Hamowanie płytek krwi zapobiega aktywacji inflamasomu NLRP3 i uszkodzeniom nerek wywołanym przez posocznicę

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Marivee Borges-Rodriguez, et al

Abstrakcyjny:

Płytki krwi, komórkowe mediatory zakrzepicy, są aktywowane podczas sepsy i są coraz częściej uznawane za mediatory odpowiedzi immunologicznej. Aktywacja płytek krwi jest znacznie zwiększona u pacjentów z sepsą w porównaniu z pacjentami z grupy kontrolnej OIOM. Pomimo tej korelacji, rola aktywowanych płytek krwi w przyczynianiu się do patofizjologii sepsy pozostaje niejasna. Wcześniej wykazaliśmy aktywację inflamasomu białka receptorowego 3 typu NOD (NLRP3) w płytkach krwi indukowanych sepsą szczurów CLP. Aktywowane płytki krwi były związane ze zwiększonym obrzękiem płuc i uszkodzeniem kłębuszków nerkowych w grupie kontrolnej CLP w porównaniu z grupą kontrolną SHAM. W tym badaniu zbadaliśmy, czy hamowanie aktywacji płytek krwi osłabi aktywację NLRP3 oraz uszkodzenie nerek i płuc w odpowiedzi na CLP. CLP przeprowadzono na samcach i samicach szczurów Sprague Dawley (SD) (n=10/grupę) w celu wywołania sepsy brzusznej, a szczury SHAM służyły jako kontrole. Podgrupę zwierząt CLP leczono klopidogrelem (10 mg/kg/dzień, CLP plus CLOP) w celu zahamowania aktywacji płytek. W 72 h po CLP oceniono aktywację płytek krwi i zespół inflamasomu NLRP3, zmierzono IL-1 i IL-18 w osoczu oraz oceniono patologię tkanek, nerek i płuc oraz czynność nerek. Aktywowane płytki krwi wynosiły 7,8 ± 3,6 procent w przypadku pozorowanej terapii, 22 ± 6 procent w przypadku CLP i znacznie spadły do ​​14,5 ± 0,6 procent w przypadku CLP plus CLOP (n=8–10/grupę, p < 0,05)="" .="" składanie="" się="" inflamasomu="" nlrp3="" było="" hamowane="" w="" płytkach="" krwi="" zwierząt="" clp="" plus="" clop="" w="" porównaniu="" z="" clp.="" znaczący="" wzrost="" stężenia="" il="" w="" osoczu="" i="" nerkach-1="" i="" il-18="" w="" odpowiedzi="" na="" clp="" był="" zmniejszony="" podczas="" leczenia="" klopidogrelem.="" uszkodzenie="" nerek,="" ale="" nie="" histologia="" płuc="" lub="" czynność="" nerek="" uległy="" poprawie="" w="" przypadku="" clp="" plus="" clop="" w="" porównaniu="" z="" clp.="" dane="" te="" dostarczają="" dowodów="" na="" to,="" że="" aktywowane="" płytki="" krwi="" mogą="" przyczyniać="" się="" do="" uszkodzenia="" nerek="" wywołanego="" sepsą,="" prawdopodobnie="" poprzez="" aktywację="" nlrp3="" w="" płytkach="" krwi.="" płytki="" krwi="" mogą="" być="" celem="" terapeutycznym="" zmniejszenia="" uszkodzenia="" nerek="" u="" pacjentów="" z="">

Słowa kluczowe:posocznica; NLRP3; płytki krwi; klopidogrel; uszkodzenie wielonarządowe; aktywacja śródbłonka;zapalenie

ekstrakt z cistanche tubolosa : przeciwzapalny

1. Wstęp

Sepsa jest zagrażającą życiu rozregulowaną reakcją zapalną gospodarza na czynnik zakaźny [1] i jedną z głównych przyczyn zgonów na świecie. Co najmniej 1,7 miliona dorosłych w Ameryce zapada na sepsę, a prawie 270,000 Amerykanów umiera w wyniku sepsy rocznie [2]. Sepsa prowadzi do dysfunkcji wielonarządowej, w tym ostrego uszkodzenia płuc (ALI) [3],ostrynerkauraz(AKI) [4,5], między innymi dysfunkcja hematologiczna i ośrodkowego układu nerwowego. Coraz większa liczba narządów zaangażowanych w sepsę wiąże się ze zwiększoną śmiertelnością [6]. Obecne metody leczenia koncentrują się na opiece wspierającej; jednak śmiertelność pozostaje wysoka. Doniesiono, że około 35 do 50 procent zgonów wewnątrzszpitalnych jest spowodowanych sepsą [7]. Niezwykle ważne jest zidentyfikowanie celu terapeutycznego, który może poprawić śmiertelność z powodu sepsy.

Uważa się, że płytki krwi odgrywają rolę w odporności [8,9], oprócz ich roli w hemostazie i zakrzepicy. Trombocytopenia jest często obserwowana w posocznicy i uważa się, że występuje z powodu aktywacji i zużycia płytek krwi; jednak jego rola w procesie chorobowym pozostaje niejasna. Małopłytkowość jest związana z rozwojem (niewydolność wielonarządową) MOF i zwiększoną 90-dniową śmiertelnością [10–14]. Płytki krwi mogą być integralną częścią odpowiedzi zapalnej na sepsę. Potencjalnym mechanizmem, za pomocą którego płytki krwi mogą przyczyniać się do uszkodzenia wielonarządowego, jest aktywacja inflammasomu białka 3 receptora podobnego do NOD (NLRP3). NLRP3 jest cytozolowym receptorem sygnalizacji immunologicznej, który prowadzi do cięcia za pośrednictwem kaspazy-1 i aktywacji IL-1B i IL-18 i jest zaangażowany w patogenezę procesów zapalnych, takich jak astma [15 ], choroba Parkinsona [16], nieswoiste zapalenie jelit [17] i posocznica [18]. Wykazano, że hamowanie tworzenia inflamasomów NLRP3 chroni przed uszkodzeniem narządów wywołanym sepsą [19–23]. Wcześniej wykazaliśmy, że inflamasom NLRP3 jest aktywowany w płytkach krwi w odpowiedzi na podwiązanie kątnicy (CLP) i jest związany z uszkodzeniem wielonarządowym w odpowiedzi na posocznicę wielobakteryjną w 72-godzinnym modelu szczurzym CLP. W niniejszym badaniu postawiliśmy hipotezę, że blokowanie aktywacji płytek za pomocą Clopidogrel (CLOP) zmniejszyłoby aktywację inflamasomu NLRP3, uszkodzenie nerek i płuc w odpowiedzi na posocznicę wielobakteryjną.

