W jaki sposób alpelizib będący inhibitorem kinazy fosfoinozytydowej 3- jest stosowany w zespole Lowe/chorobie zębów?

Alpelisib, inhibitor kinazy fosfoinozytydowej 3-, przywraca organizację aktyny i poprawia dysfunkcję kanalika proksymalnego in vitro oraz w mysim modelu zespołu Lowe i choroby Denta

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Marine Berquez^1,5, Jonathan R. Gadsby^2,5, Beatrice Paola Festa^1,5, Richard Butler³ , Stephen P. Jackson², Valeria Berno⁴, Alessandro Luciani1 , Olivier Devuyst^1,6i Jennifer L. Gallop^2,6

SŁOWA KLUCZOWE: cytoszkielet; endocytoza; lipidy; kanalik proksymalny; nerkowy zespół Fanconiego

Mutacje utraty funkcji w genie OCRL, który koduje fosfatydyloinozytol [PI] 4,5-bisfosforan [PI(4,5)P2] 5-fosfataza OCRL, powodują wadliwą endocytozę i dysfunkcję kanalików proksymalnych wZespół Lowe i choroba Denta2. Wada jest spowodowana zwiększonym poziomem PI(4,5)P2 i nieprawidłową polimeryzacją aktyny, blokując ruch endosomalny. PI 3-fosforan [PI(3)P] został ostatnio zidentyfikowany jako koaktywator z PI(4,5)P2 w szlaku aktyny. Tutaj przetestowaliśmy hipotezę, że:fosfoinozytyd 3-kinazaInhibitory (PI3K) mogą ratować defekt endocytów wywołany utratą OCRL, poprzez przywracanie równowagi sygnałów fosfoinozytydu w maszynerii aktynowej. Szerokozakresowy PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)inhibitor kopanlizybu i klasy IA p110a PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-) inhibitor alpelisibzmniejszona nieprawidłowa polimeryzacja aktyny w ludzkich komórkach nerkowych z niedoborem OCRL in vitro. Poziomy PI 3,4,5-trisfosforanu, PI(4,5)P2 i PI(3)P zostały obniżone po leczeniu alpelisibem, a knockdown siRNA podjednostki katalitycznej PI3K p110a skopiował fenotyp aktyny. W humanizowanym mysim modelu OcrlY/-, alpelisib redukował barwienie endosomalnej aktyny, przywracając architekturę włókien stresowych i poziomy megaliny w błonie plazmatycznej komórek kanalika proksymalnego, co znajduje odzwierciedlenie w lepszym endocytarnym wychwytywaniu białek o niskiej masie cząsteczkowej in vivo. Zatem nasze odkrycia potwierdzają związek między lipidami fosfoinozytydowymi, polimeryzacją aktyny i transportem endocytarnym w kanaliku proksymalnym i stanowią dowód na słuszność koncepcji ponownego zastosowania alpelisibu wZespół Lowe/choroba Dent2.

Oświadczenie tłumaczące

Zespół Lowe i choroba Denta2, spowodowane mutacjami w fosfoinozytydo-lipidowej 5-fosfatazie OCRL, objawiające się dysfunkcją kanalika proksymalnego i białkomoczem o małej masie cząsteczkowej, przy czym dostępne jest jedynie leczenie wspomagające. Nasze ustalenia pokazują, żefosfoinozytyd 3-kinaza inhibitor alpelisib, który jest obecnie zatwierdzony do leczenia raka, łagodzi nieprawidłową równowagę fosfoinozytydów i fenotyp aktyny związany z utratą OCRL, powodując znaczną poprawę maszynerii endocytarnej i zdolności absorpcyjnych w układach komórkowych oraz humanizowany mysi model zespołu Lowe/choroby Dent 2. Biorąc pod uwagę jego pozorny profil bezpieczeństwa, alpelisib jest obiecującym kandydatem do ponownego zastosowania leku w:Zespół Lowe i choroba Denta.

Komórki nabłonkowe wyściełające kanaliki proksymalne (PT) nerki posiadają wydajną ścieżkę endolizosomalną za pośrednictwem receptora, która odzyskuje i przetwarza niezbędne substancje, które są filtrowane przez kłębuszki nerkowe. Wrodzone zaburzenia dotyczące endolizosomów powodują dysfunkcję PT (nerkowy zespół Fanconiego) z utratą substancji rozpuszczonych i białek o niskiej masie cząsteczkowej (LMW) z moczem, często powikłanymi powikłaniami metabolicznymi i wzrostowymi oraz rozwojem przewlekłej choroby nerek.¹Mutacja inaktywująca OCRL jest powiązana z chorobą Dent 2 (MIM #300555), zaburzeniem charakteryzującym się dysfunkcją PT, kamieniami nerkowymi i postępującą niewydolnością nerek oraz zespołem oczno-mózgowym Lowe (MIM #309000), który dodatkowo wykazuje do dysfunkcji PT i niewydolności nerek, objawów ogólnoustrojowych, takich jak wrodzona zaćma, upośledzenie funkcji poznawczych i hipotonia.^2-4Obecne metody leczenia choroby Dent 2 i zespołu Lowe'a są jedynie wspomagające.

Rysunek 1|PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)Inhibitory łagodzą nieprawidłowe składanie aktyny w endosomach w modelu komórek ludzkiej nerki (HK2) z niedoborem OCRL. (a) Etapy konwersji fosfoinozytydów w lipidy istotne dla tego badania wskazujące na konwersje między PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2 i PI(3)P z najbardziej istotnymi enzymami zaznaczonymi pogrubioną czcionką, najistotniejsze konwersje liniami ciągłymi, a inne liniami przerywanymi. PI(4,5)P2 jest podwyższony w zespole Lowe'a z powodu braku aktywności 5-fosfatazy z OCRL i jest wytwarzany z fosforylacji PI przez kinazy 4-fosfatydyloinozytolu (PI4K) i PI(4) Kinaza P 5- (PIP5K). PI(4,5)P2 jest fosforylowany przez PI3K klasy I w celu wytworzenia PI(3,4,5)P3. PI(3,4,5)P3 może być defosforylowany do PI(4,5)P2 przez PTEN lub do PI(3,4)P2 przez SH-2-zawierające polifosforany inozytolu 50 (SHIP) 1 i 2, synaptojanina 1 i 2, a także OCRL, chociaż jest to (ciąg dalszy)

Rysunek 1|(ciąg dalszy) uważany za nieistotny. PI(3,4)P2 jest defosforylowany do PI(3)P przez polifosforan inozytolu-4-fosfatazy typu IA (INPP4A) i B. PI(3)P jest również wytwarzany w endosomach poprzez fosforylację PI przez klasę III PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-), wakuolowe białko sortujące Vps34. (b) Western blot ilustrujący utratę ekspresji OCRL w linii komórkowej HK2 OCRL CRISPR knockout (KO) w porównaniu z komórkami kontrolnymi HK2 typu dzikiego (WT) z tubuliną jako kontrolą obciążającą. (c-e) Reprezentatywne mikrografy konfokalne Airyscan i ilościowe oznaczenie nakładania się wczesnego endosomu antygenu 1 (EEA1)/aktyny (wyrażone jako procent wszystkich wykrytych pęcherzyków EEA1þ) dla komórek HK2 WT lub OCRL KO traktowanych albo dimetylosulfotlenkiem (DMSO) (d) lub wskazanym inhibitorem i utrwalono 4% roztworem formaldehydu. We wszystkich przypadkach obrazy ilustrują pojedynczy plaster Z z konfokalnego stosu poddanego obróbce Airyscanem komórek znakowanych immunologicznie dla EEA1 (żółty), falloidyny (aktyny, magenta) i 40,6-diamidyno{ {14}}fenyloindol (DAPI) (cyjan). Pręty=5 mm. W oznaczeniach ilościowych linie wskazują średnią ± SEM, a każdy punkt danych jest pojedynczą komórką. We wszystkich eksperymentach zabiegi stosowano 16 godzin przed utrwaleniem. We wszystkich kwantyfikacjach istotność statystyczną oceniono za pomocą analizy wariancji Kruskala-Wallisa (KW) z testem wielokrotnych porównań Dunna. (c) Komórki WT lub KO traktowane DMSO lub 1 00 nM kopanlizybu, wykazujące ratowanie nakładania się aktyny-endosomów. Test KW: ***P < 0.0{{50}}1,="" porównania="" wielokrotne;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" kopanlisib="" oba="" ***p="">< 00,001,="" wt="" copanlisib="" versus="" ko="" kopanlisib="" p="0,44" (nieistotne="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67="" i="" 63="" komórek="" odpowiednio="" dla="" wt="" dmso,="" wt="" kopanlizybu,="" ko="" dmso="" i="" ko="" copanlizybu.="" (d)="" komórki="" wt="" lub="" ko="" traktowane="" dmso="" lub="" 10="" mm="" alpelisibu,="" wykazujące="" ratowanie="" nakładania="" się="" aktyny-endosomów.="" test="" kw:="" ***p="">< 0,001,="" porównania="" wielokrotne;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" oba="" ***p="">< 0,001,="" wt="" alpelisib="" versus="" ko="" alpelisib.="" p=""> 0,99 (ns). N=31, 30, 43 i 41 komórek odpowiednio dla WT DMSO, WT alpelisibu, KO DMSO i KO alpelisibu. (e) Komórki WT lub KO traktowane DMSO, 10 mM GSK2636771 lub 10 mM idelalizybu, wykazując, że żaden ze związków nie jest w stanie znacząco zredukować nakładania się aktyna-endosom. Test KW: ***P < 0,001,="" porównania="" wielokrotne;="" wt="" dmso="" w="" porównaniu="" z="" ko="" dmso,="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" w="" porównaniu="" z="" ko="" gsk,="" *p="00,04," ko="" dmso="" w="" porównaniu="" z="" ko="" idelalizybem,="" p=""> 0,99 (ns). N=159, 130, 203, 122, 131 i 145 komórek odpowiednio dla WT DMSO, WT GSK2636771, WT idelalizybu, KO DMSO, KO GSK2636771 i KO idelalizybu. Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.kidney-international.org

W jaki sposób stosuje się alpelisib będący inhibitorem kinazy fosfoinozytydowej 3-w leczeniu zespołu Lowe/choroby Dent?

