Micelarna formuła kwercetyny zapobiega nefrotoksyczności cisplatyny

więcej informacji:ali.ma@wecistanche.com

Alfredo G. Casanova, Marta Prieto, Clara I. Colino i in.

Flawonoid przeciwutleniającykwercetynawykazano, że zapobieganefrotoksycznośćw modelach zwierzęcych i w badaniach klinicznych, a zatem jest bardzo obiecującym kandydatem do profilaktyki w trakcie opracowywania.Kwercetynarozpuszczalność jest bardzo niska, co utrudnia zastosowanie kliniczne. Celem tej pracy było zbadanie u szczurów biodostępności i nefroprotekcyjnej skuteczności preparatu micelarnego Pluronic F127-w kapsułkachkwercetyna(P-kwercetyna), o zwiększonej hydrorozpuszczalności. Dootrzewnowe podanie P-kwercetynaprowadzi do zwiększonego stężenia w osoczu i biodostępnościkwercetynaw porównaniu do równomolowego podawania naturalnegokwercetyna. Ponadto P-kwercetynazachowuje ogólne właściwości nefroprotekcyjne, a nawet nieznacznie poprawia niektóre parametry czynności nerek w porównaniu z naturalnymkwercetyna. W szczególności P-kwercetynazmniejszyło przyrost kreatyniny w osoczu (z 3,4±00,5 do 1,2±0,3 mg/dl) i mocznika (z 490,9±43,8 do 184,1± 50,1 mg/dl)oraz zmniejszenie klirensu kreatyniny (z {{20}},08±0,02 do 0,58±0,19 ml/min) wywołane nefrotoksycznym lekiem chemioterapeutycznym cisplatyną, i polepszyło histologiczne dowody uszkodzenia kanalików. Ta nowa formuła o ulepszonych właściwościach kinetycznych i biofarmaceutycznych pozwoli na dalszą eksploracjękwercetynajako kandydat na środek nefroprotekcyjny w niższych dawkach i drogach podawania zorientowanych na jego zastosowanie kliniczne.

Słowa kluczowe:cisplatyna;nefrotoksyczność; flawonoid;kwercetyna; nefroprotekcja; biodostępność;nerka;micele; rozpuszczalność; sformułowanie

Zapobieganienefrotoksyczność

Kliknij, aby przejść do Cistanche para que sirve na chorobę nerek

1. Wstęp

Leknefrotoksycznośćjest poważnym problemem medycznym i ekonomicznym [1,2], przy czym 25 procent ze 100 najczęściej stosowanych leków na oddziałach intensywnej terapii ma działanie nefrotoksyczne [3], oraznefrotoksycznośćjest również ważną przyczyną spadku liczby kandydatów podczas procesu odkrywania leku 4]. Cisplatyna jest lekiem przeciwnowotworowym na bazie platyny, często stosowanym w leczeniu różnych nowotworów złośliwych litych [5,6]. Prawie 30 procent pacjentów wykazuje oznakinefrotoksycznośćw ciągu pierwszych dziesięciu dni po podaniu cisplatyny, co stanowi istotne ograniczenie jej dawkowania i skuteczności terapeutycznej [5-8]. Ostra cisplatynanefrotoksycznośćpowoduje tubulopatię wynikającą z 5-krotnej akumulacji w komórkach nabłonka kanalika proksymalnego w odniesieniu do jego stężenia w osoczu [9-1l] i w mniejszym stopniu w kanaliku dystalnym [12,13 ].

Tubulopatia cisplatynowa charakteryzuje się zaburzeniami elektrolitowymi (głównie hipomagnezemia i hipokaliemia) orazostrynerkauraz(AKI).AKI jest częstym zespołem charakteryzującym się nagłym spadkiem współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR), ciężką azotemią i często skąpomoczem lub bezmoczem [7,14]. Dodatkowo dysfunkcja śródbłonka, która zwiększa opór naczyń nerkowych i zaburza autoregulację, również przyczynia się do AKI indukowanej cisplatyną[9]. Zwykle AKI jest stanem odwracalnym, który jednak ma istotny wpływ na wyniki pacjentów, w tym zwiększoną śmiertelność wewnątrzszpitalną (ponad 50 procent przypadków wśród osób w stanie krytycznym), przedłużoną hospitalizację, dodatkowe koszty opieki zdrowotnej oraz, w i długoterminowe scenariusze, zwiększone ryzyko rozwojuprzewlekłą chorobę nerekoraz śmiertelności ogólnej i sercowo-naczyniowej [7,14]. Na poziomie subkomórkowym i molekularnym cytotoksyczność kanalików cisplatyny jest napędzana przez uszkodzenie mitochondriów, które hamuje oddychanie, wywołuje stres oksydacyjny i indukuje apoptotyczną i martwiczą śmierć komórek oraz szkodliwą odpowiedź zapalną [13,15,16]. Stres oksydacyjny jest uznawany za centralny mechanizm cytotoksyczności cisplatyny inefrotoksyczność[12,13,15-17], wynikające ze zwiększonej produkcji reaktywnych form tlenu i osłabionej bariery endogennego enzymu antyoksydacyjnego [5,7,18].