flawonoidy cistanche: przeciwzapalne

2. Wyniki

2.1. Aktywacja płytki i montaż infllammasomu NLRP3

Za pomocą cytometrii przepływowej określiliśmy procent aktywacji płytek krwi wśród grup. Odkryliśmy, że aktywacja płytek była zwiększona u szczurów CLP o 22 ± 6 procent w porównaniu z SHAM 7,8 ± 3,6 procent (p < 0.{{10}}5)="" i="" osłabiona="" w="" clp="" plus="" szczury="" clop="" o="" 14,5="" ±="" 0,6="" procent="" (p="">< 0,05,="" rysunek="" 1).="" składanie="" inflamasomów="" nlrp3="" w="" płytkach="" krwi="" oceniano="" przez="" wizualizację="" kolokalizacji="" nlrp3="" z="" białkiem="" podobnym="" do="" apoptozy="" (asc)="" przy="" użyciu="" immunocytochemii="" (figura="" 2).="" współlokalizacja="" składników="" inflamasomu="" w="" płytkach="" clp="" była="" 83="" razy="" większa="" w="" porównaniu="" z="" płytkami="" pozorowanymi="" (ryc.="" 2c).="" ponadto,="" gromadzenie="" się="" inflamasomu="" było="" zmniejszone="" w="" płytkach="" krwi="" clp="" plus="" clop="" w="" porównaniu="" z="">

2.2. Cytokiny związane z inflamasomem

Aktywacja NLRP3 powoduje uwolnienie prozapalnych cytokin IL-1 i IL-18 do ich aktywnych form. Zmierzyliśmy obie cytokiny w osoczu,płuco, oraznerkahomogenatySHAM, CLP i CLP plus CLOP za pomocą testu ELISA. Poziom IL w osoczu {{0}} znacząco wzrósł z 9 ± 21 pg/ml w leczeniu pozorowanym do 77 ± 31 pg/ml w CLP (p < {{1{17}}}}.0="" 5,="" rysunek="" 3a).="" podawanie="" klopidogrelu="" wykazało="" zmniejszenie="" stężenia="" il="" w="" osoczu-1="" 48="" ±="" 38="" pg/ml;="" jednak="" spadek="" ten="" nie="" był="" statystycznie="" istotny="" w="" porównaniu="" z="" clp="" (p="">< 0.05="" w="" porównaniu="" z="" metodą="" pozorowaną).="" podobnie,="" poziom="" il="" w="" nerkach="" -1="" był="" podwyższony="" w="" clp="" 4="" ±="" 3="" pg/mg,="" w="" porównaniu="" z="" leczeniem="" pozorowanym="" 2,5="" ±="" 0,9="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" ryc.="" 3b).="" leczenie="" klopidogrelem="" znacząco="" zmniejszyło="" il="" w="" nerkach-1="" do="" 1,8="" ±="" 0,8="" pg/mg="" (p="">< 0,05).="" w="" płucach,="" il-1="" była="" istotnie="" zwiększona="" z="" 70="" ±="" 16="" pg/mg="" w="" sham="" do="" 106="" ±="" 36="" pg/mg="" w="" clp="" (p="">< 0,05)="" i="" nie="" różniła="" się="" istotnie="" u="" zwierząt="" leczonych="" clopidogrelem="" (80="" ±="" 23="" pg="" g,="" figura="">

Plazma IL{{0}} nie była wykrywalna u szczurów SHAM; jednak średnia IL w osoczu-18 wynosiła 26 ± 6 pg/ml w CLP. Co ważne, podawanie klopidogrelu skutkowało niższymi poziomami IL w osoczu-18 (12 ± 9 pg/ml; p < 0.="" {{20}}5,="" rycina="" 3d).="" podobnie="" poziom="" il="" w="" nerkach="" {{10}}="" był="" podwyższony="" w="" clp="" (396="" ±="" 65="" pg/mg)="" w="" porównaniu="" z="" leczeniem="" pozorowanym="" (317="" ±="" 73="" pg/mg;="" p="">< 0,05).="" leczenie="" klopidogrelem="" zmniejszyło="" il="" w="" nerkach-18="" do="" 214="" ±="" 70="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" rycina="" 3e).="" w="" płucach,="" il-18="" była="" znacząco="" zwiększona="" z="" 704="" ±="" 219="" pg/mg="" w="" sham="" do="" 999="" ±="" 158="" pg/mg="" w="" clp="" (p="">< 0,05)="" i="" pozostała="" podwyższona="" u="" zwierząt="" leczonych="" clopidogrelem="" 1014="" ±="" 235="" pg/mg="" (="" p="">< 0,05="" w="" stosunku="" do="" pozorowanej,="" ryc.="">

