Profilaktyczne działanie glikozydów fenyloetanolowych z Cistanche Tubulosa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Shu-Ping You i inni

Abstrakcyjny

Tło:Cistanchetubulosato tradycyjny chiński lek ziołowy, który jest szeroko stosowany do regulacji odporności.Fenyloetanoilglikozydy(CPhG) z tej rośliny są przede wszystkim skutecznymi materiałami. Celem tego badania była ocena zapobiegawczego i terapeutycznego wpływu CPhG na indukowane BSA zwłóknienie wątroby u szczurów i powiązane mechanizmy molekularne obejmujące komórki gwiaździste wątroby. Jako kontrolę pozytywną zastosowano Biejiarangan (BJRG), inny tradycyjny chiński lek ziołowy.

Metody:W doświadczeniach in vivo 75 szczurów SD podzielono losowo na 6 grup: normalne (traktowane wodą destylowaną), model (traktowane BSA), pozytywny lek (traktowane BSA plus BJRG 600 mg/kg/dzień) i traktowane BSA plus grupy CPhG (125, 250 i 500 mg/kg/dzień). Wskaźniki wątroby i śledziony, poziomy w surowicy aminotransferazy asparaginianowej (AST), aminotransferazy alaninowej (ALT), kwasu heksadecenowego (HA), lamininy (LN), prokolagenu typu III (PCIII), kolagenu typu IV (IV-C), hydroksyproliny (Hyp ) i transformujący czynnik wzrostu 1 (TGF- 1) mierzono w wątrobach szczurów. Stopnie histopatologiczne dla zwłóknienia wątroby oceniano dla każdej grupy stosując barwienie H&E i trichromem Massona. Ekspresję TGF- 1, kolagenu I (Col-I) i kolagenu III (Col-III) określono metodą barwienia immunohistochemicznego. Efekty te dalej oceniano in vitro przez określenie poziomów ekspresji NF-κB p65 i Col-I za pomocą ilościowych analiz PCR w czasie rzeczywistym. Ekspresję białka Col-1 zbadano również metodą western blotting.

Wyniki: Wszystkie grupy dawek (125, 250 i 500 mg/kg/dobę) CPhG znacząco zmniejszyły wskaźnik wątroby i śledziony, zmniejszyły ALT, AST, HA, LN , poziom PCIII, IV-C w surowicy, zawartość TGF- 1 (P < 0.01,="" p="">< 00,01="" i="" p=""><0,01) oraz="" hyp="" zawartość.="" cphg="" również="" znacznie="" łagodziły="" obrzęk="" komórek="" wątroby="" i="" skutecznie="" zapobiegały="" martwicy="" hepatocytów="" i="" infiltracji="" komórek="" zapalnych.="" wyniki="" immunohistochemiczne="" wykazały,="" że="" cphg="" znacząco="" zmniejszały="" ekspresję="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" i="" p="">< 0,01),="" col-i="" i="" col-iii.="" efekty="" in="" vitro="" cphg="" (100,="" 75,="" 50="" i="" 25="" ug/ml)="" na="" hsc-t6="" wykazały,="" że="" cphg="" znacząco="" zmniejszały="" ekspresję="" mrna="" nf-κb="" p65="" i="" col-i,="" a="" cphg="" również="" obniżały="" ekspresję="" białka="">

Wnioski:CPhG mają znaczące działanie przeciw zwłóknieniu wątroby i mogą być stosowane jako środki chroniące wątrobę w leczeniu zwłóknienia wątroby.