Skuteczne środki profilaktyczne dla cisplatynynefrotoksycznośćstwarzają niezaspokojoną potrzebę kliniczną w kierunku poprawy jego profilu farmakotoksykologicznego i maksymalizacji jego użyteczności. Istniejące strategie profilaktyczne, w tym intensywne nawadnianie, wykazały jedynie ograniczoną ochronę [6,19]. Opracowywane są nowe strategie oparte na równoczesnym podawaniu środków nefroprotekcyjnych. Kandydaci na nefroprotekcję obejmują preparaty magnezowe |6,9 i, przede wszystkim, różne przeciwutleniacze [6,20,21]. Flawonoidy to rodzina polifenolowych produktów nefroprotekcyjnych pochodzących z warzyw, owoców, orzechów i wina, o silnych właściwościach antyoksydacyjnych [22].Kwercetynajest opisywanym flawonoidem, który wywiera wiele korzystnych efektów [23,24], w tym zmiatanie reaktywnych form tlenu, hamowanie aktywacji płytek krwi, ochronę śródbłonka, modulację stanu zapalnego, hamowanie apoptozy, supresję guza i nefroprotekcję. Współadministracjakwercetynawraz z terapią cisplatyną w zwierzęcym modelu nowotworu zapewnia nefroprotekcję bez zakłócania działania przeciwnowotworowego |25,26]. W rzeczywistości zidentyfikowano zaktualizowaną metaanalizękwercetynajako bardzo obiecujący kandydat jako neuroprotektor do dalszego rozwoju klinicznego [21]. Konsekwentnie, niedawne badanie kliniczne wykazało działanie ochronnekwercetynana nefropatię indukowaną kontrastem (CIN) [27].

Silne ograniczenie potencjalnego zastosowaniakwercetyna(wspólny dla flawonoidów w ogóle) jest jego niska hydrorozpuszczalność wynikająca z budowy chemicznej i ugrupowań, które zmniejszają jego wchłanianie w jelicie cienkim, a tym samym biodostępność i skuteczność [23,24,28]. Co ciekawe, lipofobowa glukoza-kwercetynakoniugaty (glukozydy) są znacznie bardziej biodostępne niż aglikony lipofilowe, ponieważ te ostatnie są słabiej rozpuszczalne w świetle jelita [24]. Faktycznie,kwercetynaglukozydy z cebuli wykazują najwyższy wskaźnik wchłaniania, a tłuszcz w diecie zwiększa siękwercetynawchłanianie aglikonu w jelicie cienkim [29]. Bardzo niska hydrorozpuszczalnośćkwercetynanie tylko utrudnia jego kliniczne zastosowanie przy praktycznych drogach podawania (tj. doustnie, donaczyniowo), ale także ogranicza badania przedkliniczne. Niemniej jednak w modelach zwierzęcych alternatywne drogi (tj. dootrzewnowe) z zawiesinami leków mogą być stosowane do celów weryfikacji koncepcji [25, 26].

KwercetynaOpracowano preparaty z nowymi materiałami nośnikowymi o ulepszonej hydrorozpuszczalności, których właściwości biomedyczne wymagają zbadania. Poloksamery Pluronic to klasa materiałów nośnikowych, które utrzymują i zwiększają wchłanianie związków nierozpuszczalnych w wodzie ze względu na ich zdolność do tworzenia miceli w środowisku wodnym [30]. Tutaj postawiliśmy hipotezę, że preparat micelarnykwercetynakapsułkowany z Pluronic F127 opisanym wcześniej [31, zachowałby właściwości nefroprotekcyjne naturalnychkwercetynaoferując jednocześnie ulepszone właściwości biofarmaceutyczne do obsługi, formułowania i podawania.

Zapobiegaćnefrotoksyczność:kwercetyna

2. Wyniki

Przeprowadzono badanie biodostępności i nefroprotekcji z nowym preparatem micelarnymkwercetynakapsułkowany z Pluronic F127[31 i naszą tradycyjną formułą naturalnegokwercetyna|25,26|(patrz poniżej Materiały i metody). Podczas gdy ta ostatnia była zawiesiną zawierającą środek tensoaktywny, ta pierwsza była roztworem soli bez dodatkowych dodatków. Nasza tradycyjna formuła naturalnegokwercetynanadawał się tylko do celów eksperymentalnych, wytrącał się, gdy był nieruchomy, i był trudniejszy w obsłudze i wstrzykiwaniu. W przeciwieństwie do tego, preparat micelarny zachowywał się jak roztwór i nie wykazywał żadnych niedogodności użytkowych.

