Analiza fitochemiczna, in-vitro antyproliferacyjna, antyoksydacyjna część 2

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

Test hamowania a-glukozydazy

Wykonano serię rozcieńczeń frakcji, aby uzyskać stężenia 100,200,300,400 i 500mg/ml. Mieszaniny reakcyjne zawierały 0,1 ml 1U/ml roztworu glukozydazy zmieszanego z 0,2 ml rozcieńczonego ekstraktu i 0,5 ml 100 mM buforu fosforanowego, pH 6,8. Mieszaniny inkubowano w 37°C przez 15 min. Następnie 0,2 ml 5 mM p-nitrofenylu-D-galaktopiranozydDo mieszaniny reakcyjnej dodano PNPG i inkubację przedłużono o kolejne 20 min w 37 stopniach. Reakcję zakończono przez dodanie 0,1 M NazCO3. Absorbancję rejestrowano przy długości fali 405 nm dla wszystkich próbek. Jako kontrolę pozytywną zastosowano akarbozę w takich samych stężeniach jak ekstrakty roślinne. Wyniki wyrażono jako procentowe hamowanie zgodnie z następującym równaniem:

gdzie Ag to absorbancja bez inhibitora enzymu, a As to absorbancja w obecności inhibitora enzymu [26].

Linie komórkowe i test MTS

Linie komórek rakowych HeLa i MCF7 uzyskano z ATCC, komórki hodowano w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10 procentem płodowej surowicy bydlęcej, 1 procentem antybiotyków penicyliny/streptomycyny i 1 procentem L-glutaminy. Komórki hodowano w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 stopni. Komórki wysiano w ilości 2,6 x 10* komórek/studzienkę na płytce 96-studzienkowej. Po 48h komórki zlewały się, pożywkę zmieniono. Komórki następnie inkubowano z różnymi stężeniami frakcji liści w zakresie od 0.25-10 mg/ml R. rothschildianus przez 24h. Oceniono żywotność komórek

za pomocą testu CellTilter 96-stopniowego wodnego testu proliferacji komórek w jednym roztworze (MTS) zgodnie z instrukcjami producenta (Promega Corporation, Madison, WI). W skrócie, pod koniec traktowania, do każdego dołka dodano 20 ul roztworu MTS na 100 ul pożywki i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 2 godziny. Absorbancje mierzono przy 490 nm [27,28].

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Analiza statystyczna

Wszystkie otrzymane wyniki czterech badanych frakcji roślinnych (przeciwutleniacz, antylipaza,antyamylaza, anty-glikozydaza, orazcytotoksycznośćaktywności) wyrażono jako średnią ± SD odchylenie standardowe; wynik uznawano za istotny, gdy wartość p wynosiła<0.05. data="" were="" compared="" using="" unpaired="">

Wyniki

Badanie fitochemiczne

Wyniki wstępnych badań fitochemicznych na wodnych frakcjach R. rothschildianus wykazały obecność saponin, fenoli, białka, skrobi i flawonoidów. Ekstrakt metanolowy wykazał obecność złożonych polisacharydów, fenoli, białka i flawonoidów, natomiast we frakcji acetonowej zaobserwowano fenole, garbniki i flawonoidy, a we frakcji heksanowej fenole, garbniki i flawonoidy, glikozydy, terpenoidy i steroidy jak pokazano w Tabeli 1. Jednak w procesie ekstrakcji najwyższą wydajność procentową wykazał metanol przy 29,4%, a następnie frakcja acetonu przy 16,5%. Ekstrakcja wodna dała 10,6%, podczas gdy najniższa wydajność (7,3%) była we frakcji heksanowej (tabela 2).

Analiza ilościowa TPC, TFC i TTC Do oceny TPC, TFC i TTC uzyskano wartości absorpcji (Abs) kilku stężeń kwasu galusowego, kwasu rutynowego i standardów katechin (STD) i w odniesieniu do tych punktów , uzyskano trzy równania dla każdego STD w zależności od jego stężeń w celu obliczenia całkowitej zawartości fenolu, flawonoidu i garbników w heksanie, acetonie, metanolu i wodnych frakcjach diagnostycznych R. Rothschilda przedstawiono w tabeli 3.