Słowa kluczowe:zwłóknienie wątroby,Cistanche tubulosa,Fenyloetanoilglikozyd,Chemokina BSA, Profilaktyka i terapia

FenyloetanoilglikozydwCistanchetubulosa

Tło

Zwłóknienie wątroby jest odpowiedzią gojenia się ran na ciężkie uszkodzenie wątroby, które występuje w patogenezie przewlekłego zapalenia wątroby wywołanego różnymi czynnikami. Czynnikami tymi są infekcja wirusowa, nadużywanie alkoholu, cholestaza oraz choroby metaboliczne i autoimmunologiczne [1–3]. Postępująca akumulacja macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i zmniejszona przebudowa zaburzają prawidłową architekturę wątroby, prowadząc do zwłóknienia wątroby [4]. Zwłóknienie wątroby jest krytyczne w przewlekłej chorobie wątroby i często rozwija się w nieodwracalną marskość i karcynogenezę. Obecnie nie ma metod ani skutecznych leków do leczenia zwłóknienia wątroby. Dlatego pilnie należy znaleźć lek przeciw zwłóknieniu wątroby, który łagodzi progresję uszkodzenia wątroby do zwłóknienia i raka.

CistanchetubulosaW (z rodziny Orobanchaceae) jest pasożytniczą rośliną powszechnie uprawianą w południowym regionie Xinjiang w Chinach [5]. Ludzie zwykle używają go do ożywienia nerek, odżywienia krwi, rozluźnienia jelit i opóźnienia starzenia. Jest oficjalnie wymieniony w Farmakopei Chińskiej [6].Cistanchetubulosazawiera wiele aktywnych składników. Obejmują oneFenyloetanoilglikozydy(CPhG), irydoidy i polisacharydy. Jako jeden z wielu aktywnych składników wCistanchetubulosaCPhGshave wykazywał przekonujące działanie przeciwutleniające, przeciwzmęczeniowe, neuroprotekcyjne i przeciwzapalne zarówno w badaniach in vivo, jak i in vitro [7]. W ostatnich latach doniesiono, że CPhG mają działanie hepatoprotekcyjne. Potencjalne mechanizmy leżące u podstaw tych efektów to wychwytywanie wolnych rodników, ochrona błon wątrobowych, immunoregulacja, hamowanie apoptozy, hamowanie ekspresji HBsAg i HBeAg oraz hamowanie replikacji DNA HBV i inne [8–11]. Jednak niewiele badań w piśmiennictwie dotyczy przeciwwątrobowego działania GPhCs. Dlatego to badanie miało na celu zbadanie działania GPhC przeciw zwłóknieniu wątroby przy użyciu modelu zwłóknienia wątroby indukowanego albuminą surowicy bydlęcej (BSA) u szczurów. Pokrewne mechanizmy molekularne badano w komórkach HSC-T6.

Metody

Chemikalia i odczynniki

Zestaw hydroksyproliny (hydroliza alkaliczna) (Lot:20140616) zakupiono z Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Chiny). Zestawy szczurzego TGF- 1 sandwichELISA (seria: 238240615) zakupiono w firmie Lianke Biotech Co., Ltd. (Chiny). Królicze przeciwciało anty-kolagen I (seria: 140619), królicze przeciwciało anty-kolagen III (seria: 980788 W) i królicze przeciwciało anty-TGF- 1 (seria: 140619) zostały dostarczone przez Beijing BiosynthesisBiotechnology Co., LTD ( Chiny). Zamknięte z normalną surowicą owczą (płyn roboczy) (Seria: WP141214), PV-6000(Seria: WK141225) i zestaw DAB (Seria: K136621D) zakupiono od Zhongshan Golden Bridge BiotechCo., Ltd. (Chiny). Wykrywanie przeciwciał pierwszorzędowych przeprowadzono przy użyciu 2. roztworu przeciwciał (sprzężone z Alk-Fos, anty-królik) i 2. roztworu przeciwciał (sprzężone z Alk-Fos, anty-mysie) (seria: 272387) zakupionego od Invitrogen Company (USA) .

Albuminę surowicy bydlęcej (BSA) (partia: SLBG8239V) zakupiono w Sigma (USA). Przed użyciem BSA przygotowano w stężeniu 18 g/l w soli fizjologicznej, bakterie usunięto przez filtrację, a BSA przechowywano w 4 stopniach. Niekompletny adiuwant Freunda zawierający 1 g lipidów z owczej sierści (seria: AF0220LA14, Shanghai juan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Chiny) zmieszano z 2 g płynnej parafiny (seria: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Chiny), sterylizowany w autoklawie parowym i przechowywany w temperaturze 4 st. Pozytywny lek BJRG otrzymano w postaci tabletek Biejiarangan z Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Chiny). Zapasy leków BJRG przygotowano przez rozpuszczenie tabletek BJRG w woda destylowana w stężeniu 600 mg/kg.