2.1.Badanie biodostępności

Jako metodę porównawczej biodostępności, ewolucjakwercetyna(Q) stężenie w osoczu badano po pojedynczym dootrzewnowym bolusie naturalnego i P-kwercetyna(PQ). Rysunek 1 pokazuje średniąkwercetynakrzywe stężenia w osoczu uzyskane po podaniu dawkikwercetynalub P-kwercetyna. Maksymalne stężenia leku (Cmax) obserwowane w grupach Q i PQ wynosiły odpowiednio 1,14±1,28 ug/ml i 8,90 ±4,62 ug/ml, tj. 78-krotny wzrost dla P-kwercetyna, co wskazuje, że preparat micelarny zwiększył wchłanianie leku.

Rysunek 1. Ewolucja stężenia kwercetyny w osoczu po dootrzewnowym podaniu pojedynczego bolusa równomolowej P-kwercetyny i naturalnej kwercetyny.

Wartości są wyrażone jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM) (n=5 na grupę). *p<0.05;><0.01;><0.001 vs.qgroup.="">kwercetyna(50mg/kg, ip.);PQ:100mg/kgi.pP-kwercetyna(zawierający 50 mg/kgkwercetyna).

Tabela 1. Parametry farmakokinetyczne po dootrzewnowym podaniu kwercetyny P i naturalnej kwercetyny (n=5 na grupę).

P: kwercetyna(50mg/kg, ip;PQ:P-kwercetyna(100 mg/kg, ip).AUCo24:powierzchnia pod krzywą częściową; AUCo: powierzchnia pod całkowitą krzywą; MRT: średni czas przebywania; t1/2: okres półtrwania w fazie eliminacji; X: nachylenie fazy końcowej.

Tabela 1 przedstawia niezależne od modelu parametry farmakokinetycznekwercetynau szczurów po podaniu pojedynczej dawki bolusa naturalnegokwercetynalub P-kwercetyna. Czas do Cmax został zwiększony z 15 min (dla naturalnegokwercetyna) do 1 h (dla P kwercetyny). Opóźnienie to można przypisać przedłużonemu uwalnianiukwercetynaz preparatu micelarnego. Ogólna ekspozycja szczurów na flawonoid była znacznie wyższa dla P-kwercetyna, o czym świadczy większy obszar pod krzywą (AUC), co przekłada się na 302,5 procent wyższą biodostępność. Wyniki te sugerują, że wyższa rozpuszczalność preparatu micelarnego zwiększa jego wchłanianie.

2.2. Badanie skuteczności nefroprotekcji 2.2.1. Stan fizjologiczny

Jak dowodzi ewolucja masy ciała (Figura 2a), ogólny stan zdrowia pogorszył się po leczeniu cisplatyną w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Ani naturalnekwercetynaani P-kwercetynaistotnie zmodyfikował działanie cisplatyny. Jednak obakwercetynazabiegi prawie całkowicie zapobiegły wzrostowinerkastosunek masy ciała do masy ciała indukowany przez cisplatynę (ryc. 2b), parametr, o którym wiadomo, że koreluje z wielkością ścieralnościnefrotoksyczność[32].

Rysunek 2. Ewolucja ogólnego stanu zdrowia. (a) Procentowa zmienność masy ciała w trakcie eksperymentu; (b) Stosunek masy nerek do masy ciała w dniu 9.

Wartości wyrażono jako średnią ± SEM (n=3-5 na grupę). *p<><0.01;><0.001vs.controlgroup.><0.05;><0.01 vs.="" cp="" group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,="" i.p.)on="" day="">

CP plus P:kwercetyna(50 mg/kg, ip) przez 9 dni i cisplatyna (6,5 mg/kg, ip) w dniu 3; CP plus PQ:P-kwercetyna(100 mg/kg, ip) przez 9 dni i cisplatyna (6,5 mg/kg, ip) w dniu 3.

2.2.2. Czynność nerek i ocena tkanki nerkowej

Według kryteriów międzynarodowych AKI definiuje się i diagnozuje na podstawie podwyższonego stężenia kreatyniny w osoczu (Crp)[33-35], zastępczego markera współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR). Inne parametry, takie jak stężenie mocznika w osoczu, są również często oceniane jako wskaźniki azotemii [36-38]. Wzrost CRP i mocznika w osoczu jest oznaką obniżonego GFR i AKI.kwercetyna. P-kwercetynawykazał nieco śmielszą aktywność niż naturalnakwercetyna, na co wskazują łagodniejsze uszkodzenia i lepszy profil regeneracji (Rysunek 3). Szczury w grupie cisplatyny (CP) przeszły jawną AKI, ponieważ doświadczały postępującego i znaczącego wzrostu poziomu kreatyniny i mocznika w osoczu w porównaniu z tymi z kontroli (Figura 3a,b). Te parametry również wzrosły w grupach CP plus Q i CP plus PQ, ale w znacznie mniejszym stopniu. Różnice między grupami CP plus Q i CP plus PQ nie były statystycznie istotne, jednak szczury leczone P-kwercetynawykazały nieco niższy poziom kreatyniny i mocznika niż osoby leczone naturalnymkwercetyna. Klirens kreatyniny (ClCr) jest standardową metodą pomiaru GFR ]39,40]. Zgodnie z danymi dotyczącymi Cr, cisplatyna wywołała głęboki spadek, który został częściowo złagodzony przezkwercetyna(Rysunek 3c). Jednak w tym przypadku zaobserwowano zauważalną różnicę między P-kwercetyną a naturalną kwercetyną, przy czym ta pierwsza znacznie skuteczniej poprawiała i przyspieszała regenerację. Warto zauważyć, że Clcr i Crplzachowują się w sposób odwrotnie proporcjonalny, co jest widoczne tylko w stanie ustalonym. Jednak podczas AKI czynność nerek nieustannie i gwałtownie się zmienia, co powoduje niewielkie rozłączenie tego związku.