Białkomocz LMW jest stałą cechą obserwowaną w zespole Lowe/chorobie Dent 2, ujawniając, że OCRL wpływa na endocytozę zależną od receptora.⁵OCRL koduje fosfatydyloinozytol (PI) 4,5-bisfosforan [PI(4,5)P2] 5- fosfataza OCRL,⁶który kontroluje tożsamość lipidów w szlaku endolizosomalnym poprzez degradację PI(4,5)P2 (Figura 1a). Niewystarczająca degradacja PI(4,5)P2 przez OCRL wiąże się z niepowodzeniem w odkryciu pęcherzyków pokrytych klatryną w fibroblastach, czemu towarzyszy tworzenie się struktur „kometowych” spolimeryzowanej, nitkowatej aktyny z powstałych nieprawidłowych wczesnych organelli podobnych do endosomów.^7-9W innych typach komórek, w szczególności w komórkach PT nerki, niedobór OCRL powoduje powstawanie struktur „koszyka” F-aktyny otaczających nieprawidłowe organelle endolizosomalne.¹⁰Nadmiar F-aktyny blokuje przemieszczanie się przez błonę szlakiem endocytarnym i endolizosomalnym i sugeruje się, że zmniejsza recykling megaliny receptora wieloligandowego do błony wierzchołkowej, pogłębiając defekt w szlaku endolizosomalnym.¹¹W zgodzie z główną rolą nieprawidłowej aktyny F, wadliwy wychwyt endocytarny spowodowany mutacjami OCRL jest łagodzony przez celowanie w maszynerię aktyny latrunkuliną B lub przez zubożenie białek regulatorowych aktyny, jak również przez małe, interferujące zubożenie RNA (siRNA) za pośrednictwem kinazy PI(4)P 5- w celu dostosowania syntezy PI(4,5)P2^7,10(Rysunek 1a).

Coraz częściej rozumie się, że polimeryzacja aktyny powstaje nie tylko z PI(4,5)P2, ale także z innych lipidów fosfoinozytydowych. Na przykład, PI(3,4,5)P3 aktywuje GTPazę Rac typu Rho, a PI(3)P działa w połączeniu z PI(4,5)P2 w celu stymulowania polimeryzacji aktyny za inną GTPazą typu Rho, Cdc42.^12-14Wzajemna konwersja tych fosfoinozytydów jest sprzężona z ruchem lipidów na szlaku endocytarnym i endosomalnym. PI(4,5)P2 jest fosforylowany przez kinazę- 30 -fosfatydyloinozytolu klasy I (PI3K) do PI(3,4,5)P3 na błonie komórkowej i ulega stopniowej defosforylacji do PI(3,4)P2 i PI (3)P lub PI(4,5)P2.^14,15PI(3)P jest wzbogacony w endosomach, gdzie jest niezbędny dla ich funkcji i jest wytwarzany głównie przez bezpośrednią fosforylację PI przez klasę III PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-), Vps34¹⁶(Rysunek 1a). W linii komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z niedoborem OCRL (RPE), generowane komety aktynowe są redukowane przez traktowanie PI3K (kinaza fosfoinozytydu 3-)inhibitory wortmanniny i Vps34-IN1, zgodnie z badaniami biochemicznymi wykazującymi współregulację aktyny poprzez koincydencję zarówno PI(3)P, jak i PI(4,5)P2.¹⁴

Uratowanie endocytozy obserwowane podczas celowania w maszynerię aktynową w komórkach pacjentów z OCRL i knockout (KO),^7,10wraz z wstępną regulacją aktyny przez PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)działalność¹⁴i wysoce powiązana natura konwersji PI zapewnia intrygującą możliwość, że klasa I PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)inhibitory mogą być przydatne w zespole Lowe'a. Takie inhibitory, opracowane do leczenia raka, są dopuszczone do użytku klinicznego¹⁷i dlatego są potencjalnie podatne na zmianę przeznaczenia leków. Chociaż związki takie jak copanlisib¹⁸mają szeroką swoistość i skutki uboczne, ostatnio wykazano sukces w przypadku bardziej specyficznych inhibitorów. Idelalizyb,¹⁹który celuje w PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)podjednostka p110d, jest zatwierdzona dla przewlekłego chłoniaka limfocytowego, a alpelisib, który jest ukierunkowany na p110a, jest zatwierdzony do stosowania w raku sutka.^20,21Ponadto alpelisib wykazał korzyści kliniczne u dzieci z zespołem PROS/GODZINY,²²rzadki zespół przerostu wynikający z aktywacji PIK3A.

Tutaj przetestowaliśmy hipotezę, że klasa I PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)Inhibitory mogą ratować endocytarny defekt spowodowany utratą OCRL przy użyciu ustalonych modeli komórkowych i mysich.^10,11,23Pokazujemy, że hamowanie PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)Aktywność poprzez kopanlizyb lub alpelisib lub deplecję za pośrednictwem siRNA podjednostki katalitycznej p110a będącej celem alpelisibu zmniejsza nadmierną polimeryzację aktyny w komórkach ludzkiej nerki (HK2) z niedoborem OCRL. Koncentrując się na alpelizybie jako najbardziej specyficznym związku do zastosowania klinicznego, pokazujemy, że zmniejsza on polimeryzację aktyny i poprawia wychwyt przez szlak endolizosomalny w komórkach PT z humanizowanego Ocrl^Y/-myszy in vitro. Co więcej, leczenie alpelisibem in vivo łagodzi białkomocz, zmniejsza dysfunkcję PT i ratuje poziomy komórkowe megaliny w humanizowanym Ocrl^Y/-myszy. Wyniki te potwierdzają, że alpelisib jest kandydatem do ponownego użycia leku w:Zespół Lowe i choroba Denta 2.

Rysunek 2|Wpływ alpelisibu na aktynę jest zależny od dawki i podsumowany przez siRNA PI3K (kinaza fosfoinozytydu 3-)p110a. (a) Reprezentatywne zdjęcia konfokalne Airyscan (utrwalone przy użyciu 4-procentowego utrwalacza formaldehydu i znakowane immunologicznie dla wczesnego antygenu endosomu 1 [EEA1], żółtego; aktyny [falloidyny], magenta; i 4{{40}},{{ 5}}diamidyno-2-fenyloindol [DAPI], cyjan; słupki=5 mm) i oznaczanie ilościowe komórek nerki ludzkiej (HK2) typu dzikiego (WT) lub knockout (KO) leczonych dimetylosulfotlenkiem (DMSO) lub wskazane dawki alpelizybu przez 16 godzin, wykazujące zależne od dawki ratowanie nakładania się aktyno-endosomalnego. We wszystkich przypadkach linie wskazują średnią ± SEM, a punkty wskazują poszczególne komórki. N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 i 67 komórek do kontroli WT, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO i KO 2,5, 5, 10, 15, 25 i 50 mM alpelisibu, odpowiednio. Istotność statystyczna oceniana testem Kruskala-Wallisa (KW) z testem wielokrotnych porównań Dunna: ogólnie ***P < 0,001,="" wielokrotne="" porównania;="" wt="" dmso="" wobec="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" wobec="" ko="" 5,="" 15,="" 25="" i="" 50="" mm="" alpelisibu="" wszystkie="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" wobec="" ko="" 2,5="" mm="" alpelisibu="" *p="00,0131," ko="" dmso="" wobec="" ko="" 10="" mm="" alpelisibu="" **p="0.0043," wt="" dmso="" w="" porównaniu="" z="" wt="" 10="" i="" 50="" mm="" alpelisibem="" p=""> 0,9999 (nieistotne [ns]). (b) Western blot dla p110a i kontroli nakładania a-tubuliny komórek WT lub KO traktowanych siRNA mieszaniem (Scram.) lub p110a. (c) Reprezentatywne zdjęcia konfokalne Airyscan (utrwalone przy użyciu 4-procentowego utrwalania formaldehydu i znakowane immunologicznie dla EEA1, żółtego; aktyny [falloidyna], magenta; i DAPI, cyjan; słupki =5 mm) oraz oznaczenie ilościowe traktowanych komórek WT lub KO z siRNA mieszanym (S) lub p110a, wykazując zmniejszenie nakładania się aktyny EEA 1- na wyczerpanie p110a. Test KW z testem wielokrotnych porównań Dunna: ***P < 0,001,="" wielokrotne="" porównania;="" wymieszanie="" wt="" w="" porównaniu="" z="" wymieszaniem="" ko,="" wymieszanie="" ko="" w="" porównaniu="" z="" sirna="" ko="" p110a,="" oba="" ***p="">< 0,001.="" n="79," odpowiednio="" 108,="" 93="" i="" 131="" komórek.="" hk2,="" ludzka="" nerka;="" pi3k,="" kinaza="" fosfatydyloinozytolu="" -30="" -;="" sirna,="" mały,="" interferujący="" rna.="" aby="" zoptymalizować="" wyświetlanie="" tego="" obrazu,="" zapoznaj="" się="" z="" wersją="" online="" tego="" artykułu="" pod="" adresem="">