2.3. Aktywacja śródbłonka

Zmierzyliśmy poziomy angiopoetyny {{0}} i endokanu w osoczu jako markerów aktywacji śródbłonka w grupach Sham, CLP i CLP plus CLOP za pomocą testu ELISA. Poziom endokanu osocza uległ znacznemu zwiększeniu z 1234 ± 327 pg/ml w leczeniu pozorowanym do 1978 ± 306 pg/ml w przypadku CLP (p < {{20}}0,05="" w="" porównaniu="" z="" leczeniem="" pozorowanym).="" endokan="" był="" znacząco="" obniżony="" do="" 1521="" ±="" 283="" pg/ml="" u="" szczurów="" clp="" leczonych="" clopidogrelem="" (p="">< 0,05="" w="" porównaniu="" z="" clp,="" figura="" 4a).="" podobne="" wyniki="" uzyskano="" dla="" angiopoetyny-2.="" angiopoetyna-2="" była="" znacząco="" zwiększona="" z="" 5603="" ±="" 2142="" pg/ml="" w="" leczeniu="" pozorowanym="" do="" 56="" 767="" ±="" 40,000="" pg/ml="" w="" przypadku="" clp="" (p="">< 0,05="" w="" porównaniu="" z="" leczeniem="" pozorowanym)="" i="" była="" istotnie="" obniżona="" u="" szczurów="" leczonych="" clopidogrelem="" do="" 22="" 486="" ±="" 13="" 616="" pg/ml="" (p="">< 0,05="" w="" porównaniu="" z="" clp,="" rysunek="">

2.4. Uraz płuc

Analiza histologiczna płuc z każdej grupy wykazała znaczny wzrost nacieku neutrofili ze średnim wynikiem {{0}},6 ± 0,2 u szczurów CLP w porównaniu z wynikiem {{6} }.10 ± {{10}}.10 u szczurów pozorowanych (p < 0.05).="" zaobserwowaliśmy="" również,="" że="" podawanie="" klopidogrelu="" szczurom="" clp="" nie="" zmieniało="" infiltracji="" neutrofili="" (wynik="" 0,5="" ±="" 0,4,="" figura="" 5a).="" podobne="" wyniki="" uzyskano="" w="" grubości="" ściany="" wyrostka="" zębodołowego="" ze="" znacznym="" wzrostem="" clp="" przy="" średniej="" grubości="" 1,2="" ±="" 0,1="" µm="" w="" porównaniu="" z="" 0,8="" ±="" 0,3="" µm="" u="" szczurów="" sham="" (p="">< 0,05).="" podawanie="" klopidogrelu="" szczurom="" clp="" nie="" poprawiło="" grubości="" ścian="" pęcherzyków="" (figura="">

2.5. Uraz nerek

Jak wcześniej publikowaliśmy, GFR znacznie spadł z 2,1 ± 0,8 ml/min/100 g, ale u szczurów pozorowanych do {{10}} 0,7 ± 0,2 ml/min/100 g, ale u szczurów CLP (p < 0,05).="" podawanie="" klopidogrelu="" wykazało="" poprawę="" gfr="" do="" 1,3="" ±="" 0,5="" ml/min/100="" g,="" ale="" w="" porównaniu="" z="" clp,="" jednak="" nieistotną="" statystycznie="" (ryc.="" 6a).="" analiza="" histologiczna="" wykazała="" zwiększone="" uszkodzenie="" kłębuszków="" w="" grupie="" clp="" w="" porównaniu="" z="" sham.="" leczenie="" klopidogrelem="" znacząco="" poprawiło="" uszkodzenie="" kłębuszków="" u="" zwierząt="" clp="" (figura="">

korzyści zdrowotne cistanche: lepsze funkcjonowanie nerek

3. Dyskusja

Sepsa to rozregulowana odpowiedź immunologiczna na czynnik zakaźny, często związana z niewydolnością wielonarządową i charakteryzująca się wysoką śmiertelnością. Istnieje potrzeba identyfikacji nowej terapii, która może modulować odpowiedź zapalną i zmniejszać śmiertelność. Postuluje się, że płytki krwi odgrywają rolę w immunomodulacji. Oczywiście głównym przedmiotem badań była kaskada krzepnięcia i aktywacja płytek krwi. Podawanie białka C, endogennego enzymu przeciwzakrzepowego, wiąże się z poprawą przeżycia u pacjentów z ciężką sepsą [24]. W Japonii wytyczne dotyczące sepsy obejmują zastosowanie czasowego podawania antytrombiny u pacjentów z posocznicą z DIC i wykazały poprawę wyników [25]. Sugeruje to, że hamowanie aktywacji płytek krwi może poprawić wyniki leczenia posocznicy. Reakcja zapalna podczas sepsy jest zdecydowanie złożona i może obejmować więcej niż jeden szlak. Wcześniej opublikowaliśmy, że płytki krwi z modelu sepsy wielodrobnoustrojowej CLP zwiększyły składanie/aktywację płytek NLRP3 i były związane z uszkodzeniem płuc i nerek [26]. W tym badaniu postanowiliśmy określić rolę hamowania płytek krwi w odpowiedzi zapalnej w tym samym modelu przy użyciu inhibitora P2Y12, Clopidogrel.

Jak wcześniej opublikowano, aktywacja płytek krwi była zwiększona w odpowiedzi na posocznicę wielodrobnoustrojową w modelu CLP w porównaniu ze szczurami Sham. Odkryliśmy, że podawanie klopidogrelu zmniejszało aktywację płytek krwi u szczurów CLP i, co ciekawe, obserwowano również zmniejszenie gromadzenia się inflamasomu NLRP3 w płytkach krwi. Stwierdziliśmy również tendencję do zmniejszania krążących IL-1B i IL-18 w osoczu zwierząt leczonych klopidogrelem w porównaniu z grupą CLP. We wcześniej opublikowanym badaniu pisaliśmy, że bezpośrednie hamowanie inflamasomu NLRP3 za pomocą MCC950 powodowało zmniejszenie IL-1B i IL-18 w osoczu [27]. Sugeruje to, że hamowanie aktywacji płytek krwi przez Clopidogrel i zmniejszenie cytokin zapalnych w tym modelu sepsy są częściowo pośredniczone przez mechanizmy NLRP3. Dlatego konieczne są dalsze badania, aby wyraźniej zdefiniować szlaki zapalne, w których pośredniczy NLRP3 w płytkach krwi.

