interakcji molekularnych. W konsekwencji ustalono równomolowy stosunek między przeciwutleniaczami ogółem a żelazem. Wszystkie mieszanki gotowano przez 0, 10, 20 i 40 minut we wrzącej wodzie, a następnie schładzano na lodzie, aby zatrzymać proces ogrzewania. Dokonano tego dla trzech niezależnych powtórzeń.

4.3.Pomiary fotometryczne

Przeciwutleniacze(czyste lub mieszane) przy braku i obecności żelaza zmierzono ich całkowitą aktywność redukującą i aktywność przeciwutleniającą w trzech niezależnych powtórzeniach technicznych przy użyciu metody wysokoprzepustowej na płytkach 96-dołkowych (czytnik mikropłytek SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Zastosowano różne testy testowe ze względu na różne mechanizmy reakcji: transfer pojedynczego elektronu (SET) i transfer atomu wodoru (HAT). Podczas gdy test TEAC i TPC opiera się na SET [17,18], w przypadku testu DPPH literatura nie jest do końca jasna, czy jest on oparty na SET, HAT, czy nawet kombinacji tych dwóch mechanizmów [{{6} }]. Ostatnie badania przeprowadzone przez Foti[51] wykazały, że fenole mogą reagować z DPPH poprzez sekwencyjne przeniesienie elektronów z utratą protonu (SPLET), połączenie tych dwóch mechanizmów. Czynniki, takie jak polaryzacja średnia i potencjał jonizacyjny, wpływają na dominujący mechanizm.

4.3.1. Całkowita zawartość fenoli (TPC)

Całkowitą zawartość fenolu (TPC) oznaczono metodą Folina-Ciocalteu na płytce 96-studzienkowej, którą wcześniej opisali Bobo-Garcia i wsp. [52] z pewnymi modyfikacjami.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). Powszechna nazwa tego testu jest myląca, ponieważ odczynnik Folina-Ciocalteu reaguje również na związki niefenolowe, takie jak witaminy i minerały [22]. Lepiej opisuje „całkowitą aktywność redukującą” związków bioaktywnych.

4.3.2. Równoważna zdolność antyoksydacyjna Trolox (TEAC)

Aktywność przeciwutleniającą określono za pomocą testu TEAC na płytce 96-dołkowej z pewnymi modyfikacjami. Przygotowano roztwór podstawowy z 9,6 mg ABTS i 1,66 mg nadsiarczanu potasu wypełniony H2O do 25 ml i inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej przez 12-16 godz. Z tego roztworu podstawowego przygotowano roztwór roboczy TEAC, zawierający 5 ml roztworu podstawowego wypełnionego do 25 ml 100% MeOH.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*Wymiatanie rodników

Theprzeciwutleniaczactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Synergizm i antagonizm

W celu analizy synergicznych i antagonistycznych efektów działania przeciwutleniającego dokonano porównania wyników uzyskanych eksperymentalnie z wartościami teoretycznymi obliczonymi przez sumę efektów poszczególnych składników przy odpowiednim stężeniu [53]. Synergizm opisuje interakcję dwóch lub więcej substancji tak, że połączone działanie jest większe niż suma działania każdej z osobna. W przeciwieństwie do tego, antagonizm jest zjawiskiem, w którym oddziaływanie dwóch lub więcej substancji w połączeniu ma ogólny efekt, który jest mniejszy niż suma ich indywidualnych efektów.

4.5. Oznaczanie żelaza jonowego

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). Różnica między całkowitym żelazem a żelazem jonowym, sumą żelaza żelazawego i żelazowego, to żelazo związane.

4.6.HPLC-DAD

Do ilościowego oznaczania przeciwutleniaczy kwasu askorbinowego, kwasu 5-kafeoilochinowego i kwercetyny-3-rutynozydu oraz ich produktów degradacji w tych samych ekstraktach, które są stosowane do fotometrii

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） zostały przygotowane. Pochodne związki zostały wstępnie zidentyfikowane przez analizę czystych standardów w obecności i nieobecności obróbki termicznej żelaza przed i po obróbce. Dlatego nowy pik musi pochodzić ze standardu wstawiania. Ponadto wybrane mieszaniny mierzono metodą HPLC-MS, aby zweryfikować proponowaną strukturę.

4.7. Analiza statystyczna

Do testów biostatystycznych oraz prezentacji i rysowania wyników wykorzystano Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Redmond, USA) oraz R Statistics (wersja 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020). Statystykę wnioskowania do oceny i łączenia terapii przeprowadzono przy użyciu trójczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), testu post hoc Tukeya HSD i korelacji Pearsona. Użyte pakiety R to ggplot2 [55], mean [56] i multcomp [57].