Fenyloetanoil glikozydwCistanchema działanie zapobiegawcze

Materiały roślinne

Cistanche tubulosa(rodzina Orobanchaceae) została zakupiona z regionu Minfeng w Xinjiang w Chinach. Materiał został uwierzytelniony przez badacza Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica of Xinjiang. Próbki kuponów zostały zdeponowane w Instytucie Materia Medica w Xinjiangu.

Przygotowanie CPhG

Suszone i pokrojone w plasterki kłączaCistanchetubulosa(6,0 kg) kolejno trzykrotnie wyekstrahowano pod chłodnicą zwrotną 70% etanolem i rozpuszczalnik usunięto otrzymując ekstrakt etanolowy. Ekstrakty etanolowe oczyszczono przy użyciu żywicy AB-8 w celu uzyskaniafenyletanoidglikozydy(CPhG). Roztwory podstawowe CPhG stosowane w różnych grupach dawkowania w badaniach na zwierzętach (odpowiednio 500 mg/kg, 250 mg/kg i 125 mg/kg) rozpuszczono w 0,5% (5 g/l) karboksymetylocelulozie ( sól sodowa).

Kwantyfikacja CPhG

Zawartość dwóch składników (echinakozydu i akteozydu) w CPhG oznaczono metodą HPLC, stosując wcześniej opisaną metodę (Zhang i wsp. 2004)[12]. HPLC przeprowadzono przy użyciu Shimadzu LC-10AHPLC wyposażonego w detektor UV. Kolumna HPLC była kolumną Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm). Izokratyczna faza ruchoma składała się z metanolu-acetonitrylu-1% kwasu octowego (15:10:75, obj./obj./obj.). Elucję prowadzono przez 40 min, a szybkość przepływu utrzymywano na poziomie 0,6 ml/min. Temperaturę kolumny utrzymywano na stałym poziomie 30°C. Detekcja UV była przy 334 nm.

Zwierzęta i linia komórkowa HSC-T6

[Grade SPF], zdrowe dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley (SD) (180-220 g) zakupiono od Xinjiang MedicalUniversity Animal Center, numer licencji: SCXK (nowy)2011-0004. Szczury karmiono karmą wolną od specyficznych patogenów (SPF). Wszystkie procedury związane z eksperymentami na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Pierwszego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Medycznego w Xinjiang. Szczury trzymano w klatkach w kontrolowanych warunkach środowiskowych (25 stopni i 12-godzinny cykl światło/ciemność) i miały swobodny dostęp do standardowej karmy dla szczurów i wody wodociągowej. Szczury aklimatyzowano przed leczeniem.

Linię unieśmiertelnionych komórek gwiaździstych wątroby szczura, HSC-T6, otrzymano z Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, Chiny). Komórki HSC-T6 hodowano w pożywce Eagle's Modified Eagle's Dulbecco (wysoka glukoza) (DMEM, Pekin, Chiny) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (Gibco, Ameryka Południowa), 100 IU/ml penicyliny i 100 ug/ml streptomycyny (Pekin, Chiny). ) w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 stopni z 5% CO2.