Rysunek 3|Poziomy fosfatydyloinozytolu (PI) 4,5-bisfosforanu [PI(4,5)P2] są podwyższone z nokautem OCRL (KO) i PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 i PI(3)P są tłumione przez leczenie alpelisibem. We wszystkich eksperymentach wskazane zabiegi stosowano 16 godzin przed utrwaleniem. W oznaczeniach ilościowych linie wskazują średnią ± SEM, a każdy punkt danych wynika z pojedynczej komórki. We wszystkich kwantyfikacjach istotność statystyczną oceniono za pomocą analizy wariancji Kruskala-Wallisa (KW) z testem wielokrotnych porównań Dunna. Pręty=20mm na wszystkich obrazach. (a) Reprezentatywne zdjęcia szerokokątne komórek nerki typu dzikiego (WT) lub KO ludzkiej nerki (HK2) potraktowanych dimetylosulfotlenkiem (DMSO) lub 10 mM alpelisibu, a następnie utrwalonych za pomocą utrwalacza błony komórkowej i znakowanych immunologicznie pod kątem PI (3,4,5) )P3 (czerwony) i 40,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) (cyjan), z ilościowym określeniem średniej intensywności znakowania komórkowego PI(3,4,5)P3, pokazującym skuteczność alpelisibu obróbka na syntezie PI(3,4,5)P3. N=96, 128 i 109 komórek odpowiednio dla WT DMSO, WT alpelisibu, KO DMSO i KO alpelisibu. KW (ciąg dalszy)

Rysunek 3|(ciąg dalszy) test: ogólnie ***P < 0.001,="" wielokrotne="" porównania;="" wt="" dmso="" kontra="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" kontra="" wt="" alpelisib="" i="" ko="" dmso="" kontra="" ko="" alpelisib="" wszystkie="" ***p="">< 0.="" 0{{70}}1.="" (b)="" reprezentatywne="" mikrofotografie="" konfokalne="" komórek="" wt="" lub="" ko="" hk2="" traktowanych="" dmso,="" 10="" mm-="" lub="" 50-mm="" alpelisibem="" przez="" 16="" godzin,="" a="" następnie="" utrwalane="" fiksem="" golgiego="" i="" znakowane="" przy="" użyciu="" m="" ch="" {{10}}xfyve="" sonda="" pi(3)p="" (magenta)="" i="" dapi="" (cyjan),="" z="" ilościowym="" określeniem="" liczby="" punktów="" pi(3)p-dodatnich="" wykrytych="" w="" komórkach="" leczonych="" różnymi="" stężeniami="" alpelisibu="" ,="" jak="" wskazano,="" pokazując,="" że="" punkty="" pi(3)p-dodatnie="" są="" zmniejszone="" w="" sposób="" zależny="" od="" dawki.="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" i="" 215="" komórek="" do="" kontroli="" wt,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" i="" ko="" 2,5,="" odpowiednio="" 5,="" 10,="" 25="" i="" 50="" mm="" alpelisibu.="" test="" kw:="" ogólnie="" ***p="">< 0,001,="" wielokrotne="" porównania;="" dmso="" wt="" wobec="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" wobec="" wt="" 10="" i="" 50="" mm="" alpelisibu,="" ko="" dmso="" wobec="" ko="" 50="" mm="" alpelisibu="" wszystkie="" ***p="">< 0,001;="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" i="" 5="" mm="" alpelisib="" oba="" p=""> 0,9999 (nieistotne [ns]); KO DMSO versus KO 10 mM alpelisib **P=0,0049; KO DMSO kontra KO 25 mM alpelisib ***P=0.0002. (c) Reprezentatywne mikrofotografie szerokokątne komórek WT lub KO HK2 potraktowanych DMSO lub 10 mM alpelisibu, a następnie utrwalonych za pomocą utrwalacza błony plazmatycznej i znakowanych immunologicznie dla PI(4,5)P2 (żółty) i DAPI (cyjan), z oznaczeniem ilościowym średnia intensywność znakowania komórkowego PI(4,5)P2, wykazująca zwiększoną błonę komórkową PI(4,5)P2 w komórkach KO, która jest zmniejszona przez traktowanie alpelisibem, szczególnie w komórkach KO. N=126, 112, 85 i 116 komórek odpowiednio dla WT DMSO, WT alpelisibu, KO DMSO i KO alpelisibu. Test KW: ogólnie ***P < 0,001,="" wielokrotne="" porównania;="" wt="" dmso="" wobec="" ko="" dmso="" i="" ko="" dmso="" wobec="" ko="" alpelisibu="" oba="" ***p="">< 0,001;="" dmso="" wt="" versus="" alpelisib="" wt="" p="0.4752" (ns).="" (d)="" reprezentatywne="" mikrofotografie="" szerokokątne="" komórek="" wt="" lub="" ko="" hk2="" potraktowanych="" dmso="" lub="" 10="" mm="" alpelisibu,="" a="" następnie="" utrwalonych="" 4-procentowym="" fiksem="" formaldehydowym="" i="" znakowanych="" immunologicznie="" dla="" pi(4,5)p2="" (żółty)="" i="" dapi="" (cyjan),="" z="" oznaczeniem="" ilościowym="" liczby="" pi(4,5)p2-dodatnich="" puncta,="" wykazujących="" zwiększoną="" pi(4,5)p2="" puncta="" w="" komórkach="" ko,="" która="" jest="" zmniejszona="" przez="" traktowanie="" alpelisibem,="" szczególnie="" w="" komórkach="" ko.="" n="75," 65,="" 52="" i="" 69="" komórek="" odpowiednio="" dla="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisibu,="" ko="" dmso="" i="" ko="" alpelisibu.="" test="" kw:="" ogólnie="" ***p="">< 0,001,="" wielokrotne="" porównania;="" wt="" dmso="" wobec="" ko="" dmso="" i="" ko="" dmso="" wobec="" ko="" alpelisibu="" oba="" ***p="">< 0,001;="" dmso="" wt="" versus="" alpelisib="" wt="" p=""> 0,99 (ns). au, jednostki arbitralne. Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.kidney-international.org.

W jaki sposób stosuje się alpelisib będący inhibitorem kinazy fosfoinozytydowej 3-w leczeniu zespołu Lowe/choroby Dent?

1. WYNIKI

1.1 Inhibitory PI3K klasy I zmniejszają agregację aktyny w komórkach OCRL-KO HK2

Zastosowaliśmy edycję genu CRISPR-Cas9 do nokautu (KO) OCRL w linii komórkowej HK2, aby umożliwić testowanie klasy I PI3K (kinaza fosfoinozytydu 3-)inhibitory charakterystycznej agregacji aktyny w przedziałach endolizosomalnych.^7,9,10,14Western blot zweryfikował 98.0± 0.7% redukcję ekspresji OCRL w lizatach z komórek KO HK2 (Figura 1b). OCRL KO podsumował fenotyp koszyka aktyny w komórkach HK2, na co wskazuje zwiększone nakładanie się F-aktyny i wczesnego antygenu endosomu 1 (EEA1), określone ilościowo na stosach z mikroskopii konfokalnej Airyscan (ryc. 1c-e). To zwiększone nakładanie się obserwowane w komórkach OCRL KO zostało odwrócone przez traktowanie kopanlizybem (C), PI3K o szerokim zakresie (kinaza fosfoinozytydu 3-)inhibitor, który jest nakierowany na p110a i d oraz w mniejszym stopniu na izoformy p110b i g (Figura 1c). Poprzez Western blotting ekstraktów z całych komórek HK2 odkryliśmy, że PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)Wszystkie podjednostki regulatorowe p110 a, b i d były dobrze wyrażane zarówno w komórkach typu dzikiego (WT), jak i komórkach KO, z obecnością jedynie śladowych poziomów izoformy p110g (rysunek uzupełniający S1A).

Wyróżniliśmy PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)specyficzność hamowania F-aktyny przy użyciu alpelisibu (A), selektywnego inhibitora p110a oraz GSK2636771 (G) i idelalizybu (I), selektywnych inhibitorów, odpowiednio, p110b i p110d (rysunek uzupełniający S1A). Chociaż leczenie alpelisibem powodowało podobne zmniejszenie polimeryzacji aktyny endosomalnej w porównaniu z kopanlizybem (Figura 1d), GSK2636771 i idelalizyb miały niewielki wpływ na akumulację aktyny (Figura 1e). Klasa I PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)Inhibitory nie wykazywały zwiększonej toksyczności wobec OCRL KO w porównaniu z komórkami niezmodyfikowanymi, na podstawie testu MTT (rysunek uzupełniający S1B).

1.2 Knockdown alpelisibu i p110a ratuje fenotyp aktyny w komórkach HK2

W kolejnych badaniach skupiliśmy się na alpelizybie, ponieważ jest to najbardziej selektywny i najmniej toksyczny PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)inhibitor opracowany do tej pory i jest obecnie stosowany w leczeniu mozaikowej nadaktywacji klasy Ia PI3K u dzieci z zespołem PROS/CLOVES.²²Alpelizyb zmniejszał koszyki aktynowe w komórkach OCRL KO HK2 w sposób zależny od dawki (Figura 2a). Efekty zaobserwowano przy dawce 10 mM już 4 godziny po leczeniu, bez widocznej toksyczności (rysunek uzupełniający S2). Aby sprawdzić, czy PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)hamowanie przez alpelisib było źródłem zmniejszonego barwienia aktyny, specyficznie zmniejszyliśmy jego cel, podjednostkę p110a, stosując siRNA (Figura 2b). W porównaniu z traktowaniem kontrolnym (wymieszanym z sekwencją) siRNA, siRNA przeciwko p110a spowodowało 78,3±4,8 procent i 68,9±7,7 procent zubożenia białka p110a odpowiednio w komórkach WT i OCRL KO HK2, co odzwierciedla znaczące zmniejszenie koszyków aktynowych ( Rysunek 2c).

