Glikozydy fenyloetanoidowe z Paraboea Martinii chronią komórki szczurzego guza chromochłonnego (PC12) przed uszkodzeniem komórek wywołanym nadtlenkiem wodoru
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Xue Gong†a , Yan Xu†b , Kai Renc , Xiaorong Baid
Wiadomo, że stres oksydacyjny odgrywa zasadniczą rolę w patogenezie kilku chorób. Wiąże się to z etiologią choroby Alzheimera (AD), choroby Parkinsona (PD), epilepsji i innych chorób [1–3]. Obecnie poczyniono stałe postępy w badaniach nad patogenezą AD, PD i innych chorób. Jednak ze względu na ograniczoną wiedzę na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw AD, PD i innych chorób nie zrealizowano skutecznych strategii zapobiegania lub leczenia tych chorób [4]. H2O2 jest ważnym składnikiem reaktywnych form tlenu (ROS). W związku z tym uszkodzenie komórek PC12 wywołane przez H2O2- jest najczęściej stosowanym modelem stresu oksydacyjnego i jest szeroko stosowany w eksperymentalnych badaniach efektów neuroprotekcyjnych [5]. Oksygenaza hemowa 1 (HO-1) i podjednostka katalityczna ligazy glutaminianowo-cysteinowej (GCLC) są ważnymi komórkowymi enzymami antyoksydacyjnymi, a oba geny są regulowane w dół od jądrowego czynnika erytroidalnego 2 (Nrf2), który staje się obiecującym środkiem terapeutycznym cel dla neuroprotekcji [6,7]. Glikozydy fenyloetanoidowe, pochodzące z jednostki C-6-C-3, zawierają wiele fenolowych grup hydroksylowych i mają znaczące działanie przeciwutleniające i przeciwstarzeniowe. W ciągu ostatnich kilku lat badania wykazały, że wiele roślin leczniczych zawiera glikozydy fenyloetanoidowe, które wykazują znaczną aktywność przeciwutleniającą. Na przykład glikozydy fenyloetanoidowe pochodzące zHerba cistanchewiadomo, że wywierają ochronny wpływ na deficyty poznawcze w AD. W badaniu tym zbadano powiązany mechanizm ochronny przy użyciu modelu AD z akceleracją senescencji podatnej myszy 8 (SAMP8). Wyniki wskazują, że zdolność glikozydów fenyloetanoidowych do łagodzenia deficytów poznawczych u myszy SAMP8 może być związana z promocją plastyczności synaptycznej z udziałem procesów antyoksydacyjnych [8]. W tym badaniu dwa glikozydy fenyloetanoidowe oddzielono i oczyszczono z sęków drewna Tectona grandis (teak); związki te wykazywały wyraźne działanie antyoksydacyjne, które określono metodą amperometryczną [9]. Ponadto, związki glikozydów kafeoilofenyloetanoidowych z Lindernia ruellioides wywierają zależne od dawki działanie przeciwutleniające i anionowe nadtlenkowe wymiatające wolne rodniki in vitro [10]. Mechanizmy działania glikozydów fenyloetanoidowych są związane z regulacją szlaku sygnałowego Nrf2/ARE, który wpływa na syntezę SOD, CAT, GSH-PX i innych enzymów antyoksydacyjnych [11]. Rodzina Gesneriaceae, która obejmuje 150 rodzajów i około 3700 gatunków, występuje głównie w tropikalnych i umiarkowanych regionach Azji wschodniej i południowej, Oceanii, Ameryki Południowej, Afryki, Europy Południowej i Meksyku [12].