Multi-organ failure (MOF) occurs frequently in sepsis. Previously published studies reported that in mice, the CLP model caused significant pulmonary damage; and depletion of platelets reduced CLP-induced edema and neutrophil recruitment in the bronchoalveolar space by >60 proc. [28]. Wcześniej publikowaliśmy, że zwiększona aktywacja płytek krwi była związana z dysfunkcją i uszkodzeniem wielu narządów w modelu szczurzym CLP [26]. Nasze dane pokazują znaczny spadek IL-1 i IL-18 w okresienerkizwierząt leczonych klopidogrelem. Połączenie ostrej niewydolności nerek i sepsy wiąże się z 70-procentową śmiertelnością, w porównaniu z 45-procentową śmiertelnością wśród pacjentów z samą ostrą niewydolnością nerek [29]. Współczynnik filtracji kłębuszkowej (GFR) jest wskaźnikiemnerkafunkcjonowaći zmniejsza się wraz ze zwiększonym uszkodzeniem nerek. Leczenie klopidogrelem poprawiło uszkodzenie nerek u szczurów CLP, co sugeruje, że aktywacja płytek krwi może odgrywać rolę w rozwoju AKI wywołanego sepsą.

Korzyści z ekstraktu z cistanche: poprawia pracę nerek

Zgodnie z jego rolą w wywoływaniu MOF, rozwój ALI i zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) jest powszechny u pacjentów z sepsą i często powoduje konieczność wentylacji mechanicznej w tej populacji pacjentów. Dowody sugerują, że aktywacja płytek krwi odgrywa ważną rolę w rozwoju MOF u pacjentów z sepsą [8,30]. Wcześniejsze badania potwierdziły to, wykazując zmniejszoną infiltrację neutrofili w płucach myszy septycznych wywołanych przez CLP po deplecji płytek krwi [28]. Ponadto Liverani i in. donieśli, że myszy wcześniej leczone klopidogrelem były oporne na ALI wywołane sepsą [31]. Jednak obecne badanie nie było w stanie wykazać żadnych znaczących dowodów na zmniejszenie IL- 1, naciekania neutrofili lub grubości ścian pęcherzyków płucnych. Może to wynikać z wykorzystania różnych gatunków zwierząt, dawki klopidogrelu i innych różnic w projekcie eksperymentu.

Wyciek włośniczkowy jest istotną cechą sepsy. Wiadomo, że białka, takie jak angiopoetyna naczyniowa -2, sprzyjają zapaleniu, dysfunkcji śródbłonka i są związane ze zwiększoną śmiertelnością szpitalną u pacjentów z sepsą [32]. Endokan jest kolejnym markerem dysfunkcji komórek śródbłonka i jest związany z ciężkością choroby i wynikami pacjentów z sepsą [33]. Odkryliśmy również, że te markery aktywacji i dysfunkcji śródbłonka były podwyższone w modelu CLP i zmniejszone w grupie leczonej klopidogrelem. Podobnie zaobserwowano niewielki, ale nieistotny wzrost GFR w grupie leczonej klopidogrelem. Sugeruje to, że aktywacja płytek krwi ma pewien wpływ modulujący na odpowiedź zapalną na sepsę.

W tym badaniu zahamowanie aktywacji płytek nie przełożyło się na znaczącą poprawę funkcji narządów. Możliwe, że wybrana dawka 10 mg/kg/dobę była wystarczająca do osłabienia aktywacji płytek krwi, aktywacji NLRP3, cytokin i markerów aktywacji śródbłonka, ale nie przełożyła się na złagodzenie uszkodzenia płuc lub poprawę funkcji nerek. Liverani i in. wcześniej stosowali dawkę początkową 30/mg/kg/dzień u myszy typu dzikiego i myszy z nokautem P2Y12, co przełożyło się na zahamowanie uszkodzenia płuc wywołanego sepsą [31]. W tym samym badaniu klopidogrel podawano przed wywołaniem sepsy. Ta zasadnicza różnica może wyjaśniać brak znaczącej poprawy czynności płuc lub nerek obserwowanej w naszym badaniu.

Chociaż obecne badanie sugeruje rolę aktywacji płytek krwi w przyczynianiu się do stanu zapalnego i aktywacji śródbłonka w odpowiedzi na sepsę, istnieją ograniczenia, na które należy zwrócić uwagę. Po pierwsze, chociaż zmierzono markery aktywacji śródbłonka, uzasadnione są dodatkowe eksperymenty w celu oceny funkcji śródbłonka. Ponadto udział innych czynników płytkopochodnych nie był kontrolowany w tym badaniu. W związku z tym wciąż pozostają pytania dotyczące wpływu płytek krwi na patologię wywołaną sepsą i niewydolność narządową.

Rola klopidogrelu w zmniejszaniu śmiertelności w posocznicy budzi kontrowersje w związku z doniesieniami o zmniejszeniu częstości występowania ARDS i wentylacji mechanicznej, ale bez zmniejszenia śmiertelności [34]. Konieczne są dalsze badania, aby określić dokładny mechanizm, za pomocą którego płytki krwi przyczyniają się do uszkodzenia i dysfunkcji narządów w posocznicy. Badanie to wspiera dalszą eksplorację płytek krwi jako celu terapeutycznego u pacjentów z posocznicą.

korzyści zdrowotne cistanche tubolosa: poprawiają czynność nerek

4. Materiały i metody

4.1. Zwierząt

Wykorzystano samice i samce szczurów Sprague Dawley zakupione od Envigo (Indianapolis, IN, USA). Wszystkie procedury doświadczalne przeprowadzone w tym badaniu były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami. Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee w University of Mississippi Medical Center. Opieka i postępowanie ze zwierzętami były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi etycznego traktowania zwierząt.