1.3 Zmniejszone poziomy PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 i PI(3)P w komórkach HK2 leczonych alpelisibem

Aby zbadać, w jaki sposób leczenie OCRL KO i alpelisibem wpływa na lipidy fosfoinozytydowe, wybarwiliśmy komórki HK2 przeciwciałami lub domenami białkowymi przeciwko PI(3,4,5)P3, PI(3)P i PI(4,5)P2, stosując zoptymalizowane warunki utrwalania błony komórkowej lub barwienia wewnątrzkomórkowego.^24,25PI(3,4,5)P3 ma rozproszoną lokalizację w błonie komórkowej, a traktowanie alpelisibem (10 mM) wywołało silny spadek barwienia dla PI(3,4,5)P3 zarówno w komórkach KO WT, jak i OCRL, ponieważ oczekiwany po jego mechanizmie działania i specyficzności dla klasy IA PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)p110a (rysunek 3a). Oczekuje się, że PI(3,4,5)P3 będzie ulegał stopniowej defosforylacji w miarę endocytozy i przemieszczenia błon do endosomów.^14,26,27Utrwalając komórki tak, aby zachować wewnątrzkomórkowy PI(3)P,²⁵stwierdziliśmy, że PI(3)P punctae również uległo zmniejszeniu przez leczenie alpelisibem (w sposób zależny od dawki, widoczny przy stężeniach tak niskich jak 10 mm dla 16-godziny leczenia) zarówno w komórkach WT, jak i OCRL KO (Figura 3b oraz Rysunek uzupełniający S2C). Jak oczekiwano, KO OCRL w komórkach HK2 indukowało wyraźny wzrost poziomów PI(4,5)P2 zarówno w błonie plazmatycznej (Figura 3c), jak i wewnątrzkomórkowo (Figura 3d), w porównaniu z komórkami WT.^10,28Traktowanie alpelisibem znacząco zmniejszyło wzrost PI(4,5)P2 generowanego przez OCRL KO w obu kompartmentach, podczas gdy nie miało to wpływu na komórki WT (Figura 3c i d). Doniesiono, że alpelisib hamuje 4-kinazę PI b przy 50 procentowym stężeniu hamującym 0,5 mM,¹⁹co jest możliwym źródłem redukcji PI(4,5)P2. Łącznie nasze dane sugerowały, że alpelisib hamuje składanie aktyny na endosomach OCRL KO poprzez dwuswoisty wpływ na poziomy PI(4,5)P2 i PI(3)P.

Rysunek 4|Alpelisib łagodzi defekty aktynowe jamy ustnej w hodowlach humanizowanych Ocrl^Y/-mysie PTC (m PTC). (a) Reprezentatywne mikrografie konfokalne projekcji Z o maksymalnej intensywności OcrlY/þ lub Ocrl^Y/-m PTC potraktowane dimetylosulfotlenkiem (DMSO) lub 10 mM alpelisibu przez 16 godzin, a następnie utrwalone 4-procentowym fiksem formaldehydu i znakowane immunologicznie pod kątem aktyny (falloidyny) (biały) i 40,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) (niebieski), z ilościowym określeniem stopnia, w jakim włókna stresowe są obecne w każdych warunkach, pokazując, że włókna stresowe utracone w Ocrl^Y/-m PTC są ratowane przez leczenie alpelisibem. Linie wskazują średnie ± SEM, a punkty danych wskazują każdy region obrazowania: N=5 regionów obrazowania na stan (każdy zawiera około 15–20 komórek). Istotność została oceniona za pomocą zwykłej 1-analizy wariancji (ANOVA) z testem wielokrotnych porównań Holma-Sidaka, **P=00,001, wielokrotne porównania; Ocrl Y/þ DMSO kontra Ocrl^Y/-DMSO **

P=0.002, Okrl^Y/-DMSO kontra Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO kontra Ocrl^Y/- alpelisib P=0.50 (nieistotne [ns]). Pręty=20mm. (b) Reprezentatywne rendery 3D powierzchni Ocrl m PTC traktowane w dużym powiększeniu DMSO lub 10 mM alpelisibu przez 16 godzin, a następnie utrwalane 4-procentowym fiksem formaldehydowym i znakowane immunologicznie pod kątem wczesnego antygenu endosomu 1 (EEA1) (fioletowy), aktyny ( falloidyna, żółty) i DAPI (niebieski) oraz oznaczenie ilościowe ilustrujące ratowanie nakładania się aktyno-endosomalnego przez alpelisib. Widoki w mniejszym powiększeniu wskazujące przeglądy (ciąg dalszy)

Rysunek 4|(ciąg dalszy) te regiony są pokazane na rysunku uzupełniającym S4B i filmach uzupełniających S1–S3. Linie wskazują średnią ± SEM. N=42, 47 i 45 losowo wybranych pól dla OcrlY/þ þ DMSO, Ocrl^Y/-þ DMSO i Ocrl^Y/-þ stanów alpelizybu, odpowiednio, w każdym przypadku połączono z 4 mysich nerek na stan. Istotność testowano metodą ANOVA Kruskala-Wallisa (KW) z testem wielokrotnych porównań Dunna: ogólnie ***P < 00,001,="" wielokrotne="" porównania;="" ocrly/þ="" dmso="" kontra="">^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-DMSO kontra Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" kontra="">^Y/-alpelisib P > 0,99 (ns). Pręty=1 mm. (c) Reprezentatywne zdjęcia konfokalne OcrlY/þ lub Ocrl^Y/-m PTC potraktowano DMSO lub 10-mM alpelisibem, a następnie utrwalono za pomocą aparatu Golgiego i wyznakowano przy użyciu sondy m Ch-2xFYVE PI(3)P (magenta) i DAPI (niebieskozielony), z oznaczeniem ilościowym liczba punktów PI(3)P-dodatnich wykrytych w komórkach. N=188, 177, 246 i 206 komórek z OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO i Ocrl^Y/-þ odpowiednio alpelisib; komórki połączono z 3 nerek jamy ustnej na grupę. Test KW: ogólnie ***P < 0.001,="" wielokrotne="" porównania;="" ocrly/þ="" dmso="" kontra="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO kontra OcrlY/þ alpelisib i Ocrl^Y/-DMSO kontra Ocrl^Y/-alpelisib, wszystkie ***P < 0.001.="" pręty="20" mm.="" (d)="" reprezentatywne="" zdjęcia="" konfokalne="" ocrly/þ="" lub="">^Y/-m PTC potraktowane DMSO lub 10 mM alpelisibu przez 16 godzin, a następnie utrwalone 4-procentowym utrwalaczem formaldehydu i znakowane immunologicznie pod kątem fosfatydyloinozytolu (PI) 4, 5-bisfosforanu [PI(4,5) P2] (żółty) i DAPI (błękitny), z ilościowym określeniem liczby punktów PI(4,5)P2-dodatnich, wykazujących wzrost punktów PI(4,5)P2 w Ocrl^Y/-komórki, które są redukowane przez leczenie alpelisibem. N=477, 444, 423 i 494 z OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO i Ocrl^Y/-þ odpowiednio alpelisib; komórki połączono z 3 nerek jamy ustnej na grupę. Test KW: ogólnie ***P < 0.001,="" wielokrotne="" porównania;="" ocrly/þ="" dmso="" kontra="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO kontra OcrlY/þ alpelisib i Ocrl^Y/-DMSO kontra Ocrl^Y/-alpelisib, wszystkie ***P < 0.001.="" pręty="20" mm.="" aby="" zoptymalizować="" wyświetlanie="" tego="" obrazu,="" zapoznaj="" się="" z="" wersją="" online="" tego="" artykułu="" pod="" adresem="">

1.4 Alpelizyb zmniejsza wewnątrzkomórkowe fosfoinozytydy i łagodzi defekty cytoszkieletu w Ocrl^Y/-m PTC

Następnie zbadaliśmy, czy alpelisib miał taki sam wpływ na pierwotne komórki komórek PT pochodzących z humanizowanego modelu myszy Ocrldefificient (Ocrl^Y/-), która podsumowuje nieprawidłową polimeryzację aktyny i defekt endocytarny obserwowany w komórkach pochodzących od pacjenta.^10,11Mysie PTC (m PTC) wyrażane podobnie do klasy I PI3K (fosfoinozytyd 3-kinaza) podjednostki regulatorowe do komórek HK2 zarówno w WT, jak i Ocrl^Y/-myszy i wykazywały podobny profil toksyczności w stosunku do alpelisibu w ocenie za pomocą testów MTT (rysunek uzupełniający S3). Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej ujawniło uderzające zakłócenie normalnej architektury włókien naprężeniowych F-aktyny w m PTC firmy Ocrl^Y/-w porównaniu z myszami OcrlY/þ, prawdopodobnie z powodu relokacji białek regulatorowych aktyny z ich normalnych lokalizacji komórkowych do endosomów, ponieważ duże zespoły aktyny otaczają te organelle i uważa się, że są źródłem defektu transportu.^10,29Leczenie Ocrl^Y/- m PTC z alpelisibem (10 mM) przywróciły architekturę włókien stresowych (Rysunek 4a).

W jaki sposób stosuje się alpelisib będący inhibitorem kinazy fosfoinozytydowej 3-w leczeniu zespołu Lowe/choroby Dent?

Jako główny problem wZespół Lowe i choroba Denta2 jest zmniejszony handel endosomalny i wynikająca z niego degradacja megaliny, staraliśmy się odróżnić endosomalną aktynę od włókien stresowych. Zebraliśmy skanowane laserowo konfokalne stosy Z w komórkach, zrekonstruowaliśmy wzór barwienia w renderowaniu powierzchni 3D i użyliśmy kształtu/parametrów rozmiaru do identyfikacji struktur punktowych aktyn oraz stopnia, w jakim nakładają się one na struktury endosomalne (rysunek uzupełniający S4 i filmy S1 –S3). Analiza ta wykazała, że ​​traktowanie alpelisibem zmniejszyło nieprawidłową polimeryzację F-aktyny w endosomach wybarwionych EEA1, w odróżnieniu od architektury włókien stresowych (Figura 4b). m PTC pochodzące z Ocrl^Y/-myszy wykazywały znaczące zmiany w barwieniu wewnątrzkomórkowym dla PI(3)P (zmniejszone) i PI(4,5)P2 (zwiększone), w porównaniu z m PTC z myszy WT OcrlY/þ (Figura 4c i d). Leczenie m PTC od Ocrl^Y/- myszy z alpelisibem powodowały znaczne zmniejszenie wewnątrzkomórkowego barwienia PI(3)P i PI(4,5)P2 (Figura 4c i d).