Rycina 3. Ewolucja parametrów nerkowych.

(a)Stężenie kreatyniny w osoczu;(b)Stężenie mocznika w osoczu;(c) Klirens kreatyniny;(d) Proteinuria; oraz (e)KIM-1 wydalanie z moczem.

Wartości są wyrażone jako średnia ±SEM(n=3-5 na grupę). *p<><><0.001 vs=""><0.05;><0.01vs.cp group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,i.p.)on="" day="">

CP plus P:kwercetyna(50 mg/kg, ip) przez 9 dni i cisplatyna (6,5 mg/kg, ip) w dniu 3; CP plus PQ:P-kwercetyna(100mg/kg,ip.) przez 9 dni i cisplatyna (6.5mg/kg,ip.) w dniu 3.KIM-1:nerkaurazcząsteczka1.

Proteinuria jest również często mierzona w kontekście patologii nerek. W zależności od wzoru uszkodzenia, białkomocz może mieć podłoże kłębuszkowe (tj. zwiększona przepuszczalność kłębuszkowej bariery filtracyjnej) lub, jak w przypadku cisplatynynefrotoksyczność[13], może wynikać z wadliwej reabsorpcji kanalikowej z powodu uszkodzenia kanalików. Nieistotny wzrost białkomoczu wykryto w grupach CP i CP-Q (chociaż mniej wyraźny w tej drugiej) w dniu 7, który powrócił do normy w dniu 9. Podobnie, wydalanie z moczem biomarkera uszkodzenia kanalików (tj.nerkaurazcząsteczka 1; KIM-1)[41,42]został znacznie zwiększony przez cisplatynę, a wzrost ten został osłabiony przez obie formykwercetyna, chociaż P-kwercetynaznów był nieco bardziej skuteczny.

Badanie histologiczne tkanki nerkowej było zgodne z wynikami badań biochemicznych. Próbki od szczurów, którym podawano cisplatynę, ujawniły masywną martwicę kanalików w górnym pasie rdzenia zewnętrznego, której towarzyszyła pewna dolegliwość korowa orazkwercetynazmniejszone uszkodzenie kory (ryc. 4 i 5). U szczurów, które otrzymały tylko środek nefrotoksyczny, rozwinęło się rozszerzenie i niedrożność kanalików (postrzegane jako nagromadzony materiał szklisty) oraz martwicę kanalików z deepitelifikacją i złuszczaniem komórek. Obiekwercetynaleczenie podobnie zmniejszało uszkodzenie kory wywołane cisplatyną, ale nie miało wpływu na uszkodzenie rdzenia (Figury 4 i 5).

Rycina 4. Reprezentatywne obrazy próbek nerek barwionych hematoksyliną i eozyną.

Czarne strzałki: martwica kanalików i złuszczanie komórek; niebieskie strzałki: dylatacje rurkowe; zielone strzałki: wewnątrzkanalikowe złogi materiału szklistego. CP:cisplatyna (6,5 mg/kg, ip) w dniu 3;

CP plus P:kwercetyna(50 mg/kg, ip) przez 9 dni i cisplatyna (6,5 mg/kg, ip) w dniu 3;CP plus PQ:P-kwercetyna(100 mg/kg, ip) przez 9 dni i cisplatyna (6,5 mg/kg, ip) w dniu 3.

Rycina 5. Ocena ilościowa uszkodzenia nerek.

Wartości wyrażono jako średnią ± SEM (n =5 obrazów × 3 szczury na grupę). * p<><0.001 vs.=""><0.05 vs.cp="">

CP: cisplatyna (6,5 mg/kg, ip.) w dniu 3; CP plus Q:kwercetyna(50mg/kg, ip przez 9 dni i cisplatyna (6,5 mg/kg,ip) w dniu 3;CP plus PQ:P-kwercetyna(100 mg/kg, ip) przez 9 dni i cisplatyna (6,5 mg/kg, ip) w dniu 3.AU: jednostki arbitralne.