Cistanche może poprawić odporność

Aktywność antyoksydacyjna

Wyniki oceny aktywności wymiatania wolnych rodników czterech frakcji z liści R. rothschildianus, przy użyciu Troloxu jako silnego wzorca antyoksydacyjnego, wyrażono jako procentowe hamowanie DPPH (ryc. 1 i tabela 4). Dlatego liście R. rothschildianus można uznać za ziołowe źródło przeciwutleniaczy i frakcji acetonowej, która wykazała wartość IC50 6,3±0.4 ug/ml. Podobne wyniki uzyskano również dla frakcji heksanu, która miała wartość IC50 7,9 ± 1,3 ug/ml (Tabela 4). Wyniki porównano z Troloxem, silnym związkiem przeciwutleniającym, również równym 3,1±0,9 ug/ml. W przeciwieństwie do tego, frakcja wodna wykazywała jedynie umiarkowaną aktywność przeciwutleniającą, z wyższą wartością IC50 19,9±0,7 ug/ml, podczas gdy ekstrakt metanolowy był nieaktywny w tym teście.

Aktywność hamowania lipazy

W tym teście porównano działanie przeciw otyłości frakcji ekstraktu z liści R. rothschildianus z działaniem

orlistat, silny środek hamujący lipazę (ryc. 2 i tabela 4).R. Liście Rothschildianus były doskonałym alternatywnym naturalnym źródłem środków hamujących lipazę. Frakcja acetonowa wykazała wartość IC50 26,3±0,6 ug/ml, która była bardzo zbliżona do wartości związku referencyjnego orlistatu （12,3±0,3 ug/ml）. Frakcje heksanu i metanolu odnotowały jedynie umiarkowane wartości IC50, równe odpowiednio 39,8±0,3 ug/ml i 60,3±0,4 ug/ml; podczas gdy frakcja wodna była nieaktywna.

Aktywność hamująca a-amylazę

W tym teście, aktywność przeciwamylazy frakcji ekstraktu z liści R. rothschildianus była porównywana z aktywnością akarbozy, silnego środka hamującego a-amylazę (Fig. 3). Frakcja acetonowa była najsilniejszym inhibitorem -amylazy, z IC50 19,0±0,7 ug/ml, w porównaniu z 28,8±1,2 ug/ml dla akarbozy, związku odniesienia. Sugerowało to, że R. rothschildianus może być silnym ziołowym lekiem na cukrzycę. Frakcja wodna wykazywała w tym teście jedynie umiarkowaną aktywność z wartością IC50 45,7±0,3 ug/ml, podczas gdy heksan miał wartość IC50 354,8±1,2 ug/ml. Frakcja metanolowa była nieaktywna wobec enzymu -amylazy. również wartości obliczono dla czterech frakcji (Tabela 4).

Aktywność hamująca a-glukozydazę

Wyniki dla a-glukozydazy porównano z wynikami dla akarbozy, silnego środka hamującego enzymy, a także obliczono wartości dla czterech frakcji (Tabela 4 i Fig. 4). Frakcja acetonowa wywierała największe działanie hamujące na -glukozydazę z IC50 wynoszącym 54,9±0,3 ug/ml, w porównaniu z akarbozą, związkiem odniesienia, przy 37,1±{{10} } 0,3 µg/ml. W przeciwieństwie do tego, frakcja ekstraktu metanolowego wykazała jedynie umiarkowane hamowanie -glukozydazy, przy IC50 251,2 ± 0,4 ug/ml, podczas gdy frakcje heksanowe i wodne były nieaktywne w tym teście.

Aktywność antyproliferacyjna

Wyniki leczenia komórek rakowych HeLa i MCF7 pięcioma różnymi stężeniami w mg/ml dla różnych ekstraktów wykazały, że aktywność wobec linii komórek rakowych HeLa była lepsza niż wobec linii komórek rakowych MCF7. Najsilniejszy był jednak ekstrakt heksanowy

ekstrakt w stężeniu 4 mg/ml z procentem hamowania odpowiednio 98,9 i 97,4 przeciwko liniom komórek rakowych HeLa i MCF7, podczas gdy ekstrakt metanolowy o tym samym stężeniu wykazywał silną aktywność przeciwko liniom komórkowym raka HeLa i MCF7 z 97,2 i 95,6% procentem hamowania. Udokumentowano procentowe hamowanie komórek HeLa po ekspozycji na frakcje z liści R. rothschildianus w porównaniu z kontrolą pozytywną doksorubicyną (Fig. 5a). Procentowe hamowanie komórek MCF7 określono podobnie dla czterech frakcji z liści R. rothschildianus, w porównaniu z kontrolą (Fig. 5b).