4.2. Podwiązanie i nakłucie kątnicy

Wszystkie nasze eksperymenty in vivo przeprowadzono na 12- do 13-tygodniowych samcach i samicach szczurów o wadze około 225–325 g. Zwierzęta podzielono losowo na dwie grupy: grupę operacji pozorowanej (SHAM, n=10) i grupę nakłucia podwiązania kątnicy (CLP, n=10). W znieczuleniu izofluranem przeprowadzono operację CLP na podgrupie szczurów w celu wywołania posocznicy wielodrobnoustrojowej jamy brzusznej, jak już wcześniej opisaliśmy [26, 27]. Podgrzaną solankę (20 ml/kg, 37°C) wstrzykiwano podskórnie natychmiast po operacji w celu resuscytacji. Zwierzęta operowane pozornie przeszły ten sam zabieg chirurgiczny bez podwiązania lub nakłucia kątnicy. Po operacji szczury umieszczono z powrotem w swoich klatkach i zapewniono im jedzenie i wodę ad libitum. W 24 h po CLP poprzednie nacięcie zostało ponownie otwarte i martwicze jelito ślepe zostało starannie wycięte. Jamę brzuszną przepłukano 10 ml ciepłego sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Nacięcie brzuszne ponownie zamknięto warstwami. Zwierzętom podawano codziennie antybiotyk o szerokim spektrum działania (Naxcel 5 mg/kg), a znieczulenie osiągnięto buprenorfiną SR (1,2 mg/kg) przez 72-godzinny okres doświadczalny. Agregację płytek krwi blokowano przez codzienne podawanie klopidogrelu (10 mg/kg/dzień) przez 3 dni podgrupie szczurów CLP (CLP plus CLOP; n=12) przez zgłębnik przełykowy przez 3 dni. Pod koniec protokołu zwierzęta uśmiercono w głębokim znieczuleniu. Do dalszej analizy pobrano krew i tkanki.

4.3. Izolacja płytek krwi

Krew tętniczą pobrano do probówek próżniowych z kwasem cytrynianowo-dekstrozowym i odwirowano przy 200 x g przez 20 min w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego. Osocze bogatopłytkowe (PRP) zmieszano z równą objętością buforu HEP (140 mmol/l NaCl, 2,7 mmol/l KCI, 3,8 mmol/l HEPES, 5 mmol/l EGTA, pH 7,4) zawierającym 1 uM PGE1. Tę mieszaninę następnie wirowano przy 100 x g przez 20 min, aby osadzić pozostałe RBC i WBC, w których do zliczenia płytek użyto 40 µl supernatantu. Następnie PRP wirowano przy 800 x g przez 20 min, supernatant odrzucono, a osad ponownie zawieszono w buforze Tyrode'a (134 mmol/L NaCl, 12 mmol/L NaHCO3, 2,9 mmol/L KCl, 0,34 mmol/L Na2HPO4,1 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L HEPES) zawierający 5 mmol/L glukozy i 3 mg/mL BSA.

4.4. Cytometrii przepływowej

Świeżo wyizolowane płytki krwi (106) ponownie zawieszono w 50 µl buforu Tyrode'a. Płytki krwi inkubowano (RT przez 30 min) z anty-mysim CD41 sprzężonym z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (Clone MWReg30, BioLegend, San Diego, CA, USA) i sprzężonym z allofikocyjaniną (APC) anty-mysim/szczurzem CD62P (Clone RMP{ {9}}, Biolegenda). Co najmniej 10 000 zdarzeń na bramkę uzyskano przy użyciu MACsQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) i przeanalizowano przy użyciu oprogramowania FlowLogic (Innovation, Sydney, Australia). Płytki krwi wyróżniały się swoistym wiązaniem anty-CD41 oraz charakterystycznym rozpraszaniem do przodu i na boki. Płytki krwi dające pozytywne wyniki dla CD41 i CD62P oznaczono aktywowanymi płytkami krwi.

4.5. Mikroskopia konfokalna i świetlna

Płytki krwi (107) od szczurów pozorowanych lub szczurów CLP lub stymulowanych z LPS lub bez LPS pozostawiono do przylegania do szkiełek permanox (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Przylegające komórki utrwalano w 10% formalinie przez 30 min, przemywano 3x PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej i permeabilizowano lodowatym 100% metanolem przez 10 min. Szkiełka blokowano w PBS z 10% kozią i króliczą surowicą przez 1 godzinę, płukano i inkubowano z króliczym przeciwciałem anty-NLRP3 (NBP2-12446, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Szkiełka następnie płukano i inkubowano z antykróliczym Alexa Fluor 488 (A11070, Thermo FisherScientifific) przez 1 hw RT. Szkiełka ponownie przemyto i inkubowano ze sprzężonym z Alexa Fluor647- króliczym przeciwciałem anty-ASC (NBP1-78977AF647, Novus Biologicals) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Kontrole przetwarzano identycznie, z wyjątkiem pominięcia przeciwciał pierwszorzędowych. Preparaty umieszczono w Cytoseal 60 (Thermo Fisher Scientific) i analizowano na konfokalnym mikroskopie skaningowym Nikon C1 (Nikon Inc., Melville, NY, USA). Obrazy rejestrowano przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse 55i wyposażonego w kolorową kamerę Nikon-Fi1 (Nikon) i analizowano przy użyciu oprogramowania NIS-Elements D 3.0.

4.6. Ilościowa ocena biomarkerów aktywacji śródbłonka i cytokin

Poziomy angiopoetyny-2 (MANG20, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) i Endocan-1 (MBS039900, MyBioSource, San Diego, CA, USA) zmierzono w osoczu jako markery dysfunkcji śródbłonka metodą ELISA zgodnie z zgodnie z protokołem producenta. Osocze,nerkai płucna IL-1 (RLB00, R&D Systems) i IL-18 (ab213909, Abcam, Boston, MA, USA) oznaczono ilościowo za pomocą ELISA zgodnie z protokołem producenta.Nerkia lizaty płucne przygotowano za pomocą zestawu BioPlex Cell Lysis Kit (171304011, BioRad, Hercules, CA, USA) zgodnie z protokołem producenta.