3. Dyskusja

Nasze wyniki pokazują, że preparat micelarnykwercetynaz Pluronic F127 (P-kwercetyna), posiadając ulepszone właściwości biofarmaceutyczne, zwiększył biodostępność tego przeciwutleniającego flawonoidu i zachował (lub nawet nieznacznie poprawił) jego ogólne właściwości nefroprotekcyjne w porównaniu z naturalnymikwercetyna.

Kwercetynapostuluje się jako obiecujący kandydat do ochrony przed uszkodzeniem nerek powodowanym przez szereg leków i toksyn, w tym cisplatynę [25,26], metotreksat [43,44], cyprofloksacynę [45], NaF [46], HgCl [47l i kadm [48]. Chociaż badania te wykazały skuteczność przedkliniczną,kwercetynanie był testowany w podobnych scenariuszach klinicznych ze względu na utrudnienia formułowania i niską biodostępność, z wyjątkiem badania klinicznego, w którymkwercetynazapewnił pewną ochronę przed CIN [27]. Oba ograniczenia wynikają z bardzo słabej rozpuszczalności w wodzie (zaledwie 00,01 mg/ml, przy 25 stopniach [49])kwercetynaoraz jego niskiej stabilności (na którą wpływa temperatura, pH, hydroksylacja, aktywność enzymatyczna i jony metali) [28,29,50]. Podawany doustniekwercetynapodlega rozległej degradacji podczas pasażu żołądka z powodu bardzo niskiego pH żołądka (tj. 1,5) [50]. W jelicie cienkim, chronionym chemicznie wyższym pH (7,5), pozostałekwercetynawchłania się tylko w minimalnym stopniu. Dlatego w celu zwiększenia jej biodostępności i skuteczności biologicznej opracowano nowe preparaty kwercetyny mające na celu poprawę jej hydrorozpuszczalności oraz ochronę jej aktywnych ugrupowań przed degradacją, w tym liposomów, nanocząstek, nanoemulsji i miceli [28].

Zwiększa się nasza formuła micelarna z Pluronic F127kwercetynarozpuszczalność dziesięciokrotnie i, w badaniach in vitro, wykazał lepsze zachowanie rozpuszczania w symulowanych płynach żołądkowych i jelitowych, ponieważ osiąga znaczne zmniejszenie wielkości cząstek i bardziej jednorodną dyspersjękwercetynaw matrycy polimerowejI3l. Ten preparat zapewnia znacznie zwiększoną ilośćkwercetynado krwioobiegu, co skutkuje 3-krotnością biodostępności, która, co dziwne, przekłada się tylko na nieco wyższy efekt nefroprotekcyjny. Zgadzając się, nie zaobserwowaliśmy dodatkowego efektu nefroprotekcyjnego, gdy zastosowaliśmy wyższą dawkę (tj. 100 mg/kg) naturalnegokwercetynaw poprzednich eksperymentach (nasze niepublikowane obserwacje)[25,26]. W tych badaniach nasza interpretacja była taka, że ​​prawdopodobnie wyższe dawki ipkwercetyna(i.e., >50 mg/kg) nie przełożyło się na zwiększoną biodostępność ze względu na zmniejszoną rozpuszczalność, co skutkowało nieznacznym wzrostem wchłaniania netto. Zbiegło się to z żółtymi osadami niewchłoniętychkwercetynaznalezione w jamie otrzewnej w ofierze. Ponadto, nasze obecne wyniki pokazują, że nawet wyższe stężenia kwercetyny w osoczu (takie jak te uzyskane z P-kwercetyną) przekładają się na tylko nieznacznie wyższy efekt. Dlategokwercetynadystrybucja została wyjaśniona w uproszczonej formie przez model dwukompartmentowy pierwszego rzędu [51], dostęp do komórek docelowych z kompartmentu głównego (tj. krwiobiegu) nie wydaje się być ograniczeniem. Zatem powód, dla którego maksymalny efekt nefroprotekcyjny jest prawie osiągany przy niższych stężeniach w osoczu uzyskiwanych przez naturalną kwercetynę, pozostaje niejasny.

Ma to praktyczne implikacje dla dalszego rozwojukwercetynajako profilaktyczny nefroprotektor. Po pierwsze, wyniki te otwierają możliwość zbadania, czy niższe dawki będą równie skuteczne, ponieważ znaczny nadmiar biodostępności P-kwercetynamożna poświęcić bez utraty efektu terapeutycznego, ale zmaksymalizuje profil bezpieczeństwa. Po drugie, otwiera się teraz możliwość podawania doustnego, które jednak należy przetestować pod kątem nowego preparatu. Wchłanianie z jamy otrzewnej pozwala uniknąć barier napotykanych drogą doustną. Przypuszcza się, że wyższa rozpuszczalność w świetle jelita może prowadzić do zwiększonego i zakrzepłegokwercetynabiodostępność w oknie terapeutycznym. Po trzecie, droga dożylna może być teraz realistyczną alternatywą o zminimalizowanej toksyczności, która pozwoliłaby uniknąć barier absorpcji. Dotychczas eksperymentalne preparaty do wstrzykiwaniakwercetynazastosował dimetylosulfotlenek (DMSO) jako rozpuszczalnik [51].

