Preparatywna izolacja i oczyszczanie czterech związków z Cistanches Deserticola YC Ma metodą szybkiej chromatografii przeciwprądowej

1. Wstęp

Cistanches DeserticolaYC Ma, gatunekCistanczektóra należy doOrobanchaceaerodziny, jest dobrze znaną tradycyjną medycyną chińską stosowaną w leczeniu niewydolności nerek, niepłodności u kobiet, chorobliwego upławy, neurapraksji i zaparć starczych [1]. Jest to roślina pasożytnicza szeroko rozpowszechniona w północno-zachodnich Chinach. Do tej pory kilka związków, m.inglikozydy fenyloetanoidowe (PhG), irydoidy i lignany zostały wyizolowane z tego gatunku [2]. Donoszono, że niektóre PhG mają działanie przeciwutleniające, hepatoprotekcyjne i neuroprotekcyjne [3–6]. Jednakże procedura izolacji i oczyszczania PhG jest trudna i czasochłonna. Co więcej, klasyczne metody wielokrotnej chromatografii nie tylko wykorzystują dużą ilość rozpuszczalników organicznych, ale także zapewniają niższy odzysk próbki. Szybka chromatografia przeciwprądowa (HSCCC), beznośnikowa technika chromatografii z podziałem ciecz-ciecz, zapewnia doskonały odzysk próbek w porównaniu z niektórymi konwencjonalnymi metodami i jest szeroko stosowana do rozdzielania i oczyszczania różnych produktów naturalnych [7–9] . Chociaż kilka PhG zostało oczyszczonych zCistanczerodzaju i inne według HSCCC [10–14], w żadnej pracy nie opisano oczyszczania akteozydu, izoakteozydu, syringalidu A 3'- -L-ramnopiranozyd i 2'-acetylokteozyd w jednym układzie dwufazowym.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

W tym artykule opisujemy prostą metodę separacji i oczyszczania czterech PhG z C. Deserticola. Ostatecznie w jednoetapowym rozdzielaniu otrzymano 30,9 mg akteozydu, 13,0 mg izoakteozydu, 12,5 mg syringalidu A 3'- -L-rhamnopiranozydu i 7,2 mg 2'-acetyloakteozydu z 297 mg frakcji o czystości odpowiednio 99%, 95%, 99% i 98%. Ich struktury scharakteryzowano na podstawie danych widmowych 1H i 13C-NMR oraz widm HR-MS. Struktury czterech PhG zidentyfikowanych w tym badaniu pokazano na rysunku 1.

2. Wyniki i dyskusja

2.1. Analiza HPLC surowego ekstraktu

Wzbogaconą w skład frakcję ekstraktu n-butanolu z C. desericola analizowano metodą HPLC-UV. Zastosowaną kolumną była Accurasil C18 (250 mm x 4,6 mm, średnica wewnętrzna 5 µm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, miasto, skrót stanowy, USA), fazą ruchomą była metanol-woda (30:70, v/v). Szybkość przepływu wynosiła 1 ml/min. Długość fali detektora ustawiono na 254 nm. Chromatogram HPLC pokazano na Figurze 2. Piki 1 do 4 odpowiadają odpowiednio akteozydowi (1), izoakteozydowi (2), syringalidowi A 3'- -L-rhamnopiranozydowi (3) i 2'-acetyloakteozydowi (4). .

2.2. Wybór dwufazowego układu rozpuszczalników

Pomyślne rozdzielenie metodą HSCCC w dużej mierze zależy od wyboru odpowiedniego dwufazowego układu rozpuszczalników. Dwufazowy układ rozpuszczalników wybrano zgodnie z wartościami współczynnika podziału (K) każdego docelowego składnika, a optymalny zakres K powinien wynosić od {{ 2}}.5 do 2.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY ODPORNOŚCI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

W eksperymencie wartości K dla docelowych składników kilku dwufazowych układów rozpuszczalników pokazano w Tabeli 1 (chociaż nieco wyższe dla piku 4, wyniki okazały się akceptowalne). Wśród nich octan etylu – n-butanol – etanol – woda (40:6:6:50, v/v/v/v) dał odpowiednie współczynniki podziału dla docelowych związków. Ostatecznie układ rozpuszczalników składający się z octanu etylu – n-butanolu – etanolu i wody (40:6:6:50, v/v/v/v) zastosowano do wyizolowania i oczyszczenia czterech związków C. desericola, jak pokazano na Rycina 3. Jak pokazano na Rycinie 2, analiza HPLC każdej frakcji HSCCC ujawniła, że ​​cztery czyste PhG (akteozyd, 99%; izoakteozyd, 95%; syringalid A 3′- -L-rhamnopiranozyd 99% i 2′- Z frakcji surowej można było otrzymać acetylokteozyd 98%.