Uszkodzenie i leczenie wątroby wywołane przez BSA

Siedemdziesiąt pięć szczurów SD podzielono losowo na sześć grup: Normalne (leczone wodą destylowaną), modelowe (leczone BSA), pozytywny lek (leczone BSA plus BJRG 600 mg/kg/dzień) i grupy leczone BSA plus CPhG (125, 250, 500 mg/kg/dzień). W grupach leczonych BSA plus CPhG (125, 250, 5 mg/kg/dzień) było 13 szczurów w każdej grupie, a druga grupa miała 12 szczurów w każdej grupie. Model uszkodzenia wątroby indukowanego BSA dzieli się na sensytyzację pierwotną, po której następuje atak immunologiczny) [13]. Poza normalną grupą, innym grupom podawano wielokrotne podskórne wstrzyknięcia 0,5 ml (9 mg/ml) niekompletnego adiuwantu BSAFreund w dniu 1, 15, 22, 29 i 36 w celu uczulenia pierwotnego. Siedem dni po piątym wstrzyknięciu pobrano krew przez splot żyły siatkówkowej szczura i zbadano na obecność przeciwciał przeciwko albuminie surowicy. Przeciwciało BSA w surowicy szczura wykryto metodą podwójnej dyfuzji agarowej. Wstrzyknięcie ataku przeprowadzono przez podawanie 0,4 ml BSA w soli fizjologicznej przez żyłę ogonową u szczurów z dodatnim przeciwciałem BSA dwa razy w tygodniu dziesięć razy. Stężenia i czasy wstrzyknięć wynosiły 5.00, 5.50, 6.00, 6.50,7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 i 10,00 g/l w dniu 46. , dzień 50, dzień 53, dzień 57, dzień 60, dzień 64, dzień 67, dzień 71, dzień 74 i dzień 78, odpowiednio. W grupie prawidłowej zamiast BSA zastosowano normalną sól fizjologiczną do immunologicznych pierwotnych (uczulających) i wtórnych (atak) wstrzyknięć, a inne stany były takie same jak w grupie modelowej.

Normalnej grupie podawano doustnie wodę destylowaną w dawce 10 ml/kg/dzień. Grupie modelowej podawano doustnie 10 ml/kg/dzień 0,5% roztworu CMC-Na. Grupie z dodatnim lekiem podawano doustnie 600 mg/kg/dzień BJRG. Grupom leczonym BSA plus CPhG (125 250 i 500 mg/kg/dzień) podawano doustnie odpowiednio 125, 250 i 500 mg/kg/dzień CPhG.

Po okresie doświadczalnym szczury głodzono przez 12 godzin przed 10% wodzianem chloralu, a następnie natychmiast uśmiercano. Próbki surowicy pobrano od każdego szczura i natychmiast użytego. Wątroby pobrano w dwóch celach: (1) konserwacja w ciekłym azocie dla zestawów Hyp oraz (2) utrwalenie w 10% formaldehydzie do badań histologicznych i immunohistochemicznych. Całkowity czas trwania badań na zwierzętach wynosił 93 dni.

Fenyloetanoil glikozydwCistanchema działanie zapobiegawcze

Wskaźniki wątroby i śledziony

Wątrobę i śledzionę wypreparowano przez laparotomię i przepłukano roztworem soli fizjologicznej o stopniu 4°C. Po wchłonięciu nadmiaru wody za pomocą bibuły filtracyjnej, wątrobę i śledzionę zważono, aby obliczyć odpowiednie wskaźniki: Względna masa narządu=masa narządu (g)/osobna masa ciała (g) × 100 procent [14].

Analiza markerów zwłóknienia wątroby

Ochronny wpływ CPhG na uszkodzenie wątroby wywołane przez BSA oceniano przez pomiar ALT i AST (automatyczny analizator biochemiczny Mind ray, A086A0182). Rozwój zwłóknienia wątroby i efekty leczenia określono badając HA, LN, PC III i IV-C (analizator chemiluminescencji, TaiGeKeXin, MP2808).

Analiza treści Hyp i TGF- 1

Poziom Hyp w tkance wątroby oznaczono metodą spektrofotometryczną zgodnie z instrukcją zestawu. Poziom Hyp wyrażono jako Hyp (ug)/białko (mg).Hyp (ug/mg)=(Zmierzone OD - ślepa OD)/(standardowa OD ślepa OD)×5 (ug/ml) × 10/masa mokrej tkanki (ml/mg). Stężenie TGF- 1 w wątrobie wykrywano za pomocą zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta. Hamujące działanie CPhG na zwłóknienie zostało potwierdzone przez poziomy ekspresji TGF- 1.