Wiadomo, że cisplatyna kumuluje się i uszkadza kanaliki proksymalne i dystalne oraz, w zależności od stężenia, indukuje apoptozę i martwicę komórek nabłonka kanalików [16]. Najbardziej dotknięty jest proksymalny segment S3, chociaż wyższe dawki powodują również coraz większe uszkodzenia S1 i S2. Zgodnie z jego znanymi właściwościami antyapoptotycznymi na komórkach kanalików [52,53],kwercetynazmniejszona deepitelializacja kanalików korowych. Identyczny efekt obserwowany w przypadku obu preparatów wzmacnia ideę, żekwercetynakinetyka dystrybucji donerkisą nasycone w naszym badaniu. Ponadto w ramachnerki, kwercetynawykazuje inne zachowanie wzdłuż nefronu. Faktycznie,kwercetynanie miał wpływu na rdzeń zewnętrzny, gdzie znajduje się segment S3 kanalików proksymalnych.Kwercetynawydaje się, że gromadzi się w kanalikach S1, S2 lub dystalnych, które znajdują się blisko kory. Ponieważ nie wiadomo w jaki sposób (tj. które transportery lub ścieżki dyfuzji) i skąd (tj. strona prześwitu lub podstawno-boczna)kwercetynauzyskuje dostęp do komórek kanalikowych, konieczne są dalsze badania w celu wyjaśnienia tych różnicowych efektów.

Umiarkowane zachowanie tkanki korowej może tylko częściowo wyjaśniać efektkwercetynana czynność nerek (tj. GFR). Dodatkowa ochrona może wynikać z naczyniowych skutkówkwercetyna. Funkcja śródbłonka uczestniczy w regulacji przepływu krwi przez nerki (RBF) i GFR poprzez modulację napięcia kurczliwości tętniczek doprowadzających i odprowadzających [54-57]. Cisplatyna indukuje dysfunkcję śródbłonka i uważa się, że istotnie przyczynia się to do spadku GFR wraz z skurczem naczyń doprowadzających nerki wywołanym mechanizmem sprzężenia zwrotnego kanalików nerkowych (aktywowanym przez uszkodzenie kanalików) i cytokinami zapalnymi [13,58]. Rzeczywiście, odwrócenie dysfunkcji śródbłonka jest powszechnie rozpoznawanym efektem:kwercetyna(i ogólnie flawonoidów)[59-61l, co może wyjaśniać dlaczegokwercetynapoprawia RBF (a tym samym GFR), jak opisano wcześniej [25]. Ponadto te efekty śródbłonkowo-naczyniowe mogą również pomóc wyjaśnić nieco wyższą skuteczność P-kwercetynaw poprawie funkcji nerek i przywróceniu funkcji nerek. Prawdopodobnie nie jest nierozsądne spekulowanie, że wyższa biodostępność może mieć śmielszy wpływ na błonę śluzową śródbłonka w bezpośrednim kontakcie z krwią.

Niektóre z efektów obserwowanych po podaniukwercetynamogą być wywierane przez jego metabolity.Kwercetynajest metabolizowany w błonie śluzowej jelit i wątrobie poprzez reakcje glukuronidacji, siarczanowania i metylacji [62], przy czym najliczniejszymi metabolitami są metabolity glukuronidowe we krwi [63]. Konkretnie,kwercetynaWykazano, że -3-bO-glukuronid (Q3GA), główny metabolit osocza, wywiera działanie przeciwzapalne i naczyniowe, zarówno bezpośrednio, jak i po metabolizacji z powrotem do postaci aglikonu [64]. Konieczne są dalsze badania, aby zrozumieć konkretne metabolity odpowiedzialne za neuroprotekcję oraz ich zróżnicowane wytwarzanie i transformację z różnych miejsc podania do ich ostatecznych celów.

Podsumowując, to wstępne badanie pokazuje potencjał terapeutyczny P-kwercetynajako ulepszony preparat o ulepszonych właściwościach biofarmaceutycznych i farmakokinetycznych, przydatny do dalszego rozwoju i potencjalnego zastosowania klinicznego w profilaktycenefrotoksyczność.

Korzyści z kwercetyny na nefrotoksyczność

4. Materiały i metody

Wszystkie chemikalia i odczynniki zakupiono z Merck (Darmstadt, Niemcy), o ile nie wskazano inaczej.