1.5 Alpelizyb poprawia wychwyt endocytarny w Ocrl^Y/-m PTC

Następnie oceniliśmy, czy wpływ alpelisibu na defekty cytoszkieletu i pęcherzyków obserwowane w m PTC powodował zmiany w zdolności wychwytu endocytów. Aby zróżnicować wpływ alpelisibu na wiązanie i/lub internalizację liganda, m PTC inkubowano najpierw ze znakowaną albuminą surowicy bydlęcej (BSA), aby zaindukować wiązanie sondy z receptorami endocytarnymi, a następnie inkubowano z pożywką wzrostową, aby śledzić internalizację albuminy (ryc. 5a). Okrl^Y/-komórki wykazały niższe wiązanie z błoną komórkową Alexa 488-albumin surowicy bydlęcej wraz z upośledzoną internalizacją albuminy w porównaniu z komórkami OcrlY/þ. Leczenie alpelisibem uratowało zarówno wiązanie, jak i wychwyt albuminy w Ocrl^Y/-komórek, z 50% całkowitym ratowaniem wychwytu endocytarnego (Figura 5b i c). Dane te zostały poparte pomiarem całkowitego wychwytu albuminy (rysunki uzupełniające S5a ib). Zauważyliśmy, że stosunek zinternalizowanej/związanej albuminy Alexa 488-z surowicy bydlęcej pozostał podobny w różnych warunkach (Figura 5d), co sugeruje, że zmniejszony wychwyt albuminy wynika głównie z upośledzonego wiązania, a nie z samego wadliwego procesu internalizacji.

1.6 Alpelizyb poprawia dysfunkcję PT i endocytozę zależną od receptorów w Ocrl^Y/- myszy

Przetestowaliśmy potencjalny efekt terapeutyczny alpelisibu na dysfunkcję PT in vivo. Myszom doustnym podawano nośnik lub alpelisib (50 mg/kg masy ciała na dzień) przez zgłębnik doustny przez 6 tygodni (Figura 6a). Ten schemat został wybrany zgodnie z wcześniejszymi badaniami in vivo wykazującymi skuteczność i bezpieczeństwo.^22,30Zgodnie z faktem, że podawanie alpelisibu powoduje insulinooporność i hiperglikemię,²²leczenie alpelisibem doprowadziło do znacznego wzrostu glikozurii zarówno w Ocrl Y/þ, jak i Oral^Y/-myszy, które można by uznać za biomarker do dawkowania leku (tabela uzupełniająca S1). Po 6 tygodniach leczenia alpelisibem Ocrl^Y/-myszy wykazywały znaczne zmniejszenie wydalania z moczem białek LMW CC16 (-34 procent) i albuminy (-38 procent) w porównaniu z kontrolami, którym podawano nośnik (Figura 6b i c), podczas gdy objętość mocz i inne parametry nie uległy zmianie (tabela uzupełniająca S1). Myszy obu genotypów, którym podawano alpelisib, wykazywały podobne zmniejszenie tempa wzrostu w stosunku do myszy kontrolnych, jak opisano wcześniej.²²Niemniej jednak, zarówno myszy z nośnikiem, jak i myszy leczone przybrały na wadze, co wskazuje, że lek nie wpływa poważnie na rozwój pourodzeniowy (Figura 6d i tabela uzupełniająca S1).

Aby sprawdzić, czy wpływ alpelisibu na białkomocz LMW odzwierciedla powrót endocytozy za pośrednictwem receptora w komórkach PT, prześledziliśmy in vivo wychwyt B-laktoglobuliny znakowanej Cy5-w nerce myszy. Ocrl . poddany obróbce alpelizibem^Y/-myszy wykazywały znaczące ratowanie wychwytu b-laktoglobuliny znakowanej Cy5-, bliskie zakresowi internalizacji obserwowanemu u myszy OcrlY/þ traktowanych nośnikiem (Figura 6e). Odzwierciedlało to znaczące uratowanie ekspresji megaliny receptora endocytowego w komórkach PT, obserwowane przez immunoznakowanie i western blotting lizatów nerkowych Ocrl traktowanego alpelisibem.^Y/-myszy; należy zauważyć, że nie nastąpiła zmiana w ekspresji markera PT AQP1 (Rysunek 6f i gi Rysunek uzupełniający S5C i D). Dane te pokazują, że PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)inhibitor alpelisibindukuje znaczną poprawę maszynerii endocytarnej PT i zmniejsza białkomocz LMW w humanizowanym mysim modelu zespołu Lowe.

Rysunek 5|Alpelizyb poprawia endocytarny wychwyt humanizowanego Ocrl^Y/-mysie PTC (m PTC). (a) Schemat ilustrujący eksperyment z pogonią pulsacyjną zastosowany do zbadania wiązania i internalizacji Alexa 488-albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do m PTC. Komórki poddano działaniu Alexa 488-BSA (0,2 mg/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni, aby umożliwić BSA związanie się z receptorami na powierzchni komórki (impuls), a następnie ogrzano do 37 stopni w pożywce komórkowej na 20 minut przed utrwaleniem, aby umożliwić internalizację ligandu (chase). (b) Reprezentatywne zdjęcia konfokalne OcrlY/þ lub Ocrl^Y/-m PTC potraktowane dimetylosulfotlenkiem (DMSO) lub 10 mM alpelisibu przez 16 godzin i poddane eksperymentowi Alexa 488-BSA (zielony) puls-chase, przed utrwaleniem i oznakowaniem 40,6-diamidyno{ {6}}fenyloindol (DAPI) (niebieski). Faza impulsu eksperymentu jest pokazana w górnym panelu dla każdego warunku, z przebiegiem poniżej. Pręty=20 mm. (c) Kwantyfikacja powierzchni komórki Alexa 488-BSA (i) i zinternalizowanej Alexa 488-BSA (ii), oceniona jako średnie intensywności fluorescencji FL na komórkę. Alpelisib ratuje uratowane wiązanie BSA i internalizację obserwowaną w Ocrl^Y/-komórki. N=209, 228, 186 i 196 komórek dla OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisibu, OcrlY/ DMSO i Ocrl^Y/-warunki alpelisibu, odpowiednio w (i) i N=203, 183, 199 i 233 komórkach dla OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisibu, Ocrl^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-warunki alpelizybu, odpowiednio w (ii), w każdym przypadku połączono z 2 nerek myszy na stan; każdy punkt danych reprezentuje średnią intensywność fluorescencji FL w pojedynczej komórce. Istotność zbadano za pomocą analizy wariancji Kruskala-Wallisa (KW) (ANOVA) z testem wielokrotnych porównań Dunna: dla (i) powierzchni komórki BSA, ogólnie ***P < 00,001,="" porównania="" wielokrotne:="" ocrly/þ="" dmso="" kontra="">^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-DMSO kontra Ocrl^Y/-alpelisib ***P < {{0}}.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (nieistotne="" [ns]);="" dla="" (ii)="" zinternalizowanej="" bsa,="" ogólnie="" ***p="">< 0,001,="" wielokrotne="" porównania:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-DMSO kontra Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns).="" (d)="" ilościowe="" określenie="" stosunku="" między="" intensywnością="" fluorescencji="" alexa="" 488-="" bsa="" na="" powierzchni="" komórki="" a="" zinternalizowanym="" alexa="" 488–bsa="" fl,="" wykazujące="" brak="" istotnych="" różnic="" w="" stosunkach="" między="" poszczególnymi="" stanami.="" każdy="" punkt="" reprezentuje="" średnią="" proporcji="" w="" polu="" zawierającym="" około="" 15–20="" komórek="" (n="13," 13,="" 10="" i="" 11="" losowo="" wybranych="" pól="" dla="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="">^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-w warunkach alpelizybu, w każdym przypadku połączono z 2 nerek myszy na stan). Istotność została przetestowana przez KW ANOVA z testami wielokrotnych porównań Dunna: ogólne P=0.46 (ns), wielokrotne porównania: OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-DMSO kontra Ocrl^Y/-alpelisib P > 0,99 (ns); OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib P=0.84 (ns). Aby zoptymalizować wyświetlanie tego obrazu, zapoznaj się z wersją online tego artykułu pod adresem www.kidney-international.org.