4.7. Ocena urazu płuc

Histological evaluation was performed on the lungs via hematoxylin and eosin (H&E)staining. A lung lobe was formalin-fixed. The tissue was subsequently paraffin-embedded and 5-µm sections were stained with (H&E). Sections were evaluated for neutrophil infiltration into the alveolar space. Five sections were scored in a blinded fashion on a scale of0–2 with 0 representing o neutrophils in the alveolar space, 1 representing 1–5 neutrophils in the alveolar space, and 2 representing >5 neutrofili w przestrzeni pęcherzykowej. Obrazy rejestrowano przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse 55i wyposażonego w kolorową kamerę Nikon DS-Fi1 (Nikon Inc.) przy 40X przy użyciu oprogramowania NIS-Elements D 3.0. Grubość ścianki wyrostka zębodołowego mierzono za pomocą oprogramowania NIS-Elements D 3.0. Dane znormalizowano do wartości pozorowanych.

4.8. Ocena uszkodzenia kłębuszków nerkowych

Nerkiwere collected, weighed, and fixed in a 10% buffered formalin solution. Paraffin sections (3 µm) were prepared and stained with Periodic acid-Schiff to assess the degree of glomerular injury on approximately 30 images per section, per rat. Thirtyglomeruli per section were scored in a blinded fashion on a 0–4 scale with 0 representing a normal glomerulus, 1 representing a 25% loss, 2 representing a 50% loss, 3 representing a 75% loss, and 4 representing >75 procent utraty naczyń włosowatych w kępce. Obrazy zostały zrobione przy użyciu tego samego mikroskopu, kamery i oprogramowania, jak wspomniano wcześniej.

4.9. Pomiar czynności nerek

Podczas zabiegu CLP do żyły szyjnej wprowadzano cewnik i wyprowadzano go podskórnie z tyłu szyi. Cewnik był codziennie przepłukiwany heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej do końca trzydniowego protokołu. W ostatnim dniu protokołu szczury poddano krótkiemu znieczuleniu izofluranem w celu złożenia urządzenia NIC-Kidney (MediBeacon; Mannheim, Niemcy) złożonego z dwóch diod elektroluminescencyjnych, które wzbudzają sinistrynę FITC przy 480 nm, fotodiodę emitującą światło przy długości fali 480 nm. 531 nm, mikroprocesor i bateria. To urządzenie przymocowano do grzbietu szczura za pomocą dwustronnego plastra przylepnego (MediBeacon) i przymocowano kurtką dla gryzoni do wygolonego obszaru na grzbiecie szczura. Szczurom pozwolono wyzdrowieć w oddzielnych klatkach przez 15 minut i zarejestrowano pomiar podstawowy. Po pomiarach podstawowych podano bolus FITC-sinistryny (5 mg/100 g masy ciała; FTC-FS001, MediBeacon) przez żyłę szyjną, a następnie bolus sterylnej soli fizjologicznej. W ciągu dwóch godzin po wstrzyknięciu bolusa kinetykę wydalania FITC-sinistryny mierzono przezskórnie i wykorzystano do obliczenia okresu półtrwania w fazie eliminacji (t1/2) FITC-sinistryny przy użyciu modelu jednoprzedziałowego z oprogramowaniem do oceny MDPLab (MediBeacon), aby obliczyć GFR na podstawie zwalidowanego empirycznie uzyskanego współczynnika konwersji [35,36].

przegląd cistanche: poprawia czynność nerek

4.10. Analiza statystyczna

Analiza mocy określa, że ​​n z 10-12 zwierząt/grupę osiągnęłoby moc (1- ) 0.80 i prawdopodobieństwo błędu Typu 1 ( ) 0,05 w celu wykrycia co najmniej 5–10 procentowej różnicy w aktywacji płytek między szczurami poddanymi działaniu pozorowanej i CLP. Wszystkie dane wyrażono jako średnią ± SD. Wszystkie dane sprawdzono pod kątem zgodności z rozkładem Gaussa za pomocą testu normalności D'Agostino-Pearsona. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya jako analizę post hoc. Za istotną statystycznie uznano wartość p <>

Autorskie Wkłady:

Konceptualizacja, CAS, JMW i DCC; metodologia, JMW i D.CC; walidacja, OKT, JMW i DCC; analiza formalna, MB-R., CAS, OKT, JMW i D.CC; dochodzenie, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW i DCC; zasoby, JMW i DCC; przechowywanie danych, MB-R., CAS i DCC; pisanie — przygotowanie oryginalnego projektu, MB-R. i CAS; pisanie – recenzja i edycja, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW i DCC; wizualizacja, MB-R., CAS, JMW i DCC; nadzór, OKT i DCC; administracja projektu, DCC; pozyskanie finansowania, DCC Wszyscy autorzy przeczytali i zaakceptowali opublikowaną wersję manuskryptu.

Finansowanie:

Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez National Institute Of GeneralMedical Sciences National Institutes of Health pod numerem nagrody P20GM104357 i P30GM103328. Badanie to zostało sfinansowane przez National Heart Lung and Blood Institute of the National Institutes of Health w ramach nagród o numerach F31HL149257 (OKT), R00HL130456 (DCC) i R01HL151407 (DCC) oraz National Institute of Diabetes and Digestive orazNerkaChorobyNational Institutes of Health pod numerem R01DK109133 (JMW) Za treść odpowiadają wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health.

Oświadczenie instytucjonalnej komisji rewizyjnej:

Wszystkie procedury doświadczalne przeprowadzone w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami. Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee przy University of Mississippi Medical Center (Protokół 1487A, zatwierdzony 07.02.2019). Opieka i postępowanie ze zwierzętami były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi etycznego traktowania zwierząt.