4.1.Przygotowanie preparatu micelarnego (P-kwercetyna) i NaturalneKwercetynaSformułowanie

Kwercetynahydrat (minimalna czystość 95 procent) został zakupiony z Acros Organics (Madryt, Hiszpania), a kopolimer blokowy tlenek etylenu-tlenek propylenu Pluronic F127 (średnia masa cząsteczkowa 12,6 kDa, równowaga hydrofilowo-lipofilowa 22) został dostarczony przez BASF (Ludwigshafen am Rhein, Niemcy). W przypadku formulacji micelarnej zastosowano technikę wytrącania nadkrytycznym przeciwrozpuszczalnikiem w celu wytworzeniakwercetyna/Pluronic F127 cząstki (P-kwercetyna) jak opisano wcześniej [31]. Powstały Pluronic-kwercetynapreparat miał względny skład 50 procent /50 procent w/w Pluronic F127/kwercetyna. Dla naturalnegokwercetynasformułowanie,kwercetynazostał zawieszony w 0,16 procentach Tween 20 w soli fizjologicznej, jak opisano wcześniej [25,26].

4.2. Zwierzęta i bioetyka

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną Uniwersytetu w Salamance oraz Rząd Regionalny Kastylii i Leonu, Ministerstwo Rolnictwa i Hodowli Zwierząt (kod: 0000037,27 lipca 2015). Zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi Dyrektywy Rady Wspólnoty Europejskiej 2010/63/UE oraz z obowiązującymi hiszpańskimi przepisami dotyczącymi eksperymentalnego wykorzystania i opieki nad zwierzętami (RD53/2013, 01.02.2013). Samce szczurów Wis-tar (200-250 g) były utrzymywane w kontrolowanych warunkach środowiskowych na terenie obiektu dla zwierząt na Uniwersytecie w Salamance, ze swobodnym dostępem do wody i standardowej karmy.

4.3. Badanie biodostępności

Szczury podzielono na dwie grupy eksperymentalne: O (n=5), w której zwierzęta otrzymały pojedynczą dawkękwercetyna(50 mg/kg); oraz PQ(n=5), w którym zwierzęta otrzymały pojedynczą ip równomolową dawkę P-kwercetyna(100 mg/kg (tj. zawierający 50 mg/kgkwercetyna). Następnie próbki krwi pobrano do probówek pokrytych kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) z małego nacięcia na końcu ogona w następujących czasach:0.25,0.5,1,2,8, 12 i 24 godz. Osocze uzyskano przez odwirowanie i 10 μl 10 mM kwasu askorbinowego aby uniknąćkwercetynadegradacja） dodano do 100 μl osocza i zamrożono w stopniu -80 do czasu jego analizy.Kwercetynastężenia określono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami z detekcją UV. Zastosowano kolumnę Prosper o wielkości cząstek C18 3 µm, z fazą ruchomą składającą się z 28% acetonitrylu i 72% wodnego roztworu 0,2% wodnego kwasu ortofosforowego, przy szybkości przepływu 1 ml/min. Długość fali detekcji wynosiła 371 nm. Przed wstrzyknięciem do aparatury chromatograficznej próbki poddano procesowi glukuronidacji w celu ilościowego oznaczenia sumykwercetyna. W tym celu do 100 µl osocza dodano 1000 jednostek -glukuronidazy z Helix pomatia w 0,1 M buforze octanowym (pH 5) i inkubowano tę mieszaninę w temperaturze 37 stopni przez 1 godzinę. . Następnie przeprowadzono proces ekstrakcji przy użyciu 100 µl mieszaniny 0,5M80~20 acetonitryl/octan trzy razy）. Po odparowaniu supernatantu w strumieniu azotu suchą pozostałość ponownie rozpuszczono w 40 μl fazy ruchomej i 20 μl wstrzyknięto do układu HPLC.

4.4. Badanie nefroprotekcji

Szczury podzielono na następujące grupy eksperymentalne (Figura 6): kontrolne (n=3)zwierzęta otrzymywały nośnik (NaCl0,9 procent) dootrzewnowo (ip) przez 9 dni; Zwierzęta CP(n=5) otrzymały pojedynczą nefrotoksyczną dawkę cisplatyny (6,5 mg/kg,ip) w dniu 3 eksperymentu; zwierzęta CP plus Q(n=5) otrzymały dzienną dawkękwercetyna(50 mg/kg, ip) przez 9 dni i pojedyncza dawka cisplatyny (6,5 mg/kg, ip) w dniu 3; a zwierzęta CP plus PQ (n=5) otrzymywały dzienną dawkę P-kwercetyna(100 mg/kg, ip(tj. zawierający 50 mg/kgkwercetyna)) przez 9 dni i dawkę cisplatyny (6,5 mg/kg, ip) w dniu 3.

Rysunek 6. Schemat modelu nefrotoksyczności.

CP: cisplatyna (6,5 mg/kg, ip) w dniu 3; CP plus P:kwercetyna(50 mg/kg, ip) przez 9 dni i cisplatyna (6,5 mg/kg, ip) w dniu 3; CP plus PQ:P-kwercetyna(100 mg/kg, ip.) przez 9 dni i cisplatyna (6,5 mg/kg, ip.) w dniu 3.