Gesneriaceae w Chinach. Doniesiono, że około 100 gatunków ma skuteczność medyczną, a większość z nich występuje głównie w prowincjach Guangxi i Guizhou [13]. W ostatnich latach badania nad roślinami Gesneriaceae stopniowo rosły w różnych częściach świata i znaleziono nowe składniki o aktywności fizjologicznej [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt należy do Paraboli (Gesneriaceae) i jest rośliną zielną. W oparciu o „Rekordy zasobów chińskiej tradycyjnej medycyny” zapisano, że cała roślina jest używana jako lekarstwo. Ponadto może wywierać wiele działań farmakologicznych na stany takie jak krwawe wymioty, obrzęki, czerwonka, urazy i złamania [15]. Bai udowodnił, że glikozydy fenyloetanoidowe są jednym z głównych składników chemicznych roślin Gesneriaceae [16]. Niektórzy badacze odkryli również, że glikozydy fenyloetanoidowe mają znaczną aktywność przeciwutleniającą [17]. Li wykazał, że glikozydy fenyloetanoidoweCistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 procent) ośmiu glikozydów fenylopropanoidowych zmierzono metodą normalizacji powierzchni pików HPLC. Jako przykład, wykresy chromatograficzne parabozydu B i parabozydu II pokazano na Figurze 1, a ich względna zawartość wynosiła odpowiednio 98,23 procent i 99,20 procent. Słabo zróżnicowaną linię komórkową guza chromochłonnego nadnerczy szczura (PC12) zakupiono z banku komórek w Chińskiej Akademii Nauk (Szanghaj, Chiny). Pożywkę Eagle'a zmodyfikowaną przez Dulbecco (DMEM) i surowicę końską zakupiono w Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Surowicę płodową bydlęcą (FBS) zakupiono z Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, USA). H2O2 otrzymano z Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Chiny). Trizol zakupiono w Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Zestaw odczynników PrimeScriptTM RT (Perfect Real Time) otrzymano z TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, Chiny). Startery dla HO-1, GCLC i GAPDH zostały zsyntetyzowane przez Sangon Biotech (Szanghaj, Chiny). Zestaw CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) otrzymano z firmy Promega Corp. (Madison, USA). Inhibitory protoporfiryny cynkowej HO-1 (ZnPP) zakupiono z Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Zastosowano również inkubator CO2 Thermo311 (Thermo, USA), blok termiczny StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo) oraz analizator xCELLigence RTCA DPlus i E-Plate 16 (ACEA Biosciences, USA). .
Cistanche deserticola
Hodowla komórkowa i leczenie
Komórki PC12 hodowano w DMEM zawierającym 5% FBS i 5% surowicy końskiej w 37°C w nawilżonej atmosferze 5% CO2. Komórki PC12 podzielono na trzy grupy w następujący sposób: grupę kontrolną, grupę modelową i grupę leczoną. Osiem glikozydów fenylopropanoidowych rozpuszczono w DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">
Oznaczanie H2O2
Określiliśmy odpowiednie stężenie H2 O2 za pomocą analizy komórkowej w czasie rzeczywistym (RTCA). Komórki PC12 wysiano na mikropłytce CIM -16 w objętości 100 µl, a następnie inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Komórki PC12 podzielono na grupy kontrolne i modelowe. Następnie do grup modelowych dodano 10 µl H2O2 (50, 100, 200 i 400 µM), a grupy kontrolne potraktowano 10 µl kompletnego DMEM, umieszczonego w trzech złożonych dołkach. E-Plate 16 umieszczono w xCELLigence RTCA, monitorowano co 15 minut, a wyniki rejestrowano przez 32 godziny. Wpływ H2O2 na komórki PC12 analizowano przy użyciu oprogramowania do analizy danych xCELLigence RTCA. Wartość wskaźnika komórkowego (CI) została wykorzystana do określenia optymalnego stężenia H2O2 i czasu działania.
Ekstrakcja i izolacja związku
Frakcje rozdzielono na podstawie ich polarności za pomocą wcześniej opisanych metod. Suszone na powietrzu, sproszkowane P. martini (4 kg) były kolejno trzykrotnie ekstrahowane 75% wodnym roztworem etanolu [20]. Otrzymane ekstrakty następnie zatężono przy użyciu wyparki obrotowej w celu usunięcia etanolu i otrzymano surowe ekstrakty. Próbki rozpuszczono w wodzie dejonizowanej, a następnie wyekstrahowano kolejno eterem naftowym, octanem etylu, n-butanolem i wodą. Ekstrakt n-butanolowy (400 g) frakcjonowano przy użyciu kolumny z żywicą makroporowatą AB-8 i roztworu etanol-H2O2 (0, 1{{47} }, 30, 50, 70 i 95 procent). Ostatecznie otrzymano sześć frakcji (frakcje 1–6). Frakcje 3 i 4 poddano separacji przy użyciu kolumny MCI ze stopniowym gradientem MeOH-H2O2 (10-100 procent). Następnie produkty izolowano stosując Sephadex LH-20 z 50% MeOH jako eluentem. Związki 1 (41,0 mg) i 6 (15,6 mg) wyizolowano z frakcji 3. Związki 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) i 8 (26,0 mg) otrzymano z frakcji 4 stosując Sephadex Chromatografia LH-20 z 50% MeOH jako eluentem. Końcowe izolacje przeprowadzono metodą półpreparatywnej HPLC z odwróconą fazą (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) z 50% wykrywaniem MeOH i UV przy 280 nm, aby uzyskać związki 4 (39,0 mg) i 5 (9,0 mg) [20].