Rysunek 6|Alpelizyb poprawia funkcję kanalików proksymalnych (PT) myszy OcrlY/L, przywracając wychwyt ligandu i ekspresję megaliny. (a) Konfiguracja eksperymentalna. Myszy doustnie leczono przez 6 tygodni dzienną doustną dawką 1% karboksymetylocelulozy (nośnik) lub alpelisibu (50 mg/kg masy ciała). Ostatniego dnia leczenia myszom wstrzykiwano b-laktoglobulinę znakowaną Cy5- (N=6 Ocrl^Y/-lub 8 Okrl^Y/-myszy na grupę). (b–d) Przedstawione wartości D wskazują średnią zmianę od BL do D42 dla stanu ±SEM. (b) Białko komórki Clara 16 (CC16), (c) wydalanie albuminy z moczem (oba w ciągu 15 godzin) i (d) masę ciała mierzono u myszy OcrlY/- leczonych nośnikiem lub alpelisibem we wskazanym punkcie czasowym. Każda kropka reprezentuje 1 mysz. Istotność oceniano za pomocą 2-ogonowego sparowanego testu t-Studenta; w lit. b) CC16 (ciąg dalszy)

Rysunek 6|(ciąg dalszy) zmiana produkcji w stosunku do stanu wyjściowego; þ pojazd, P=0.9802 (nieistotne [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334; in (c) zmiana wydalania albumin w stosunku do wartości wyjściowej; þ nośnik, P=00,0502 (ns), þ alpelisib, ***P=0,0006; in (d) zmiana masy ciała w stosunku do wartości wyjściowej; þ pojazd, ***P < 0,0001,="" þ="" alpelisib,="" **p="0,0083." (e)="" reprezentatywne="" zdjęcia="" konfokalne="" przedstawiające="" b-laktoglobulinę="" znakowaną="" cy5-="" (magenta)="" 15="" minut="" po="" wstrzyknięciu="" do="" żyły="" ogonowej="" i="" znakowaną="" 40,6-diamidyno-2-fenyloindolem="" (dapi)="" (cyjan),="" plus="" kwantyfikacja="" odpowiednich="" sygnałów="" fluorescencyjnych="" fl="" z="" nerek="" myszy="" ocrl="" (odpowiednio="" n="412," 500="" i="" 588="" kanalików,="" dla="" nośnika="" ocrly/þþ,="">^Y/-þ pojazd i Ocrl^Y/-þ alpelisib) dla 3 myszy na grupę leczoną. Wychwyt b-laktoglobuliny jest ratowany przez leczenie alpelisibem. Pręty ¼ 20 mm. W oznaczeniach ilościowych każda kropka reprezentuje intensywność fluorescencji FL znormalizowaną przez powierzchnię kanalików; wykreślone dane wskazują średnią ± SEM. Istotność oceniano testem Kruskala-Wallisa (KW), a następnie testem wielokrotnego porównania Dunna; ***P < 0,001,="" porównania="" wielokrotne;="" pojazd="" ocrly/þþ="" kontra="">^Y/-þ pojazd i Ocrl^Y/-þ pojazd kontra Ocrl^Y/-þ alpelisib, oba ***P < 0.001.="" (f)="" analiza="" western="" blotting="" i="" densytometryczna="" poziomów="" megaliny="" w="" lizatach="" całej="" nerki="" od="" myszy="" oral.="" jako="" kontrolę="" ładowania="" zastosowano="" a-tubulinę.="" zmniejszona="" ekspresja="" megaliny="" w="">^Y/-zostaje uratowany przez alpelisib. W kwantyfikacji analizy densytometrycznej każda kropka reprezentuje 1 mysz (N=4 OcrlY/þþ nośnik i Ocrl^Y/-þ pojazd i N=3 Ocrl^Y/-þ myszy alpelisib); linie wskazują średnią ± SEM. Istotność oceniono za pomocą 2-ogólnych niesparowanych testów t Studenta: pojazd OcrlY/þþ w porównaniu z Ocrl^Y/-þ pojazd; **P ¼ 0.0057, Okrl^Y/-þ pojazd kontra Ocrl^Y/- þ alpelisib, *P=0.0246. (g) Reprezentatywne mikrografie konfokalne z wstawkami o dużym powiększeniu i kwantyfikacją intensywności megaliny (żółty) w AQP1þ PT (magenta) z nerek jamy ustnej były również oznakowane jako DAPI (cyjan) ilustrujące ratowanie poziomów megaliny po leczeniu alpelisibem. Pręty=20 mm. W oznaczeniach ilościowych każda kropka reprezentuje intensywność fluorescencji FL znormalizowaną przez powierzchnię kanalików; wykreślone dane wskazują średnią ± SEM; N=142, 191 i 266 kanalików, odpowiednio, dla pojazdu OcrlY/þþ, Ocrl^Y/-þ pojazd i Ocrl^Y/-þ alpelisib dla 3 myszy na grupę leczoną. Istotność oceniano za pomocą analizy wariancji KW, a następnie testu wielokrotnego porównania Dunna; ogólnie ***P < 0.001,="" wielokrotne="" porównania;="" pojazd="" ocrly/þþ="" kontra="">^Y/-þ pojazd i Ocrl^Y/-þ pojazd kontra Ocrl^Y/-þ alpelisib, oba ***P < 0.001.="" aby="" zoptymalizować="" wyświetlanie="" tego="" obrazu,="" zapoznaj="" się="" z="" wersją="" online="" tego="" artykułu="" pod="" adresem="">

W jaki sposób stosuje się alpelisib będący inhibitorem kinazy fosfoinozytydowej 3-w leczeniu zespołu Lowe/choroby Dent?

2. DYSKUSJA

Obecnie nie ma leczenia łagodzącego wadliwą endocytozę powodującą dysfunkcję PT u pacjentówZespół Lowe i choroba Denta2. Nasze odkrycia ujawniają, że alpelisib łagodzi nieprawidłowy fenotyp aktyny poprzez zmniejszenie poziomów PI(4,5)P2 i PI(3)P, powodując znaczną poprawę maszynerii endocytarnej i zdolności absorpcyjnych w układach komórkowych oraz humanizowanym mysim modelu Zespół Lowe/choroba Dent 2. Wyniki te potwierdzają związek między lipidami fosfoinozytydowymi, polimeryzacją aktyny i transportem endocytarnym, co ma bezpośrednie znaczenie dla wysoce aktywnych komórek nabłonka zaangażowanych w kluczowe procesy homeostatyczne (ryc. 7). Biorąc pod uwagę brak skutecznych terapii i pozorne bezpieczeństwo tej klasy PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)inhibitorów, alpelisib jest obiecującym kandydatem do ponownego użycia leków wZespół Lowe i choroba Denta.

Białkomocz LMW jest najbardziej spójną cechą występującą u pacjentów z:Zespół Lowe i choroba Denta2 z powodu mutacji inaktywujących w OCRL.⁴Te białka LMW można łatwo wykryć i określić ilościowo, oferując wierny biomarker nieprawidłowej endocytozy za pośrednictwem receptora w komórkach PT.1 Białkomocz LMW jest szczególnie istotny, ponieważ jest wykrywany bardziej konsekwentnie i często wcześniej niż inne substancje rozpuszczone (np. glukoza, fosforan, aminokwasy) będące częścią klasycznego „nerkowego zespołu Fanconiego” – przynajmniej w przypadku wrodzonych zaburzeń szlaku endolizosomalnego.¹Tutaj pokazujemy, że alpelisib ratuje szczytową zdolność wychwytu endocytarnego komórek PT in vitro i in vivo, dzięki przywróconemu poziomowi receptora megaliny w błonie komórkowej. Efekt ten znajduje odzwierciedlenie w znacznym zmniejszeniu utraty moczu białek LMW (CC16 i albuminy) w Ocrl^Y/-myszy leczone alpelisibem przez 6 tygodni. Takie działanie alpelisibu zaobserwowano w m PTC, które zachowują swoje zróżnicowanie wierzchołkowe i są szczególnie dobrze przystosowane do badania endocytozy zależnej od receptorów w fizjologii i chorobie.⁹ W szczególności uzyskaliśmy m PTC z humanizowanego mysiego modelu wyrażającego ludzki INPP5B w Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/-tle, co pozwala nam zbadać konkretne konsekwencje utraty aktywności OCRL.^11,23

Uratowanie endocytozy przez alpelisib tłumaczy się jego wpływem na maszynerię aktynową, wyraźnie potwierdzoną w komórkach OCRL KO HK2 i m PTC. Nasze obserwacje potwierdzają zatem i rozszerzają wcześniejsze badania wykazujące związek między kontrolą równowagi fosfoinozytydów i F-aktyny we wczesnym szlaku endosomalnym u pacjentów z OCRL i komórkami KO.^7,10Funkcjonalna utrata aktywności OCRL upośledza degradację PI(4,5)P2, co z kolei prowadzi do niepowodzenia w odkryciu pęcherzyków pokrytych klatryną, co skutkuje nieprawidłowymi organellami endosomalnymi w różnych typach komórek, w tym w komórkach PT.^7-10Niedawno wykazaliśmy, że nadmiar F-aktyny zmniejsza recykling megaliny receptora wieloligandowego do błony wierzchołkowej komórek PT, powodując wadliwą endocytozę i białkomocz LMW.¹¹

Nasze dane wskazują, że mechanizm działania alpelisibu na endosomalną aktynę wynika z dwuswoistego efektu hamowania alpelisibu: po pierwsze na produkcję PI(3,4,5)P3 i jego konwersję do PI(3)P, a po drugie na produkcja PI(4,5)P2. Spadek poziomów PI(4,5)P2 bezpośrednio przeciwdziała niedoborowi OCRL i jest zgodny z wcześniejszymi pracami łagodzącymi nadmiar aktyny i zwiększający wypływ endocytów poprzez zmniejszenie poziomów kinazy 4-fosforanowej 5-fosfatydyloinozytolu , enzym, który generuje PI(4,5)P2.¹⁰Alpelizyb ma 0.5 mM 50-procentowe stężenie hamujące kinazę PI4Kb wytwarzającą PI(4,5)P2, która może być odpowiedzialna lub może wynikać z bardziej ogólnego wpływu na równowagę fosfoinozytydów wynikającego z połączenia OCRL Leczenie KO i alpelisibem. Zidentyfikowaliśmy, że klasa IA PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)hamowanie przez alpelisib jest związane z hamowaniem aktyny, ponieważ deplecja p110a za pośrednictwem siRNA hamuje akumulację aktyny podobnie jak leczenie alpelisibem i kopanlizybem (o którym nie doniesiono, aby hamowało PI4K). W komórkach RPE wcześniej zaobserwowaliśmy, że siRNA INPP4A, który przekształca PI(3,4)P2 w PI(3)P, hamuje tworzenie aktyny w komórkach OCRL KO, zapewniając ścieżkę hamowania PI(3,4,5) Produkcja P3 do spadku endosomalnego PI(3)P. Wykazaliśmy, że pewna ilość PI(3)P pozostaje, przypuszczalnie pula wytwarzana we wczesnym endosomie przez PI3K klasy III, Vps34, ponieważ stwierdziliśmy, że przemycanie do endosomów jest wzmacniane, a nie tłumione przez leczenie alpelisibem. Złożona współregulacja metabolizmu PI i jej znaczenie dla inaktywacji OCRL została również podkreślona w niedawnym badaniu, w którym niekatalityczne funkcje fosfoinozytydu 3- fosfatazy PTEN aktywują degradację PI(4,5)P2 poprzez PLCXD, łagodząc fenotypy komórkowe i wchłanianie ligandy w modelu danio pręgowanego.³¹