Próbki krwi （150 μL） pobrano w dniach 0,3,5,7 i 9w heparynizowanych naczyniach włosowatych z małego nacięcia na czubku ogona. Osocze oddzielono przez odwirowanie (11.000 obr./min przez 3 min) i trzymano w -80C. W dniach 7 i 9 24-godzinny mocz zbierano w klatkach metabolicznych, oczyszczano przez wirowanie (2000 x g przez 9 min) i przechowywano w -80 stopniu. Pod koniec eksperymentu (dzień 9.) szczury uśpiono i ichnerkiwypreparowano, zważono i utrwalono w 3,7% paraformaldehydzie do badań histologicznych.

Poziom kreatyniny w osoczu i moczu mierzono przy użyciu komercyjnego zestawu opartego na metodzie Jaffe [65] (QuantiChrom Creatinine Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). Mocznik w osoczu oznaczano przy użyciu komercyjnego zestawu opartego na metodzie Junga [66] (Quan-tiChrom Urea Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). Klirens kreatyniny (Clcr) obliczono ze wzoru: Clcr=Crur × UF/Crp); gdzie Crur odpowiada stężeniu kreatyniny w moczu, UF to przepływ moczu, a Crp to stężenie kreatyniny w osoczu. Proteinuria mierzono testem Bradforda [67]. KIM-1 został określony ilościowo za pomocą RatNerkaurazmolekuła 1(KIM-1)ELISA Kit (Cusabio, Houston. TX, USA). zgodnie z instrukcjami producenta.

Do badań histologicznych próbki nerkowe zatopiono w parafinie i 5 µm skrawki tkanki wybarwiono hematoksyliną i eozyną. Zdjęcia zostały wykonane pod mikroskopem Olympus BX51 połączonym z kolorowym aparatem cyfrowym Olympus DP70 (Olympus, Madryt, Hiszpania). Kwantyfikację szkód przeprowadzono w ślepy sposób, jak opisano wcześniej [68]. W skrócie, wykonano pięć losowych zdjęć obszaru korowego i pięć zdjęć zewnętrznego obszaru rdzenia (tj. obszarów uszkodzonych przez cisplatynę), równomiernie mapując te obszary. Każdy obraz został podzielony na 10 identycznych sekcji (przy użyciu oprogramowania Microsoft Office PowerPoint 2016), z których każdej przypisano ocenę 0 (brak uszkodzeń), 1 (obecność uszkodzeń na mniej niż 1/3 obszaru), 2 (obecność uszkodzeń między 1/3-2/3 obszaru) lub 3 (obecność uszkodzeń na więcej niż 2/3 obszaru). Uszkodzenia oceniano biorąc pod uwagę obecność martwicy kanalików i złuszczanie komórek, poszerzenie kanalików, wakuolizację, obecność złogów szklistych i utratę rąbka szczoteczkowego.

4.5.Analiza statystyczna

Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). Wartości odstające zidentyfikowano za pomocą testu Grubbsa|69]. Normalny rozkład danych oceniano za pomocą testu Shapiro-Wilka. W badaniu biodostępności porównania między dwiema grupami dokonano za pomocą testu t-Studenta lub testu U Manna-Whitneya. Badanie farmakokinetyczne przeprowadzono za pomocą niezależnej od modelu analizy średnich poziomów w osoczukwercetyna. Szacowane parametry do oceny względnej biodostępnościkwercetynapole pod krzywą częściową poziomów w osoczu (AUC)24, pole pod krzywą całkowitą poziomów w osoczu (AUC)0~, nachylenie fazy końcowej, okres półtrwania eliminacji (ti/2) i średni czas przebywania (MRT). Oszacowanie parametrów farmakokinetycznych przeprowadzono łącząc metodę trapezoidalną do oszacowania pola pod krzywą cząstkową i nieliniową regresję fazy końcowej krzywej poziomu w osoczu. W badaniu nefroprotekcji przeprowadzono analizę wariancji (ANOVA) testem Scheffego lub testem Kruskala-Wallisa dla porównań międzygrupowych. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą oprogramowania IBM SPSS Statistics 20.0 (International Business Machines, Armonk, NY, USA). Do stworzenia grafiki i ilustracji wykorzystano Microsoft Office Excel i PowerPoint 2016 (Microsoft, Redmond, WA, USA).

Bibliografia

1. Awdiszu, L.; Mehta, RLThe6R's of Drug-InducedNefrotoksyczność. BMCNephrol.2017,18,124. [CrossRefl[PubMed]

2. Perazella, MADużycie narkotyków iNefrotoksycznośćna Oddziale Intensywnej Terapii.NerkaInt.2012,81,1172-1178. [Odsyłacz] [PubMed]

3. Taber, SS; Mueller, BADrug-Associated Neren Dysfunction. Crit.Care Clin.2006,22,357-374, vi. [Odn.] Huang, JX; Blaskovich, MA; Testy Coopera, MACell i biomarkery do przewidywaniaNefrotoksyczność.

Notatka:powyższe nie jest pełną listą referencyjną