Oświadczenie o dostępności danych:

Wszystkie dane na poparcie zgłoszonych wyników są przedstawione w rękopisie i są swobodnie dostępne.

Konflikt interesów:

Autorzy nie wyrażają konfliktu interesów.

Bibliografia

1. Greco, E.; Lupia E.; Bosko, O.; Vizio, B.; Montrucchio, G. Płytki krwi i niewydolność wielonarządowa w posocznicy. wewn. J. Mol. Nauka. 2017, 18, 2200.
2. Rhee, C.; Dantes, R.; Epstein, L.; Murphy, DJ; Seymour, CW; Iwaszyna, TJ; Kadri, SS; Angusa, DC; Danner, RL; Fiore, AE; i in. Częstość występowania i trendy sepsy w szpitalach w USA z wykorzystaniem danych klinicznych i danych dotyczących roszczeń, 2009–2014. JAMA 2017, 318, 1241–1249.
3. Kim, WY; Posocznica Hong, SB i zespół ostrej niewydolności oddechowej: ostatnia aktualizacja. Tuberc. Oddech. Dis. (Seul) 2016, 79, 53–57.
4. Alobaidi, R.; Basu, RK; Goldstein, SL; Bagshaw, SM Ostre uszkodzenie nerek związane z sepsą. Nasienie. Nefrol. 2015, 35, 2–11.
5. Umbro, I.; Goj, G.; Tinti, F.; Muresan, P.; Mitterhofer, AP Ostatnie postępy w patofizjologii i biomarkerach ostrego uszkodzenia nerek wywołanego sepsą. J. Zainfekować. 2016, 72, 131–142.
6. Bilevicius, E.; Dragosavac, D.; Dragosavac, S.; Araujo, S.; Falcao, AL; Terzi, RG Niewydolność wielonarządowa u pacjentów z posocznicą. Braz. J. Zainfekować. Dis. 2001, 5, 103-110.
7. Liu, W.; Escobar, GJ; Greene, JD; Soule, J.; Whippy, A.; Angusa, DC; Iwashyna, TJ Zgony szpitalne u pacjentów z sepsą z 2 niezależnych kohort. JAMA 2014, 312, 90–92.
8. Katz, JN; Kolappa, KP; Becker, RC Beyond zakrzepica: Wszechstronna płytka krwi w krytycznej chorobie. Skrzynia 2011, 139, 658-668.
9. Smith, SS; McEvera, RP; Weyrich, AS; Morrella, CN; Hoffman, MR; Arepally, GM; francuski, PA; Dauerman, HL; Beckera, RC; Platelet Colloquium, P. Funkcje płytek krwi poza hemostazą. J. Tromb. Hemost. 2009, 7, 1759-1766.
10. de Stoppelaar, SF; van 't Veer, C.; van der Poll, T. Rola płytek krwi w posocznicy. Zakrzep. Hemost. 2014, 112, 666-677.
11. Nawaz, M.; Dickfeld, T.; Bogner, C.; Fateh-Moghadam, S.; Neumann, FJ Funkcja płytek krwi w zespołach septycznej dysfunkcji wielonarządowej. Intensywna Terapia Med. 1997, 23, 379-385.
12. Layios, N.; Delierneux, C.; Hego, A.; Huart, J.; Gosset, C.; Wykład, C.; Maes, N.; Geurts, P.; Joly, A.; Lancelotti, P.; i in. Przewidywanie sepsy u pacjentów w stanie krytycznym na podstawie markerów aktywacji płytek krwi przy przyjęciu na OIT: prospektywne badanie pilotażowe. Intensywna Terapia Med. Do potęgi. 2017, 5, 32.
13. Russwurm, S.; Vickers, J.; Meier-Hellmann, A.; Spangenberg, P.; Bredle, D.; Reinhart, K.; Losche, W. Aktywacja płytek krwi i leukocytów koreluje z nasileniem dysfunkcji narządu septycznego. Wstrząs 2002, 17, 263-268.
14. Vanderschueren, S.; De Weerdt, A.; Malbrain, M.; Vankersschaever, D.; Frans E.; Wilmer, A.; Bobbaers, H. Trombocytopenia i rokowanie w intensywnej terapii. Kryt. Opieka Med. 2000, 28, 1871-1876.
15. Teofanis, E.; Semitekolou, M.; Morianos, I.; Sanitas, K.; Xanthou, G. Celowanie w aktywację inflamasomu NLRP3 w ciężkiej astmie. J. Clin. Med. 2019, 8, 1615.
16. Haque, ME; Akther, M.; Jakaria, M.; Kim, IS; Azam, S.; Choi, DK Celowanie w inflammasom mikrogleju NLRP3 i jego rola w chorobie Parkinsona. MOV. Niepokój. 2020, 35, 20-33.
17. Liu, L.; Dong, Y.; Tak, M.; Jin, S.; Yang, J.; Joosse, ja; Słońce, Y.; Zhang, J.; Łazariew, M.; Brant, SR; i in. Patogenna rola aktywacji inflamasomu NLRP3 w nieswoistych zapaleniach jelit u myszy i ludzi. Zapalenie jelita grubego J. Crohna 2017, 11, 737–750.
18. Danielski, LG; Giustina, AD; Bonfante S.; Barichello, T.; Petronilho, F. Inflammasom NLRP3 i jego rola w rozwoju sepsy. Zapalenie 2020, 43, 24-31.
19. Luo, YP; Jiang, L.; Kang, K.; Fei, DS; Meng, XL; Nan, CC; Pan, SH; Zhao, MR; Zhao, MY Hemin hamuje aktywację inflamasomu NLRP3 w ostrym uszkodzeniu płuc wywołanym sepsą, z udziałem oksygenazy hemowej-1. wewn. Immunofarmakol. 2014, 20, 24-32.