Test żywotności komórek
Komórki PC12 wysiano w 96-dołkowych płytkach w gęstości 2 × 1{{10}}4 komórek/dołek w końcowej objętości 100 µl . Komórki PC12 inkubowano w 37°C z 5% CO2 przez 12 godzin. Następnie komórki potraktowano różnymi stężeniami surowych ekstraktów (00,025, 0,05, 0,1, 0,2 i 0,4 mg/ml) oraz związków 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 w pięciu stężeniach (3,125, 6,25, 12,5, 25 i 50 μM). Po wstępnym traktowaniu przez 24 godziny żywotność komórek określono za pomocą testów MTS. Komórki PC12 wstępnie inkubowano z lub bez inhibitora HO-1 bez ZnPP (15 μM) przez 30 min, następnie inkubowano z lub bez kaleolariozydu B, parabozydu B i parabozydu II (3,125 μM) przez 12 godzin, a na koniec inkubowano z 400 μM H2O2 przez kolejne 6 godzin. Po leczeniu liczbę komórek, które przeżyły, określano testem MTS [6].
Ochronne działanie surowych ekstraktów i związków monomerycznych na ogniwa PC12 poddane działaniu H2O2-
Komórki hodowano w płytce {{0}}dołkowej w końcowej objętości 100 µL. Do traktowanej grupy dodano seryjne rozcieńczenia surowych ekstraktów (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 i 0,4 mg/ml). Po wstępnym traktowaniu przez 12 godzin, 400 μM roztworu H2O2 (optymalne stężenie) dodano do grupy traktowanej i grupy H2O2 każdego dołka na 6 godzin. Następnie do każdego dołka dodano roztwór MTS i płytki inkubowano przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Płytki oscylowano z niską prędkością przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aż wszystkie kryształy całkowicie się rozpuściły. Ochronę komórek określono na podstawie wyników testu MTS zgodnie z 2204 X. GONG i in. producenta. Pobrane z https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 przez gościa 27 sierpnia 2021instrukcje. Gęstość optyczną określono przy absorbancji o długości fali 490 nm. Śledziliśmy dalej aktywność związków 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 wyizolowanych z frakcji 3 i 4. Kolejne rozcieńczenia związków 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 (3,125, 6,25, 12,5, 25 i 50 μM) dodano do grupy traktowanej w celu określenia ich odpowiedniego działania ochronnego na komórki PC12 indukowane H2O2-.
glikozydy fenyloetanoidowe z Cistanche deserticola: chronią neurony i przeciwdziałają starzeniu się
Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
Komórki PC12 zebrano w 12 h po traktowaniu 3,125 µM kaleolariozydem B, parabozydem B i parabozydem II. Całkowity RNA wyekstrahowano przy użyciu odczynnika TRIzol i porcje całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu Primescript RT Master Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Zgodnie z wcześniejszym doniesieniem, w doświadczeniach zastosowano następujące startery [21]. HO-1: Przód 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, Rewers 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: Naprzód 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, Odwrócony 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: Do przodu 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, do tyłu 5′-GAAGCGCCAGTAGACTCCACG-3′. Porcje otrzymanych cDNA amplifikowano następnie metodą PCR. Warunki reakcji były następujące: początkowa denaturacja w 95 stopniach (30 s), a następnie 40 cykli w 95 stopniach (5 s), 60 stopniach (34 s) i 72 stopniach (35 s). Wszystkie startery zostały przetestowane i wykryto sygnał fluorescencyjny FL; następnie obliczono wartość △Ct i porównano wartości względne z wartościami z grupy kontrolnej przy użyciu następującego równania: △Ct=Ct (próbka) − Ct (kontrola endogenna), △△Ct {{36} } △Ct (próbka) −△Ct (nieleczona) i krotność zmiany=2−△△Ct. Jako kontrolę wewnętrzną zastosowano dehydrogenazę -3-fosforanową aldehydu glicerynowego (GAPDH).