5. Wnioski

Na podstawie opisanych powyżej ustaleń na AOA kwasu askorbinowego, kwasu 5-kafeoilochinowego i kwercetyny-3-rutynozydu miała wpływ ich struktura cząsteczkowa, stężenie, stosunek oraz interakcje z innymi przeciwutleniaczami i żelazem. Wydaje się, że interakcja odgrywa rolę zwłaszcza w AOA, gdy łączy się kwas askorbinowy i kwas 5-kafeoilochinowy. Tutaj wykryto efekty synergistyczne i antagonistyczne. Temperatura miała minimalny wpływ na AOA, a jednocześnie temperatura wpływała na stabilność wszystkich przeciwutleniaczy w niektórych mieszaninach, zwłaszcza w obecności żelaza. Jedynie stężenie kwasu askorbinowego zmniejszyło się przy braku żelaza z wydłużonym czasem gotowania, a stężenie kwasu 5-kafeoilochinowego spadło tylko w obecności żelaza, podczas gdy stężenie kwercetyny-3-rutynozydu spadło tylko w połączeniu z kwasem askorbinowym w obecność żelaza. W połączeniu z żelazem kwas 5-kafeoilochinowy był w stanie chronić inne cząsteczki przed zmniejszeniem ich stężenia w wyniku obróbki termicznej.

W roślinach połączenia kwasu askorbinowego, kwasu 5-kafeoilochinowego i kwercetyny-3-rutynozydu są nie tylko możliwe, ale i powszechne. Stąd wyniki te dają podstawową wiedzę na temat procesów zachodzących podczas gotowania warzyw. Matryce żywności są bardziej złożone i zawierają niezliczone związki bioaktywne, w tym enzymy, inne minerały lub kwasy, które zmieniają warunki reakcji lub same są reagentami. Te złożone interakcje wykraczają daleko poza zakres tego badania, a korzystne stężenia i interakcjeprzeciwutleniaczew gotowanych warzywach należy zająć się w przyszłości.

Bibliografia

1. Mellor, DD; Naumovski, N. Wpływ kakao na cukrzycę: potencjał trzustki i wątroby jako kluczowych narządów docelowych, coś więcej niż działanie przeciwutleniające? wewn. J. Nauka o żywności. Technol. 2016, 51, 829-841. [Odn.]

2. Crozier, A.; Jaganath, IB; Clifford, MN Fenole, polifenole i garbniki: przegląd. Metabolity wtórne w roślinie: występowanie, struktura i rola w diecie człowieka; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., wyd.; Wydawnictwo Blackwell: Hoboken, NJ, USA, 2006; s. 1-24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. Metale przejściowe jako katalizatory reakcji „samoutleniania”. Wolna Rada. Biol. Med. 1990, 8, 95-108. [Odn.]

4. Buchner, N.; Krumbein, A.; Rohn S.; Kroh, LW Wpływ obróbki termicznej na flawonole rutynę i kwercetynę. Szybka Komunia. Widmo masowe. 2006, 20, 3229–3235. [Odn.]

5. Layrisse, M.; García-Casal, MN; Solano, L.; Baron, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramírez, J.; Leets, I.; Tropper, E. Biodostępność żelaza u ludzi ze śniadań wzbogaconych chelatem bis-glicyny żelaza, fitynianami i polifenolami. J. Nutr. 2000, 130, 2195-2199. [Odsyłacz] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddy, M.; Cook, JD Hamowanie wchłaniania żelaza niehemowego u człowieka przez napoje zawierające polifenole. Fr. J. Nutr. 1999, 81, 289-295. [Odsyłacz] [PubMed]

7. Kostiuk, Wirginia; Potapowicz, AI Działanie przeciwrodnikowe i chelatujące w ochronie flawonoidów przed uszkodzeniem komórek wywołanym przez krzemionkę. Łuk. Biochem. Biofizyka. 1998, 355, 43–48. [Odsyłacz] [PubMed]

8. Kejík, Z.; Kaplanek, R.; Masaˇrik, M.; Babula, P.; A. Matkowski; Filipenský, P.; Veselá, K.; Gburek, J.; Sýkora, D.; Martásek, P.; i in. Kompleksy żelaza z flawonoidami – działanie przeciwutleniające i nie tylko. wewn. J. Mol. Nauka. 2021, 22, 646. [Odsyłacz]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. Analiza zależności struktura-aktywność polifenoli monomerycznych i polimerycznych (kwercetyna, rutyna i katechina) otrzymanych różnymi metodami polimeryzacji. Chem. Bionurkowie. 2019, 16, e1900426. [Odsyłacz] [PubMed]

10. Gullón, B.; Lu-Chau, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: Przegląd metod ekstrakcji, identyfikacji i oczyszczania, działań biologicznych i metod zwiększania biodostępności. Trendy Food Sci. Technol. 2017, 67, 220–235. [Odn.]