Dyskusja

Test zmiatania rodników DPPH jest dobrze znany jako prosta metoda wykrywania zdolności antyoksydacyjnych związków. DPPH jest stabilnym wolnym rodnikiem, który w roztworach alkoholowych nadaje purpurowy kolor, a po redukcji w obecności antyoksydantów będących donorami wodoru zmienia kolor na bezbarwny [29]. Dlatego liście R. rothschildianus można uznać za naturalne źródło antyoksydantów, zwłaszcza dla frakcji acetonowej, która wykazała wartość IC50 na poziomie 6,3±0.4ug/ml. Podobne wyniki uzyskano również dla frakcji heksanowej, która miała wartość IC50 7,9±1,3 ug/ml (Tabela 4). Wyniki porównano z Troloxem, silnym związkiem przeciwutleniającym, również równym 3,1±0,9 ug/ml. Natomiast frakcja wodna wykazywała jedynie umiarkowaną aktywność przeciwutleniającą, z wyższą wartością IC50 19,9±0,7 ug/ml, podczas gdy ekstrakt metanolowy był w tym teście nieaktywny. Wyniki te były zgodne z obecnością fenoli i flawonoidów w roślinie, silnego źródła wymiataczy wolnych rodników, jak pokazano w tym badaniu z DPPH. Wyniki te były zgodne z różnorodnością związków fenolowych w roślinach, prostych fenoli, takich jak kwas galusowy, i bardziej wyrafinowanych kwasów fenolowych, takich jak antocyjany, pochodne kwasu hydroksycynamonowego i flawonoidy. Wszystkim tym klasom związków poświęcono wiele uwagi ze względu na ich liczne funkcje fizjologiczne, zwłaszcza zmiatania wolnych rodników, działania przeciwmutagenne, przeciwzapalne i przeciwrakotwórcze [30]. Jak podano w tabeli 3, ekstrakt acetonowy odnotował najwyższą zawartość zarówno związków fenolowych, jak i flawonoidów, odpowiednio 28,2±0,8 mg GAE/g i 107,3±4,6 mg RU/g. W poprzednim raporcie dotyczącym niektórych gatunków Rumex znaleziono związki fenolowe w ekstrakcie etanolowym z liści Rumex vicarious L., które prawdopodobnie brały udział w reakcjach wolnorodnikowych, redukując stabilny używany rodnik DPPH do żółtawo zabarwionej pochodnej difenylopikrylohydrazyny z jej oryginalnego fioletu kolor [31].

R. rothschildianus leaves were an excellent alternative natural source of lipase inhibitory agents. The acetone fraction showed an ICso value of 26.3±0.6μg/ml, which was very close to that of the reference compound orlistat （12.3±0.3μg/ml）. Hexane and methanol fractions only re-corded moderate ICso values, equal to 39.8±0.3 μg/ml and 60.3±0.4μg/ml, respectively; while the aqueous fraction was inactive. Pancreatic lipase is a major enzyme involved in enterocyte triglyceride absorption. Therefore, its inhibition represents an important strategy in the management of obesity [32]. Plants rich in phenolic compounds have been screened in several reports for anti-lipase activity. Lipase inhibitory activity ranging from 40 to >70 procent stwierdzono w badaniach in vitro w wielu różnych rodzinach, w tym Solanaceae (Solanum tuberosum), Brassicaceae (Brassica nigra i Raphanus sativus), Rosaceae (Malus Domestica Borkh. i Filipendula ulmaria (L.) Maxim.),

(Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. i Ericaceae Vaccinium myrtillus L.) oraz Fabaceae (Pisum sativum L. i Phaseolus vulgaris L.)[33].