Ekstrakcja białka
Komórki PC12 wysiano na szalkach 100-mm przy 1 x 107 komórek/szalkę. Po przyłączeniu komórki traktowano odpowiednio kaleolariozydem B, parabozydem B i parabozydem II (3,125 µM) przez 12 godzin. Następnie glikozydy usunięto i komórki inkubowano z H2O2 przez kolejne 6 godzin. Po inkubacji komórki przemyto dwukrotnie zimnym PBS i zeskrobano z płytek 1 ml PBS. Homogenaty komórkowe wirowano przy 1500 obr./min przez 10 min. Po traktowaniu białka komórkowe ekstrahowano przy użyciu buforu do lizy komórek Beyotime RIPA z 1 mM PMSF zgodnie z instrukcjami producenta. Ponadto izolowano białka cytoplazmatyczne i jądrowe, jak opisano w protokole zestawu do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznej Beyotime. Stężenia białka w próbkach oznaczano za pomocą zestawu do oznaczania białek Beyotime BCA, a wszystkie próbki przechowywano w temperaturze -80 stopni do analizy Western blot [6].
Analiza Western blot
Elektroforezę SDS-PAGE przeprowadzono po ekstrakcji, a następnie denaturacji całkowitego białka z różnych grup. Po elektroforezie białko przeniesiono na membrany PVDF, które następnie zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku na 4 godziny. Po przemyciu przeciwciało pierwotne (królicze przeciwciało poliklonalne GAPDH (rozcieńczenie 1:10,000), królicze przeciwciało poliklonalne HO-1 (rozcieńczenie 1:1000) lub królicze przeciwciało poliklonalne GCLC (rozcieńczenie 1:1000) dodano do membran, które inkubowano przez noc w temperaturze 4 st. Następnego dnia membrany PVDF przemyto trzykrotnie TTBS.Następnie przeciwciało drugorzędowe (sprzężone, czyste powinowactwo, czysta kozia anty-królicza IgG (rozcieńczenie 1:1000) znakowane Do membran dodawano peroksydazę chrzanową, które następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 h. Błony PVDF przemywano i poddawano odczynnikowi do detekcji chemiluminescencji ECL w celu sygnalizacji ekspozycji na kliszy rentgenowskiej, którą następnie utrwalano i skanowano [22].
Analiza statystyczna
Dane analizowano przy użyciu SPSS 19.0, a wyniki przedstawiono jako średnie z odchyleniem standardowym (SD) z trzech niezależnych eksperymentów. Uznano, że wartości p < 0,05="" wskazują="" statystycznie="" istotne="">
Wyniki Ustanowienie modelu H2O2
Jak pokazano na rysunku 2, H2O2 w stężeniu 50, 100 i 200 μM nie powodował odpowiedniego poziomu śmierci komórek. Jednak 400 μM H2O2 działało na komórki PC12 w ciągu 2–6 godzin, a uszkodzenia oksydacyjne komórek były zwykle stabilne. Dlatego uznaliśmy, że indukcja za pomocą H2O2 w stężeniu 400 μM przez 6 godzin była odpowiednia do naśladowania uszkodzenia komórek PC12 wywołanego stresem oksydacyjnym.
Ochronne działanie surowych ekstraktów na komórki PC12 traktowane H2O2
W porównaniu z grupą modelową H2O2 (Rysunek 3), ekstrakt n-butanolowy w stężeniach 0.05, 0.1, {{10} }.2 i 0.4 mg/ml znacznie poprawiły uszkodzenie oksydacyjne komórek PC12 indukowane przez H2O2 (p < 0.05)="" w="" sposób="" zależny="" od="" stężenia.="" dane="" te="" sugerowały,="" że="" frakcja="" n-butanolu="" wykazywała="" silniejsze="" działanie="" ochronne.="" jednak="" ekstrakty="" eteru="" naftowego="" i="" octanu="" etylu="" wykazywały="" działanie="" ochronne="" tylko="" w="" wysokich="" stężeniach="" (eter="" naftowy:="" 0,1="" i="" 0,2="" mg/ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5;octan="" etylu:="" 0,2="" i="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" ponadto="" różne="" stężenia="" ekstraktów="" fazy="" wodnej="" nie="" wykazywały="" działania="" ochronnego="" (p=""> 0,05). Ponadto dodaliśmy dane z badania walidacyjnego z wykorzystaniem linii komórkowych ludzkiego nerwiaka niedojrzałego SH-SY5Y (SH-SY5Y) w pliku uzupełniającym. Traktowanie 250 µM H2O2 skutkowało zmniejszoną żywotnością komórek; jednakże traktowanie kaleolariozydem B, parabozydem B i parabozydem II (3,125, 6,25, 12,5, 25 i 50 μM) znacząco osłabiało śmierć komórek SH-SY5Y. Wyniki eksperymentu wykazały, że kaleolariozyd B, parabozyd B i parabozyd II chroniły komórki SHSY5Y przed uszkodzeniem komórek wywołanym przez H2O2-.