20. Księżyc, JS; Lee, S.; Park, MA; Siempos, II; Haslip, M.; Lee, PJ; Yun, M.; Kim, CK; Howrylak, J.; Ryter, SW; i in. Syntaza kwasów tłuszczowych indukowana przez UCP2- sprzyja aktywacji inflamasomu NLRP3 podczas sepsy. J. Clin. Dochodzenie. 2015, 125, 665-680.

[PubMed]21. Gong, Z.; Zhou, J.; Li, H.; Gao, Y.; Xu, C.; Zhao, S.; Chen, Y.; Cai, W.; Wu, J. Curcumin hamuje aktywację inflamasomu NLRP3 i chroni przed wstrząsem septycznym wywołanym przez LPS. Mol. Nutr. Żywność Res. 2015, 59, 2132–2142.
22. Wang, P.; Huang, J.; Li, Y.; Chang, R.; Wu, H.; Lin, J.; Huang, Z. Egzogenny tlenek węgla zmniejsza ostre uszkodzenie nerek wywołane sepsą i hamuje aktywację inflamasomu NLRP3 u szczurów. wewn. J. Mol. Nauka. 2015, 16, 20595-20608.
23. Kalbitz, M.; Fattahi, F.; Przyczepa, JJ; Jajou, L.; Malan, EA; Kamień, FS; Huber-Lang, M.; Russell, MW; Ward, PA Dopełniacz wywołał aktywację inflamasomu sercowego NLRP3 w posocznicy. FASEB J. 2016, 30, 3997–4006.
24. Bernard, GR; Vincenta, JL; Laterre, PF; LaRosa, SP; Dhainaut, JF; Lopez- Rodriguez, A.; Steingrub, JS; Garber, GE; Helterbrand, JD; Ely, EW; i in. oraz rekombinowane ludzkie białko CWEiSSsg. Skuteczność i bezpieczeństwo rekombinowanego ludzkiego aktywowanego białka C w przypadku ciężkiej sepsy. N. Engl. J. Med. 2001, 344, 699-709.
25. Iba, T.; Thachil, J. Teraźniejszość i przyszłość terapii przeciwzakrzepowej z zastosowaniem antytrombiny i trombomoduliny w przypadku rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego związanego z sepsą: perspektywa z Japonii. wewn. J. Hematol. 2016, 103, 253–261.
26. Korneliusz, DC; Baik, CH; Travis, OK; biały, DL; Młody CM; Austin Pierce, W.; Tarcze, CA; Poudel, B.; Williams, JM NLRP3 aktywacja inflammasomu w płytkach krwi w odpowiedzi na sepsę. Fizjol. Rep. 2019, 7, e14073.
27. Korneliusz, DC; Travis, OK; Tramel, RW; Borges-Rodriguez, M.; Baik, CH; Greer, M.; Giachelli, Kalifornia; Tardo, GA; Williams, JM NLRP3 hamowanie inflamasomu osłabia aktywację płytek krwi wywołaną sepsą i zapobiega uszkodzeniom wielonarządowym podczas nakłucia przez podwiązanie kątnicy. PLoS ONE 2020, 15, e0234039.
28. Asaduzzaman, M.; Lavasani, S.; Rahman, M.; Zhang S.; Braun, OO; Jeppsson, B.; Thorlacius, H. Płytki krwi wspierają rekrutację neutrofili w płucach w posocznicy brzusznej. Kryt. Opieka Med. 2009, 37, 1389–1396.
29. Schrier, RW; Wang, W. Ostra niewydolność nerek i posocznica. N. Engl. J. Med. 2004, 351, 159-169.
30. Vincent, JL; Yagushi, A.; Pradier, O. Funkcja płytek krwi w posocznicy. Kryt. Opieka Med. 2002, 30, S313–S317.
31. Liverani, E.; Rico, MC; Cygankow, AY; Kilpatrick, LE; Kunapuli, SP P2Y12 Receptor moduluje zapalenie wywołane sepsą. Art.. Zakrzep. Vasc. Biol. 2016, 36, 961-971. [Odn.]
32. Siner, JM; Bhandari, V.; angielski, KM; Eliasz, JA; Siegel, MD Podwyższony poziom angiopoetyny 2 w surowicy wiąże się ze wzrostem
śmiertelność w sepsie. Szok 2009, 31, 348-353.
33. Scherpereel, A.; Depontieu, F.; Grigoriu B.; Cavestri, B.; Tsicopoulos, A.; poganin, T.; Jourdain, M.; Pugin, J.; Tonnela, AB; Lassalle, P. Endocan, nowy marker śródbłonka w ludzkiej posocznicy. Opieka krytyczna Med. 2006, 34, 532-537.
34. Valerio-Rojas, JC; Jaffer, IJ; Kor, DJ; Gajić, O.; Cartin-Ceba, R. Wyniki pacjentów z ciężką sepsą i wstrząsem septycznym podczas przewlekłego leczenia przeciwpłytkowego: Historyczne badanie kohortowe. Kryt. Pielęgnacja Res. Ćwicz. 2013, 2013, 782573.
35. Pigułka, J.; Isajewa O.; Zastanawiający S.; Sadick, M.; Kranzlin B.; Fiedler F.; Klotzer, HM; Kramer, U.; Gretz, N. Profil farmakologiczny i toksyczność sinistrin znakowanej fluoresceiną, nowego markera do pomiarów GFR. Łuk Naunyn-Schmiedeberga. Pharmacol. 2006, 373, 204–211.
36. Pigułka, J.; Kraenzlin, B.; Jander, J.; Sattelkau, T.; Sadick, M.; Kloetzer, HM; Deus, C.; Kraemer, U.; Gretz, sinistrin N. Fluorescein jako marker szybkości filtracji kłębuszkowej. Eur. J. Med. Chem. 2005, 40, 1056-1061.