Frakcja acetonowa była najsilniejszym inhibitorem -amylazy, z IC50 19,0±0,7 ug/ml, w porównaniu z 28,8±1,2 ug/ml dla akarbozy, związku odniesienia. Sugerowało to, że R. rothschildianus może być silnym ziołowym lekiem na cukrzycę. Frakcja wodna wykazywała w tym teście jedynie umiarkowaną aktywność z wartością IC50 45,7±0,3 ug/ml, podczas gdy heksan miał wartość IC50 354,8±1,2 ug/ml. Frakcja metanolowa była nieaktywna wobec -amylazy. Możliwym wyjaśnieniem, że frakcja wodna jest dobrym inhibitorem enzymów, była obecność saponin. Wcześniejsze badania naukowe wykazały, że saponiny są bioaktywne przeciwko cukrzycy [34]. Silny wpływ frakcji ekstraktu acetonowego na amylazę może wynikać z wysokiej zawartości zarówno związków fenolowych, jak i flawonoidów. Eksperci Corchorus olitorius -działanie amylazy i -glukozydazy przez składniki, zwłaszcza związki fenolowe, takie jak kwas kawowy [35].

Frakcja acetonowa wywierała największe działanie hamujące na a-glukozydazę z IC50 wynoszącym 54,9±0,3 ug/ml, w porównaniu z akarbozą, związkiem odniesienia, przy 37,1±0,3 ug/ml . W przeciwieństwie do tego, frakcja ekstraktu metanolowego wykazywała jedynie umiarkowane hamowanie α-glukozydazy, z IC50 wynoszącym 251,2±0,4 ug/ml, podczas gdy frakcje heksanowe i wodne były nieaktywne w tym teście. Trzecia kategoria doustnych środków hipoglikemizujących obejmuje -inhibitory glukozydazy. Istnieje wiele różnych inhibitorów glukozydazy, takich jak akarboza i wogliboza, które zwykle znajdują się w źródłach roślinnych. Wykazują cenną stabilizację poziomu glukozy we krwi po posiłku i znalazły zastosowanie kliniczne w leczeniu cukrzycy [36, 37].

Wyniki leczenia obu komórek rakowych (HeLa i MCF7) różnymi stężeniami w mg/ml dla różnych ekstraktów wykazały, że ogólna aktywność wobec linii komórek rakowych HeLa była lepsza niż linii komórek rakowych MCF7. Ekstrakt heksanowy wykazywał silną aktywność przeciwnowotworową w stężeniu 4 mg/ml z procentami hamowania wynoszącymi 98,9 i 97,4 procent odpowiednio przeciwko nowotworowym liniom komórkowym HeLa i MCF7, podczas gdy ekstrakt metanolowy w tym samym stężeniu wykazywał silną aktywność przeciwko nowotworowym liniom komórek HeLa i MCF7 z 97,2 i 95,6% procent hamowania. Z poprzednich wyników wynika, że ​​frakcja heksanowa wywierała znaczący wpływ cytotoksyczny zarówno na komórki HeLa, jak i MCF7, z procentami hamowania sięgającymi odpowiednio 99 i 92,4 procent przy stężeniu frakcji heksanowej 4 mg/ml. Było to zgodne z cytotoksycznymi efektami zarówno terpenoidów, jak i steroidów, które stwierdzono we frakcji heksanowej. Wykazano, że diosgenina, naturalnie występujący steroid i triterpenoid występujący w niektórych roślinach, hamuje raka piersi [38, 39].

Wniosek

Wyniki tego badania na liściach R. rothschildianus wskazują, że frakcja ekstraktu acetonowego ma znaczący potencjał w dostarczaniu fitoterapii cukrzycy i otyłości, w oparciu o silne hamowanie lipazy, a-amylazy i a-glukozydazy. Ponadto frakcja acetonowa również wykazywała znaczną aktywność zmiatania wolnych rodników. Z drugiej strony frakcja heksanowa wykazała znaczne zahamowanie zarówno linii komórkowych HeLa, jak i MCF7, co może być związane z wysoką zawartością terpenów i sterydów. Te obserwacje w tym badaniu mogą prowadzić do dalszych badań in vivo w celu opracowania nowych naturalnych preparatów farmaceutycznych skutecznych w leczeniu otyłości, cukrzycy i niektórych nowotworów.

Ten artykuł pochodzi z Jaradat et al. BMC Medycyna komplementarna i terapie (2021) 21:07