Struktury związków izolowanych z frakcji n-butanolu
Aby potwierdzić, że ekstrakt n-butanolowy zawierał składniki aktywne, dodatkowo frakcjonowaliśmy osiem związków z ekstrakcji. Struktury związków 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 zidentyfikowano na podstawie różnych danych spektralnych (1H-NMR, 13C-NMR i ESI-MS) na podstawie porównań z opublikowanymi danymi dla parabozydu A , parabozyd B, parabozyd I, parabozyd II, parabozyd III, nuomozyd A, kaleolariozyd B i izonuomozyd A, odpowiednio [20]. Na przykład dane dla parabozydu B były następujące: brązowa guma; ½ 20 D -55,7 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (loge): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr max cm-1 : 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm-1 [20]; dla spektroskopii 1H i 13C NMR szczegółowe dane przedstawione w odnośniku 20; HR-ESI-MS (ujemny) m/z 741,2231 [MH]- (obl. dla C33H41O19, 741.2242) [20]. Dane dla parabozydu II były następujące: białe bezpostaciowe proszki; 1/2 20 D -80,5 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (loge): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr max cm-1 : 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm-1 [20]; dla spektroskopii 1H i 13C NMR szczegółowe dane przedstawione w odnośniku 20; ESI-MS (ujemny) m/z 637
Ochronne działanie izolowanych związków przeciwko toksyczności wywoływanej przez H2 O2-w komórkach PC12
Testy MTS zastosowano do zbadania wpływu wyizolowanych związków na żywotność komórek PC12 wystawionych na toksyczność indukowaną H2O2-. Jak pokazano na Rycinie 5, w porównaniu do tej w grupie kontrolnej, komórki PC12 wstępnie potraktowano pięcioma różnymi stężeniami kaleolariozydu B, parabozydu B, parabozydu II lub parabozydu A (3,125, 6,25, 12,5, 25 i 50 μM) przez 24 h nie wykazały istotnych różnic w żywotności komórek (p > 0,05). Zatem wstępne traktowanie komórek PC12 kaleolariozydem B, parabozydem B i parabozydem II nie powodowało cytotoksyczności. Jak pokazano na Figurze 6, 400 µM H2O2 znacząco zmniejszyło żywotność komórek w porównaniu z grupą kontrolną. Ponadto, żywotność komórek PC12 traktowanych H2O2- znacznie wzrosła po wstępnym potraktowaniu komórek PC12 różnymi stężeniami kaleolariozydu B, parabozydu B i parabozydu II; ponadto żywotność komórek była najwyższa po traktowaniu 50 µM kaleolariozydem B, 50 µM parabozydem B i 12,5 µM parabozydem II. Pozostałe pięć związków nie wykazało żadnego znaczącego działania ochronnego na komórki PC12 traktowane H2O2-. Aby zilustrować to odkrycie, omówimy jeden z nich jako przykład, podczas gdy pozostałe nie są opisane w rękopisie.
Poziomy transkrypcji HO-1 i GCLC
Następnie przetestowaliśmy poziomy transkrypcji HO{{0}} i GCLC w komórkach PC12 traktowanych kaleolariozydem B, parabozydem B i parabozydem II. Całkowite mRNA zbierano z traktowanych i nietraktowanych komórek PC12 przez 12 godzin, a następnie poddawano analizie ekspresji metodą qRT-PCR. Jak pokazano na Figurze 7(a,c,e), poziomy transkrypcyjne HO-1 znacznie wzrosły po wstępnym potraktowaniu komórek PC12 wskazanymi stężeniami kaleolariozydu B, parabozydu B i parabozydu II przez 12 godzin (p < 0.05).="" jak="" pokazano="" na="" figurze="" 7(b),="" poziomy="" transkrypcji="" gclc="" również="" znacznie="" wzrosły="" w="" komórkach="" pc12="" wstępnie="" traktowanych="" wskazanymi="" stężeniami="" kaleolariozydu="" b="" przez="" 12="" godzin.="" jednak="" poziomy="" gclc="" w="" komórkach="" pc12="" wstępnie="" traktowanych="" parabozydem="" b="" przez="" 12="" godzin="" znacznie="" spadły="" w="" porównaniu="" z="" tymi="" w="" grupie="" modelowej="" (p="">< 0,05;="" figura="" 7(d)).="" ponadto,="" przy="" traktowaniu="" parabozydem="" ii,="" poziomy="" gclc="" w="" komórkach="" pc12="" nie="" różniły="" się="" znacząco="" w="" porównaniu="" z="" tymi="" w="" grupie="" modelowej="" (p=""> 0,05; Figura 7 (f)).