Badanie histopatologiczne

Tkankę wątroby w tej samej części lewego płata wycięto i utrwalono w 10 procentowym roztworze formaldehydu. Tkanki wybarwiono konwencjonalnym barwieniem H&E i Masson'strichrome, aby obserwować zmiany histopatologiczne pod mikroskopem świetlnym. Ekspresję kolagenu typu I, kolagenu typu III i TGF- 1 w tkankach wątroby analizowano metodą barwienia immunohistochemicznego [15].

Immunohistochemię półilościową przeprowadzono zgodnie z opisanymi metodami [16, 17]. Dla komórek dodatnich pod względem TGF- 1 zastosowano następujące klasyfikacje: „-” oznacza prawie brak ekspresji, 20=l; „plus” wskazuje dodatnie komórki indywidualnie zebrane w obszarze zmiany, 21=2; „plus plus” wskazuje dodatnie komórki w małych grupach zebranych wokół zmiany chorobowej, 22=4; „plus plus plus” oznacza rozproszone komórki dodatnie wyrażone jako 23=8. Wyniki reprezentują integrację hierarchiczną. Stopień i zakres chromogenności kolagenu typu I i kolagenu typu III przekształcono na CRI do analizy statystycznej (stopień chromogenności × zakres chromogeniczny). Stopień chromogeniczny dzieli się na słaby „plus”, umiarkowany „plus plus” i silny „plus plus plus”. Zakres chromogeniczny jest podzielony na „plus”, jego zakres chromogeniczny < zobacz="" 1/4;="" "="" plus="" plus="" ",="" jego="" chromogeniczny="" zakres="" widzenia/4-2/4;="" "="" plus="" plus="" plus="" ",="" jego="" chromogeniczny="" zakres="" widzenia="" 2/4-3/4;="" "plus="" plus="" plus="" plus",="" jego="" zakres="" chromogeniczny=""> 3/4. Blindedscoring wykonały dwie osoby, gdzie „plus” to 1; „plus plus” to 2, „plus plus plus plus” to 3, a „plus plus plus plus” to 4. Trzy pola obserwacyjne mikroskopu (powiększenie × 200) zostały losowo wybrane dla każdej sekcji, przy czym średni poziom próbek został użyty jako poziom półilościowy.

Eksperymenty komórkowe

Komórki HSC-T6 wysiano na płytkę 96-studzienkową. Początkowo komórki hodowano w DMEM zawierającym 10% FBS przez 48 godzin. Następnie pożywkę zastąpiono DMEM bez FBS, aby zagłodzić komórki przez 12 godzin. Komórki następnie hodowano w DMEM, który zawierał 5,0 ng/mLTGF- 1 (bez FBS) przez 24 godziny. Wreszcie, różne stężenia CPhG (100ug/ml, 50ug/ml i 25ug/ml), akteozyd (6 ug/ml, 3 ug/ml i 1,5 ug/ml), andechinakozyd (500ug/ml, 250ug/ml, i 125ug/ml) przeprowadzono na płytce w czterech powtórzeniach studzienek i inkubowano przez 48 godzin.

Analiza PCR w czasie rzeczywistym

Poziom ekspresji mRNA NF-κB, p65 i kolagenu określono metodą PCR w czasie rzeczywistym. Aby określić ekspresję mRNA w komórkach HSC-T6, komórki (4 × 105komórki) wysiano na sześciostudzienkowych płytkach z 3 ml DMEM z 10% FBS i inkubowano przez noc w 37°C i 5% CO2, po czym pożywkę do hodowli komórkowej zmieniono na DMEM bez surowicy. Następnie CPhG (100 ug/ml, 50 ug/ml i 25 ug/ml), akteozyd (6 ug/ml, 3 ug/ml i 1,5 ug/ml) oraz echinakozyd (500 ug/ml, 250 ug /ml i 125ug/ml) do studzienek. Po 48 godzinach inkubacji z CPhG lub kompozycjami monomerycznymi, całkowity RNA wyekstrahowano przy użyciu odczynnika TRIzol (Invitrogen, USA) i energicznie mieszano z chloroformem przez 15 sekund. Po umieszczeniu w temperaturze pokojowej przez 3 min, lizat odwirowano przy 12 000 x g przez 15 min w 4 stopniach. RNA w fazie wodnej wytrącono izopropanolem i górną fazę wodną przeniesiono do nowej probówki do mikrowirówki. RNA wytrącono przez dodanie 0,75% etanolu, po czym probówkę do mikrowirówki wirowano przy 12,000 x gw 4 stopniach przez nie więcej niż 5 minut. Supernatant usunięto i RNA suszono w temperaturze pokojowej przez 5-10 min. Specyficzne zestawy starterów (Sangon, Szanghaj, Chiny), które zastosowano do amplifikacji szczurzej aktyny [GenBank: NM_031144.3], Kolagen I [GenBank: NM_ 053304.1] i NF- Geny κB p65[GenBank: NM_199267.2] zostały zaprojektowane przy użyciu startera 3 partii. GGG ACT TCT TGAGGT TGC CA), NF-κB p65 (FW: CAT ACG CTG ACCCTA GCC TG, RV: TTT CTT CAA TCC GGT GGCGA), -aktyna (FW: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GATG, RV: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Wyniki znormalizowano do mRNA genu housekeepinggen -aktyny jako kontroli wewnętrznej i przedstawiono jako względne poziomy mRNA