3. Eksperymentalne

3.1. Aparatura HSCCC

sprzętem zastosowanym w niniejszym badaniu był szybki system chromatografii przeciwprądowej TBE{{0}}B (Shanghai Tauto Biotech Co., Szanghaj, Chiny) z trzema preparatywnymi wielowarstwowymi kolumnami do separacji cewek połączonymi szeregowo (średnica probówki=2,6 mm, całkowita objętość=300 mL) i pętla na próbkę o pojemności 2{{10}} mL. Promień obrotu, czyli odległość osi uchwytu od osi środkowej wirówki (R), wynosił 5 cm, a wartość wahała się od 0,5 na końcówce wewnętrznej do 0,8 na końcówce zewnętrznej (= r/R, gdzie r jest odległością od cewki do wału uchwytu). Do kontrolowania temperatury w eksperymencie zastosowano urządzenie z cyrkulacją w stałej temperaturze HX 105 (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Pekin, Chiny). System HSCCC został wyposażony w średniociśnieniową pompę o stałym przepływie model TBP-5002, detektor UV model TBP-2000 pracujący przy 254 nm oraz stację roboczą model V4.0 (Jinda Bio-chemistry Instrument Company, Szanghaj, Chiny).

Zastosowanym sprzętem do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) był system Agilent 1200, który składa się z pompy binarnej G1312A, autosamplera G1329A, detektora o zmiennej długości fali (VWD) G1314A, termostatowanego przedziału kolumny G1316A, odgazowywacza G1379B i stacji roboczej Agilent LC . Do wykrywania czystości zastosowano alltech 3300 ELSD. Do identyfikacji strukturalnej związków wykorzystano spektrometry Agilent 6520 Q-TOF i Bruker AVANCE III 500-NMR. Widma 1H i 13C-NMR (odpowiednio przy 500 i 125 MHz) mierzono w temperaturze pokojowej (22 stopnie/295,1 K).

3.2. Odczynniki i materiały

Octan etylu, n-butanol i etanol miały czystość analityczną, a metanol miał czystość HPLC. Wszystkie rozpuszczalniki zakupiono od Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, Chiny). Do wszystkich roztworów i rozcieńczeń stosowano wodę Milli-Q (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA). Kłącze C. desericola zostało zebrane w prowincji Mongolia Wewnętrzna w Chińskiej Republice Ludowej w czerwcu 2009 roku. Roślina została zidentyfikowana przez prof. Lijuana Zhanga, a okaz (nr 20091001) został zdeponowany w naszym laboratorium.

3.3. Przygotowanie próbki surowej

Sproszkowane, suszone na powietrzu mięsiste łodygi C. desericola (1 kg) ogrzewano dwukrotnie w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną z wodnym roztworem etanolu (8 l, 60% v/v) za każdym razem przez 2 godziny. Ekstrakt odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i w temperaturze 60 stopni aż do całkowitego odparowania etanolu. Pozostałość zawieszono w wodzie i ekstrahowano kolejno trzykrotnie chloroformem, octanem etylu i n-butanolem, otrzymując po odparowaniu do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem 5,16 g ekstraktu n-butanolu. Ekstrakt n-butanowy następnie rozdzielono na kolumnie z żelem krzemionkowym (200–300 mesh) stosując elucję z progresywnym gradientem (CHCl3–MeOH, 10:1 → 1:1) i otrzymano osiem frakcji. Frakcję 6 (297 mg) zastosowano do dalszej izolacji i rozdziału HSCCC.

NATURALNE CISTANCHE TUBULOSA TRADYCYJNE LEKI CHIŃSKIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. Dobór układów dwufazowo-rozpuszczalnikowych

Dwufazowe układy rozpuszczalników dobrano na podstawie współczynnika podziału (K) docelowych składników we frakcji C. Deserticola. Wartości K oznaczono metodą analizy LC w następujący sposób: Odpowiednią ilość surowego ekstraktu w proszku (frakcja 6) rozpuszczono w dolnej fazie układu rozpuszczalników i analizowano metodą HPLC. Obszary pików zarejestrowano jako A1. Następnie do roztworu dodano równą objętość górnej fazy i dokładnie wymieszano do osiągnięcia równowagi podziału. Następnie dolną fazę ponownie analizowano metodą HPLC. Te ostatnie obszary pików zarejestrowano jako A2. Wartości K obliczono według następującego równania: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Przygotowanie układu dwufazowego rozpuszczalnika i roztworu próbki

W niniejszym badaniu do rozdziału HSCCC zastosowano dwufazowy układ rozpuszczalników składający się z octanu etylu – n-butanolu – etanolu – wody (40:6:6:50, v/v/v/v). Każdy rozpuszczalnik dodano do rozdzielacza i dokładnie zrównoważono w temperaturze pokojowej. Fazę górną i fazę dolną oddzielono i odgazowano przez sonikację przez 30 minut na krótko przed użyciem. Roztwór próbki przygotowano rozpuszczając 297 mg frakcji 6 w 15 ml dolnej fazy octan etylu – n-butanol – etanol – woda (40:6:6:50, v/v/v/v).