Wyrażenie HO-1 i GCLC
HO{{0}} i GCLC są ważnymi komórkowymi enzymami antyoksydacyjnymi i oba są regulowanymi genami Nrf2-downstream. Ekspresję białka HO-1 i GCLC obserwowano również po leczeniu [6]. Figura 8 przedstawia poziomy białka HO-1 i GCLC w komórkach PC12 po traktowaniu 400 μM H2O2; wyniki wskazują, że intensywność fluorescencji FL HO-1 w grupach kaleolariozydu B i parabozydu B była większa niż w grupach leczonych H2O2- (Figura 8(a,c)). Jednak ekspresja GCLC nie została znacząco zmieniona przez związki, z wyjątkiem kaleolariozydu B (Figura 8(b)). Następnie zastosowano chemiczne inhibitory HO-1 w celu dalszej oceny roli enzymów antyoksydacyjnych w regulowaniu efektów ochronnych wywieranych przez kaleolariozyd B, parabozyd B lub parabozyd II przeciwko cytotoksyczności indukowanej przez H2O2-. Kaleolariozyd B, parabozyd B i parabozyd II (3,125 µM) zapobiegały cytotoksyczności indukowanej przez H2O2-, ale takie ochronne działanie zostało odwrócone przez inhibitor HO-1 ZnPP (p < 0,01)="" przy="" 15="" µm="" (figura="" 8="">
Zaleta Cistanche: Zwiększenie męskiej reprodukcji
Dyskusja
Starzenie się społeczeństwa jest poważnym problemem globalnym. Wiele chorób jest związanych ze starością, takich jak AD i PD, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. AD i PD stały się trzecimi najbardziej śmiertelnymi chorobami na świecie, po chorobach układu krążenia i nowotworach. Dlatego neurodegeneracja stała się pilnym tematem badań na całym świecie. Jednak patogeneza AD i PD, chorób neurodegeneracyjnych ośrodkowego układu nerwowego, pozostaje do tej pory niejasna. Ponadto istnieje tylko kilka leków, które mogą skutecznie leczyć AD lub PD ze względu na ich złożone mechanizmy patogenetyczne [23]. Wcześniejsze badania wykazały, że ROS, takie jak anion ponadtlenkowy (O2−) i H2O2, są głównymi czynnikami przyczyniającymi się do chorób neurodegeneracyjnych. Zmiany patologiczne w przebiegu ChP obejmują zwyrodnienie neuronów i śmierć istoty czarnej oraz dopaminy w prążkowiu [24, 25]. W związku z tym ważne jest opracowanie skutecznych leków przeciwutleniających w leczeniu PD, a odkrycie takich leków stało się ważnym kierunkiem badań [26]. Obecnie szlak sygnałowy Nrf2/ARE wydaje się być najważniejszym endogennym szlakiem stresu antyoksydacyjnego [27]. Ares znajduje się w regionach rankingowych 5′-fill genów, takich jak HO-1 i GCLC [28,29]. HO-1 i GCLC to geny spokrewnione z Nrf2-, które są regulowane w dół od tego białka [6]. ARE mogą następnie wpływać na poziom przeciwutleniaczy i aktywować dalszą ekspresję HO-1 i innych genów ochronnych, które mogą wzmocnić aktywność ochronną komórek [30,31]. Ponadto odkrycia sugerują, że ochronne działanie resweratrolu przeciwko toksyczności indukowanej przez A {{2{{5{0}}} w komórkach PC12 występuje poprzez regulację w górę ekspresji HO-1 poprzez aktywację wewnątrzkomórkowego Nrf2 szlak sygnałowy [32]. Komórki PC12 są akceptowanym modelem komórek nerwowych i są szeroko stosowane w badaniach nad działaniem neuroprotekcyjnym [33]. H2O2 może z łatwością przenikać przez błonę komórkową i łączyć się z żelazem, tworząc wysoce aktywne wolne rodniki, które wywołują stres oksydacyjny i uszkodzenia komórek [34]. H2O2 jest ważnym ROS, a wolne rodniki są łatwo generowane i stosunkowo stabilne, dlatego są zwykle wykorzystywane do tworzenia modelu stresu oksydacyjnego z wykorzystaniem komórek PC12 [5]. W tym badaniu wstępne traktowanie komórek PC12 nietoksycznymi stężeniami ekstraktu roślinnego chroniło komórki przed cytotoksycznością indukowaną przez H2O2- poprzez zmniejszenie wytwarzania ROS. Glikozydy fenyloetanoidowe zawierają wiele fenolowych grup hydroksylowych, które mają działanie przeciwutleniające i przeciwstarzeniowe. W tym badaniu stwierdziliśmy, że ekstrakcja n-butanolem zapewnia lepszą ochronę niż inne frakcje polarności (Rysunek 3). W ten sposób przeprowadziliśmy dalsze badania przesiewowe aktywności ochronnej ośmiu związków wyizolowanych z frakcji n-butanolu. Wyniki