Złagodzenie fenotypu aktyny przez obniżony poziom PI(4,5)P2 i PI(3)P przez leczenie alpelisibem zgadza się z synergicznym działaniem PI(4,5)P2 i PI(3)P w rekrutacji SNX9 do aktywacji maszynerię aktynową w endosomach Ocrl,¹⁴sugerując bardzo skuteczne dopasowanie swoistości alpelisibu do manipulowania molekularną regulacją aktywacji aktyny w endosomach. Z kolei, jak wcześniej wykazano, zmniejszony montaż aktyny w endosomach prowadzi z kolei do poprawy endocytozy PT w komórkach z niedoborem OCRL.¹⁰Potrzebna będzie dalsza charakterystyka, aby lepiej zrozumieć, czy regulacja aktyny poprzez metabolizm fosfoinozytydu jest prawdziwym źródłem efektu terapeutycznego, który obserwujemy w przypadku alpelisibu w Ocrl^Y/-model myszy. Ponieważ klasa I PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)regulują szlaki kontrolujące wzrost komórek, proliferację, przeżycie, metabolizm i autofagię,³²nie możemy wykluczyć, że ratowanie endocytów wynika bezpośrednio z wpływu na PI(3,4,5)P3 i połączonego wpływu na inne szlaki modulowane przez PI3K klasy I. Potrzeba również więcej pracy, aby sprawdzić, czy PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)inhibitory mogą również łagodzić neurologiczne i inne objawy kliniczne pacjentów z mutacją OCRL.⁴

Ostatnie doświadczenia z alpelisibem u pacjentów pediatrycznych z zespołem PROS/CLOVES sugerują, że lek może być dobrze tolerowany. Alpelisib jest przyjmowany doustnie, selektywnie celuje w izoformę PI3K (kinaza fosfoinozytydu 3-)klasy I i wykazuje niewielki profil toksyczności w porównaniu z inhibitorami pan-PI3K. Ponieważ alpelisib nie blokuje całkowicie PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)aktywność, utrzymując w ten sposób funkcje szlaku sygnałowego, może być szczególnie odpowiedni do długotrwałego stosowania. Co ciekawe, hiperglikemia wynikająca ze stosowania alpelisibu może być kontrolowana przez zmiany w diecie.²²Ponieważ dysfunkcja PT jest pierwszym objawem choroby nerek obserwowanym u małych niemowląt z chorobą Dent 2 i zespołem Lowe'a, wczesne leczenie takiej dysfunkcji PT, prowadzące do poprawy profilu metabolicznego i wzrostu, może spowolnić progresję do przewlekłej choroby nerek, a zatem znaczący wpływ na długość i jakość życia.³³Chociaż objawy chorobowe mutacji OCRL są szczególnie szerokie, ostatnie badania oparte na dużych kohortach genotypowanych pacjentów z zespołem Lowe choroby Denta 2 nie wykazały znaczącego wpływu typu mutacji lub lokalizacji mutacji na przeżycie nerek.³⁴Podsumowując, nasze dane podkreślają potencjał zmiany zastosowania alpelisibu w leczeniu dysfunkcji PT w zespole Lowe/chorobie zębów 2, zapewniając w ten sposób podstawę do szybkiego i opłacalnego wdrożenia w badaniach klinicznych na ludziach.

3. METODY

3.1 Pełne szczegóły można znaleźć w metodach uzupełniających.

Komórki HK2 traktowano kopanlizybem, alpelisibem, GSK2636771 lub idelalizybem we wskazanych stężeniach przez 16 godzin, o ile nie podano inaczej. Białka wyekstrahowano standardowymi metodami z komórek lub tkanek nerki i przeprowadzono Western blot przy użyciu opublikowanych lub dostępnych w handlu przeciwciał. knockdown siRNA przeprowadzono stosując 2 transfekcje 72 i 24 godziny przed analizą. Użyliśmy OcrlY/þ dopasowanych do wieku i płci; Inpp5b^{- /-}; i Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/- mysie z miotu niosące ekspresję BAC-INPP5B. Pierwotne hodowle m PTC wytworzono z nerek pobranych od 8-tygodniowych myszy Ocrl, a pojemność endocytarną doustnych m PTC oceniano przez pomiar wychwytu albuminy. Traktowanie alpelisibem obejmowało 10 mM przez 16 godzin, o ile nie podano inaczej. Wychwyt albuminy w m PTC oceniano przy użyciu protokołu „pulse-chase”, aby ocenić wiązanie dowierzchołkowe i wynikowy wychwyt. m PTC barwiono przez noc odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym i przez 45 minut odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi skoniugowanymi z fluoroforem FL i/lub Alexa-488 falloidyną. Barwienie PI(3)P na m PTC przeprowadzono przy użyciu sondy domeny FYVE. Analizę obrazu przeprowadzono za pomocą CellProfifiler, używając niestandardowych rurociągów do pomiaru nakładania się aktyny/EEA1 i liczby punktów, oraz za pomocą ImageJ do pomiaru intensywności immunofluorescencji i wykrytych krawędzi w celu obliczenia wyniku włókien naprężeniowych. Dane ilościowe wyrażono jako średnie ± błąd standardowy średniej. W doświadczeniach in vivo myszy w wieku 6 tygodni leczono nośnikiem lub alpelisibem 50 mg/kg masy ciała. Mocz zbierano co 14 dni, a zwierzęta uśmiercano po 42 dniach leczenia, pobierając krew i nerki. Zdolność endocytarną PT myszy Oral zbadano przez pomiar wychwytu b-laktoglobuliny.

4. UJAWNIENIE

JLG ma fundusze od AstraZeneca na stypendium w jej laboratorium. SPJ zasiada w radach doradczych i jest właścicielem udziałów w Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics i Adrestia Therapeutics oraz jest partnerem naukowym w Ahren Innovation Capital. Wszyscy pozostali autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów.

5. PODZIĘKOWANIA

Praca ta była wspierana przez grant Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych 281971, Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, Wellcome Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/Z, Isaac Newton Trust Research Grant 18.23 (j) dla JLG i Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z dla SPJ oraz potwierdzamy finansowanie Instytutu Gurdona od Wellcome Trust (092096) i CRUK (C6946/A14492). Jesteśmy wdzięczni Fundacji Badań Cystinosis (Irvine, Kalifornia), Swiss National Science Foundation (grant na projekt 310030_189044), priorytetowemu programowi badań klinicznych (KFSP) RADIZ (Rare Disease Initiative Zurich) UZH, Szwajcarii

National Center of Competence in Research (NCCR) Kidney Control of Homeostasis (Kidney.CH) za wsparcie oraz NIDDK/NIH i Lowe Syndrome Trust/UK za wsparcie rozwoju myszy Oral. Dziękujemy Robertowi L. Nussbaumowi (Invitae Corporation i UCSF, San Francisco, Kalifornia) i Marii Antonietcie De Matteis (Instytut Genetyki i Medycyny Telethon, Uniwersytet Federico II w Neapolu, Neapol, Włochy) za dostarczenie założycieli kolonii myszy jamy ustnej;

oraz Eric Olinger (UZH, Zurych) za owocne dyskusje. Dziękujemy Nadine Näegele i Danieli Nieri za pomoc techniczną podczas zbierania i analizy moczu; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Paryż) za udostępnienie nam szczegółowego protokołu przygotowania Alpelisibu do leczenia in vivo; oraz Renata Kozyraki i Pierre Verroust za dostarczenie odczynników. Dziękujemy również Centrum Mikroskopii i Analizy Obrazu Uniwersytetu w Zurychu (Zurych, Szwajcaria) oraz placówce zintegrowanej fizjologii gryzoni (ZIRP) w Zurychu za dostarczenie sprzętu do pozyskiwania obrazów i wsparcia technicznego podczas eksperymentów in vivo.

W jaki sposób stosuje się alpelisib będący inhibitorem kinazy fosfoinozytydowej 3-w leczeniu zespołu Lowe/choroby Dent?

6. MATERIAŁY DODATKOWE

Plik uzupełniający (PDF)

Metody uzupełniające i odniesienia.

Tabela S1. Masa ciała, parametry moczu i krwi w czasie u myszy doustnych leczonych alpelisibem lub nośnikiem.

Rysunek S1. Testy ekspresji izoformy p110 i cytotoksyczności odpowiedzi na dawkę leku w komórkach HK2.

Rysunek 2. PI3Kinhibitor alpelisibprzywraca nakładanie się aktyno-endosomalne i zmniejsza poziomy PI(3)P w sposób zależny od dawki 4 godziny po podaniu leku w komórkach HK2.

Rysunek S3. Ekspresja izoformy p110 i toksyczność alpelisibu w mPTC Ocrl.

Rysunek S4. Przepływ pracy analizy nakładania się EEA1/aktyny w Ocrl mPTC.

Rysunek S5. Alpelisib przywraca wychwyt albumin w Ocrl^Y/-mPTC. Wyrażenie Aqp1 pozostaje niezmienione. Plik dodatkowy (filmy)

Film S1. Rendering Imaris 3D EEA1/aktyny nakłada się w OcrlY/þ mPTC traktowanych DMSO. Reprezentatywne renderowanie powierzchni 3D konfokalnego stosu OcrlY/þ mPTC potraktowanych DMSO przez 16 godzin, a następnie utrwalonych 4-procentowym fiksem formaldehydowym i znakowanych immunologicznie dla EEA1 (fioletowy), aktyny (falloidyna; żółty) i DAPI (niebieski), ilustrując niewiele asocjacja aktyna/endosom. Pręt=5 mm.