3.6. Procedura separacji HSCCC

HSCCC przeprowadzono w następujący sposób. Wielowarstwową kolumnę zwojową napełniono najpierw górną organiczną fazą stacjonarną. Następnie dolną wodną fazę ruchomą pompowano do szczytu kolumny z szybkością przepływu 1,5 ml/min i jednocześnie urządzenie HSCCC pracowało z prędkością obrotową 900 obr./min. Po ustaleniu się równowagi hydrodynamicznej, na co wskazuje klarowna faza ruchoma eluująca z wylotu końcowego (około dwie godziny później), przez zawór wtryskowy wstrzyknięto 15 ml roztworu próbki zawierającego 297 mg surowego ekstraktu (frakcja 6). Wyciek z kolumny monitorowano w sposób ciągły pod 254 nm. Zebrano cztery frakcje pikowe zgodnie z chromatogramem, a następnie odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Temperaturę aparatu ustawiono na 25 stopni.

3.7. Analiza HPLC i identyfikacja frakcji szczytowych HSCCC

Frakcje pikowe z HSCCC analizowano metodą HPLC-ELSD. Zastosowaną kolumną była Accurasil C18 (250 mm x 4,6 mm, średnica wewnętrzna 5 µm), a fazą ruchomą była metanol-woda (30:70, v/v). Szybkość przepływu wynosiła 1 ml/min. ELSD pracował w następujących warunkach: temperatura 45 stopni, gaz 1,6 l/min. Identyfikację strukturalną czterech frakcji pików HSCCC przeprowadzono za pomocą spektroskopii HR-ESI-MS, 1H i 13C-NMR.

3.8. Identyfikacja strukturalna

Frakcja I: HR-ESI-MS obserwowana przy m/z 623,2001 (M-H)−, obliczona dla C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 ramnozy), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukozy), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34 }} ramnozy), 6,27 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,1 (6H, aromatyczny H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,6 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf{{89 }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf-), 114,8 (Caf- ), 148,1 (Caf- ), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4 ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha-6). W porównaniu z danymi z literatury [17] frakcja I odpowiadała akteozydowi.

Frakcja II: HR-ESI-MS obserwowana przy m/z 623,1987 (M-H)−, obliczona dla C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,25 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 ramnozy), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukozy), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 ramnozy), 6,28 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatyczny H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,7 (C-), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89 }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf-), 115,0 (Caf- ), 147,3 (Caf- ), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). Dane widmowe 1H-NMR i 13C-NMR były zgodne z danymi dla izoakteozydu, jak podano w literaturze [18].

Frakcja III: HR-ESI-MS obserwowana przy m/z 6{{1{129}}8}}7,2032 (M−H)−, obliczona dla C29H35O14, 607,2032. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 ramnozy), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukozy), 5,19 (1H, d, J=1,5 Hz, H{ {35}} ramnozy), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6–7,1 (7H, aromatyczny H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C-), 36,4 (C-), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88 }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf-), 115,4 (Caf- ), 148,0 (Caf- ), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). Według literatury [18] frakcja III odpowiadała 3'- -L-rhamnopiranozydowi syringalidu A.

Frakcja IV: HR-ESI-MS obserwowana przy m/z 665,21{{20}} (M−H)−, obliczono dla C31H37O16, 665,2087. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 ramnozy), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukozy), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, H-1 ramnozy), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d , J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatyczny H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4(C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C-), 36,4 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93 }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf-), 114,7 (Caf- ), 148,2 (Caf- ), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). Dane widmowe 1H-NMR i 13C-NMR były zgodne z danymi dotyczącymi 2'-acetyloakteozydu [17].

4. Konkluzje

Opracowano metodę HSCCC do preparatywnego rozdzielania i oczyszczania akteozydu, izoakteozydu, 3'- -L-rhamnopiranozydu syringalidu A i 2'-acetyloakteozydu z Cistanches Deserticola YC Ma. Niniejsze badanie wskazuje, że HSCCC jest bardzo skuteczną techniką preparatywnej separacji i oczyszczania składników bioaktywnych z materiałów roślinnych. Ponadto związki można wyizolować na wystarczająco dużą skalę z zachowaniem wysokiej czystości i można je następnie zastosować jako substancje odniesienia do chromatografii lub badań bioaktywności. Metoda ta jest wykonalną, ekonomiczną i wydajną techniką szybkiej preparatywnej izolacji skomplikowanych produktów naturalnych.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%