pokazały po raz pierwszy, że Rysunek 8. Analiza poziomów białka HO-1 i GCLC na komórkach PC12. (a) Analizę Western blot ekspresji HO-1 i GCLC i GAPDH zastosowano jako kontrolę obciążenia. (b) Analiza ekspresji białek GCLC metodą Western blot. (c) Analiza Western blot Ekspresja białka HO-1. (d) Inhibitor HO-1 ZnPP zmniejszył działanie neuroochronne. Dane przedstawiono jako średnie ± SD, n=3. ***p < 0.001="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" kontrolną;="" #p="">< 0,05="" wobec="" grupy="" h2o2="" (bez="" traktowania="" znpp),="" ##p="">< 0,01="" wobec="" grupy="" h2o2="" (bez="" traktowania="" znpp),="" ###p="">< 0,001="" wobec="" grupy="" h2o2="" (bez="" traktowania="" znpp);="" oraz="" p="">< 0,01="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" h2o2="" (traktowaną="" znpp)="" oraz="" &p="">< 0,001,="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" h2o2="" (traktowaną="" znpp).="" (grupa="" kontrolna;="" grupa="" modelowa:="" h2o2;="" grupa="" znpp="" ujemna:="" kaleolariozyd="" b="" plus="" h2o2,="" parabozyd="" b="" plus="" h2o2,="" parabozyd="" ii="" plus="" h2o2;="" grupa="" znpp="" dodatnia:="" znpp="" plus="" kaleolariozyd="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" parabozyd="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" parabozyd="" ii="" plus="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" i="" in.="" pobrane="" z="" https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145="" przez="" gościa="" w="" dniu="" 27="" sierpnia="" 2021="" r.="" kaleolariozyd="" b,="" parabozyd="" b="" i="" parabozyd="" ii="" mają="" znaczące="" działanie="" ochronne="" przed="" utlenianiem="" indukowanym="" przez="" h2o2-="" uszkodzenie="" w="" ogniwach="" pc12.="" wyniki="" wskazują="" również,="" że="" traktowanie="" h2o2="" indukowało="" znaczne="" uszkodzenie="" komórek="" pc12="" i="" zmniejszało="" żywotność="" komórek,="" podczas="" gdy="" traktowanie="" kaleolariozydem="" b,="" parabozydem="" b="" i="" parabozydem="" ii="" znacząco="" łagodziło="" te="" efekty="" (figura="" 6).="" poprzednie="" badanie="" wykazało,="" że="" szlak="" nrf2/are="" jest="" jednym="" z="" najważniejszych="" endogennych="" szlaków="" antyoksydacyjnych="" i="" może="" zwiększać="" ekspresję="" markerów="" niższego="" rzędu,="" takich="" jak="" ho-1,="" w="" celu="" ochrony="" komórek="" [7].="" wyniki="" analiz="" qrt-pcr="" i="" western="" blotting="" wykazały,="" że="" kaleolariozyd="" b,="" parabozyd="" b="" i="" parabozyd="" ii="" istotnie="" podwyższyły="" poziom="" ho-1.="" jednak="" poziomy="" transkrypcji="" gclc="" znacznie="" wzrosły="" w="" komórkach="" pc12="" wstępnie="" traktowanych="" kaleolariozydem="" b,="" ale="" zmniejszyły="" się="" w="" komórkach="" wstępnie="" traktowanych="" parabozydem="" b="" w="" porównaniu="" z="" tymi="" w="" grupie="" modelowej.="" ponadto="" parabozyd="" ii="" nie="" zmienił="" ekspresji="" tego="" markera="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" modelową="" (ryc.="" 7="" i="" 8="" (a-c)).="" dodatkowo,="" ochronne="" działanie="" kaleolariozydu="" b,="" parabozydu="" b="" i="" parabozydu="" ii="" przeciwko="" indukowanemu="" przez="" h2o2-uszkodzeniu="" komórek="" pc12="" zostało="" odwrócone="" przez="" inhibitor="" ho-1="" znpp="" (figura="" 8(d)).="" podsumowując,="" glikozydy="" fenyloetanoidowe="" kaleolariozyd="" b,="" parabozyd="" b="" i="" parabozyd="" ii="" skutecznie="" chroniły="" komórki="" pc12="" przed="" uszkodzeniem="" oksydacyjnym="" wywołanym="" przez="" h2o2-.="" w="" związku="" z="" tym="" związki="" te,="" wyizolowane="" z="" p.="" martini,="" mogą="" reprezentować="" potencjalnych="" kandydatów="" na="" leki="" do="" leczenia="" chorób="">
Korzyści z Cistanche:leczenie chorób neurodegeneracyjnych
Bibliografia
[1] Butterfield DA. Perspektywy stresu oksydacyjnego w chorobie Alzheimera i przewidywania przyszłych akcentów badawczych. J Alzheimer Dis. 2018;64:1–11.