Film S2. Renderowanie Imaris 3D nakładania się EEA1/aktyny w Ocrl^Y/-mPTC traktowane DMSO. Reprezentatywne renderowanie powierzchni 3D konfokalnego stosu OcrlY/– mPTC potraktowanych DMSO przez 16 godzin, a następnie utrwalonych 4-procentowym utrwalaczem formaldehydowym i znakowanych immunologicznie dla EEA1 (fioletowy), aktyny (falloidyna; żółty) i DAPI (niebieski), ilustrując punktację asocjacja aktyny w pobliżu struktur endosomalnych. Pręt=5mm.

Film S3. Renderowanie Imaris 3D nakładania się EEA1/aktyny w Ocrl^Y/- mPTC leczone alpelisibem. Reprezentatywne renderowanie powierzchni 3D konfokalnego stosu OcrlY/– mPTC potraktowanych 10 mM alpelisibu przez 16 godzin, następnie utrwalonych 4-procentowym utrwalaczem formaldehydowym i znakowanych immunologicznie dla EEA1 (fioletowy), aktyny (falloidyna; żółty) i DAPI (niebieski) ilustrujący ratowanie struktur punktowych aktyny wokół endosomów. Pręt=5 mm.

BIBLIOGRAFIA

1. van der Wijst J, Belge H, Bindels RJM, Devuyst O. Fizjologia uczenia się z dziedzicznych zaburzeń nerek. Physiol Rev. 2019;99:1575-1653.

2. Zespół Loi M. Lowe. Orphanet J Rare Dis. 2006;1:16.

3. Lewis RA, Nussbaum RL, Brewer ED. Zespół Lowe'a. W: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA i in., wyd. GeneReviews® [internet]. Seattle (WA): Uniwersytet Waszyngtoński, Seattle; 1993-2020. Dostępne pod adresem: HTTPS://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/. Opublikowany 24 lipca 2001 r.; Zaktualizowano 18 kwietnia 2019 r. Dostęp 8 sierpnia 2019 r.

4. De Matteis MA, Staiano L, Emma F, Devuyst O. 5-fosfataza OCRL wZespół Lowe i choroba Denta2. Nat Rev Nefrol. 2017;13: 455–470.

5. Devuyst O, Luciani A. Transportery chlorków i endocytoza za pośrednictwem receptora w kanaliku proksymalnym nerki. J Fizjol. 2015;593:4151–4164.

6. Zhang X, Jefferson AB, Auethavekiat V, Majerus PW. Niedobór białka w zespole Lowe'a to fosfatydyloinozytol-4,5-fosfataza bisfosforanowa5-. Proc Natl Acad Sci US A. 1995;92:4853-4856.

7. Nández R, Balkin DM, Messa M i in. Rola OCRL w dynamice wgłębień pokrytych klatryną i odkryciu ujawniona w badaniach komórek zespołu Lowe'a. e-życie. 2014;3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. Komórkowe i fizjologiczne funkcje białka OCRL1 zespołu Lowe. Ruch drogowy. 2014;15:471–487.

9. De Leo MG, Staiano L, Vicinanza M, et al. Fuzja autofagosom-lizosom wyzwala odpowiedź lizosomalną za pośrednictwem TLR9 i kontrolowaną przez OCRL. Nat Biol. 2016;18:839–850.

10. Vicinanza M, Di Campli A, Polishchuk E, et al. OCRL kontroluje ruch przez wczesne endosomy poprzez zależną od PtdIns4,5P(2) regulację endosomalnej aktyny. EMBO J. 2011;30:4970-4985.

11. Festa BP, Borquez M, Gassama A i in. Niedobór OCRL upośledza funkcję endolizosomów w humanizowanym mysim modelu dlaZespół Lowe i choroba Denta. Hum Mol Genet. 2019;28:1931-1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, Ellson CD i in. P-Rex1, a PtdIns(3,4,5)P3- i regulowany przez Gbetagamma czynnik wymiany guanina-nukleotyd dla Rac. Komórka. 2002;108:809-821.

13. Galop JL, Walrant A, Cantley LC, Kirschner MW. Fosfoinozytydy i krzywizna błony przełączają tryb polimeryzacji aktyny poprzez selektywną rekrutację Toca-1 i Snx9. Proc Natl Acad Sci USA A. 2013;110:7193-7198.

14. Daste F, nakaz A, Holst MR i in. Kontrola polimeryzacji aktyny poprzez koincydencję fosfoinozytydów i dużej krzywizny błony. J Komórka Biol. 2017;216:3745–3765.

15. Malek M, Kielkowska A, Chessa T i in. PTEN reguluje sygnalizację PI(3,4)P2 poniżej klasy I PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-). Mol komórki. 2017;68:566–580.e510.

16. Gilooly DJ, Morrow IC, Lindsay M, et al. Lokalizacja fosfatydyloinozytolu 3-fosforanu w komórkach drożdży i ssaków. EMBO J. 2000;19:4577–4588.

17. Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD i in. PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)w chorobie człowieka. Komórka. 2017;170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Bull CO i in. BAY 80-6946 to wysoce selektywny dożylny PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)inhibitor o silnym działaniu p110alfa i p110delta w liniach komórek nowotworowych i modelach heteroprzeszczepów. Mol Raka Ther. 2013;12:2319–2330.

19. Fritsch C, Huang A, Chatenay-Rivauday C, et al. Charakterystyka powieści i specyficznego PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)inhibitor alfa NVP-BYL719 oraz opracowanie strategii stratyfikacji pacjentów do badań klinicznych. Mol Raka Ther. 2014;13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA i in. Odkrycie NVP-BYL719, silnego i selektywnego inhibitora kinazy fosfatydyloinozytolu-3, wybranego do oceny klinicznej. Bioorg Med Chem Lett. 2013;23:3741–3748.

21. Andre F, Ciruelos E, Rubovszky G, et al. Alpelisib w leczeniu zaawansowanego raka piersi z mutacją PIK3CA, z dodatnim receptorem hormonalnym. N Engl J Med. 2019;380:1929-1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH i in. Terapia celowana u pacjentów z zespołem przerostu PIK3CA. Natura. 2018;558:540–546.

23. Bothwell SP, Chan E, Bernardini IM i in. Mysi model dla zespołu Lowe/Dent Disease 2 tubulopatii nerkowej. J Am Soc Nefrol. 2011;22: 443-448.

24. Chen R, Kang VH, Chen J i in. Przeciwciało monoklonalne do wizualizacji PtdIns(3,4,5)P(3) w komórkach. J Histochem Cytochem. 2002;50:697-708.

25. Hammond GR, Schiavo G, Irvine RF. Techniki immunocytochemiczne ujawniają liczne, odrębne pule komórkowe PtdIns4P i PtdIns(4,5)P(2). Biochem J. 2009;422:23-35.

26. He K, Marsland R III, Upadhyayula S, et al. Dynamika konwersji fosfoinozytydu w ruchu endocytarnym za pośrednictwem klatryny. Natura. 2017;552:410–414.

27. Bilanges B, Słaba Y, Vanhaesebroeck B. PI3K(kinaza fosfoinozytydu 3-)izoformy w sygnalizacji komórkowej i handlu pęcherzykami. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:515-534.

28. Montjean R, Aoidi R, Desbois P, et al. Fibroblasty z mutacją OCRL od pacjentów z chorobą Dent-2 wykazują niezależną od INPP5B zmienność fenotypową w porównaniu z komórkami zespołu Lowe. Hum Mol Genet. 2015;24: 994–1006.

29. Suchy SF, Nussbaum RL. Niedobór PIP2 5-fosfatazy w zespole Lowe'a wpływa na polimeryzację aktyny. Am J Hum Genet. 2002;71:1420–1427.

30. Mizrachi A, Shamay Y, Shah J, et al. PI3K specyficzne dla nowotworu (kinaza fosfoinozytydu 3-)hamowanie poprzez dostarczanie ukierunkowane na nanocząsteczki w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi. Społeczność Nat. 2017;8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C, et al. PTEN redukuje endosomalne PtdIns(4,5)P2 w sposób niezależny od fosfatazy poprzez szlak PLC. J Komórka Biol. 2019;218:2198–2214.

32. Jean S, Kiger AA. Koordynacja regulacji i funkcji GTPazy RAB i fosfoinozytydu. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 13: 463-470. 33. Devuyst O, Knoers NV, Remuzzi G, et al. Rzadkie dziedziczne choroby nerek: wyzwania, możliwości i perspektywy. Lancet. 2014;383: 1844-1859. 34. Zanies M, Bokenkamp A, Kolb M i in. Długoterminowe wyniki leczenia nerek u dzieci z mutacjami OCRL: retrospektywna analiza dużej międzynarodowej kohorty. Przeszczep tarczy nefrolowej. 2018;33:85–94.

Od: Kidney International (2020) 98, 883–896; https://doi.org/10.1016/j.kint.2020.05.040

Copyright ª 2020, Międzynarodowe Towarzystwo Nefrologiczne. Opublikowane przez Elsevier Inc. Jest to artykuł z otwartym dostępem na licencji CC BY (HTTP://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Instytut, Uniwersytet Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QN, Wielka Brytania. E-mail: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; lub Olivier Devuyst, Instytut Fizjologii Uniwersytetu w Zurychu, Zurych, Szwajcaria. E-mail: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Autorzy ci w równym stopniu przyczynili się do powstania tej pracy.⁶Autorzy ci współkierowali badaniem. Otrzymano 8 sierpnia 2019 r.; zmienione 1 maja 2020 r.; zaakceptowano 15 maja 2020; opublikowano online 9 września 2020 r.