[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. Stres oksydacyjny i peptyd beta-amyloidu w chorobie Alzheimera. Redoks Biol. 2018;14:450–464.
[3] Guo JD, Zhao X, Li Y, et al. Uszkodzenie neuronów dopaminergicznych przez stres oksydacyjny w chorobie Parkinsona (przegląd). Int J Mol Med. 2018;41:1817-1825.
[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH, et al. Związek polimorfizmów rs823128, rs1572931 i rs823156 ze zmniejszonym ryzykiem choroby Parkinsona. Neuroraport. 2017;27:936-941.
[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX, et al. Przeciwutleniające działanie 7,8-dihydroksyflflawonu chroni komórki PC12 przed cytotoksycznością wywołaną 6-hydroksydopaminą. Neurochem Int. 2014;64:18–23.
[6] Li MQ, Xu T, Zhou F, et al. Neuroprotekcyjne działanie czterech glikozydów fenyloetanoidowych na apoptozę indukowaną przez H2O2-na komórkach PC12 poprzez szlak Nrf2/ARE. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.
[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, et al. Szlak Nrf2-ARE: nowy cel przeciwko stresowi oksydacyjnemu i zapaleniu układu nerwowego w chorobach neurodegeneracyjnych. Terapia Pharmacol. 2016;157:84–104.
[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP i in. Działanie glikozydów fenyloetanoidowych, pochodzących zHerba cistanche, na deficyty poznawcze i aktywność antyoksydacyjną u samców myszy SAMP8. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180–1186.
[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Cvetkov YE, et al. Glikozydy fenyloetanoidowe z sęków drewna tekowego i ich działanie przeciwutleniające. J Biol Active Prod Nat. 2016;6:272–281.
[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ, et al. Aktywność przeciwutleniająca związków glikozydowych caffeoilo-fenyloetanoidów z Lindernia ruellioides in vitro. Cent South Pharm. 2017;15:1687-1690.
[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, et al. Rola szlaku Nrf2-ARE w uszkodzeniu spowodowanym stresem oksydacyjnym i jego związek z innymi szlakami sygnałowymi. Anim Hodowla Pasza Sci. 2016;37:42–48.
[12] Zheng XK, Li J, Feng WS, et al. Postępy w badaniach nad Gesneriaceae. Chin J Nowy lek. 2003;12:261–263.
[13] Wen F, Li ZD. Postęp w badaniach nad rośliną Gesneriaceae. Zasoby dzikich roślin podbródka. 2006; 25:1–6.
[14] Yan WY, Chen L, Wang JM i in. Postęp badań triterpenoidów roślin Gesneriaceae. Nat Prod Res Dev. 2012;24:698–701.
[15] Chińska firma ziołowa. Rekordy zasobów chińskiej tradycyjnej medycyny. Chiny: prasa naukowa; 1994.
[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG i in. Dystrybucja glikozydów fenyloetanoidowych w roślinach leczniczych Gesneriaceae. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267–4270.
[17] He ZD, Lau KM, Xu HX, et al. Aktywność przeciwutleniająca glikozydów fenyloetanoidowych z Brandisia hancei. J Etnofarmakol. 2000;71:483–486.
[18] Li L, Shi DF, Gui YG, et al. Badanie aktywności antyoksydacyjnejglikozydy fenyloetanoidowe z Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835-15836.
[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y i in. Ochronne działanieglikozydy cistanchew sprawie uszkodzenia ogniw PC12 PARABOLA MARTINI OCHRONA KOMÓREK PC12 Z H2O2-INDUKOWANE USZKODZENIA 2211