Reakcje przeprowadzono z 8 µl IQ SYBR GreenSupermix, 1 µl pary starterów 10 pM, 8,5 µl wody destylowanej i 2,5 µl cDNA. Każdą reakcję łańcuchową polimerazy prowadzono w następujących warunkach: 95oC przez 3 min, następnie 40 cykli po 10 s w 95o, 30 s w 55o i 10 s w 55o - 95o dla wydłużenia, a następnie pojedynczy pomiar fluorescencji. Ostateczne wyniki opisano wartościami względnymi (2-ΔΔCt). Obliczenia i analizy zostały przeprowadzone przez System Detekcyjny iQ5 Real-Time PCR.

Analiza Western blot

Poziomy ekspresji białka kolagenu I (Abcam, Cambridge, Wielka Brytania, nr art.: ab34710) określono metodą Westernblotting [z -aktyną (partia: 60008-1-lg; Proteintech, Chiny) jako kontrolą gospodarowania. Ekstrakty całych komórek przygotowano przy użyciu buforu do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) (Thermo Scientific, USA) z 1% koktajlem inhibitorów Haltproteazy (Thermo Scientific, USA) i 1% koktajlem inhibitorów Halt fosfatazy (Thermo Scientific, USA). Stężenie białka mierzono i określano ilościowo metodą Bradforda [18]. Białko (10-50 ug) rozdzielono na 10% żelu SDS-PAGE i przeniesiono na błony PVDF (Millipore, USA). przeciwciało, rozcieńczenie 1:200 lub mysie mAb-aktyny, rozcieńczenie 1:5000) inkubowano w temperaturze 4 stopni przez noc. Odpowiednie Alk-Fos. sprzężone przeciwciała drugorzędowe inkubowano w temperaturze pokojowej. Na koniec membrany przemyto trzykrotnie 1 x Tris-HClsaline z 0,1% Tween 20, a sygnały skanowano i wizualizowano za pomocą systemu obrazowania GEL DOC XR (Bio-Rad). Analizę densytometryczną przeprowadzono na białkach będących przedmiotem zainteresowania i znormalizowano do -aktyny za pomocą oprogramowania GEL DOCImage Studio (Bio-Rad). -aktynę zastosowano jako kontrolę wewnętrzną.

Analiza statystyczna

Do weryfikacji normalności i jednorodności wariancji zastosowano test normalności Shapiro-Wilka oraz test jednorodności wariancji Levene'a. Analiza wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc Tukeya została wykorzystana do zidentyfikowania różnic statystycznych w jednorodnych danych o normalnym rozkładzie. Do analizy danych o nierozkładzie normalnym lub niejednorodnych zastosowano test nieparametryczny Kruskala-Wallisa. Wyniki wyrażono jako średnią ± SD. Istotność ustalono na P < 0.05.="" wszystkie="" dane="" analizowano="" za="" pomocą="" oprogramowania="" spss="" 16.0="" (uniwersytet="" medyczny="">

Wyniki

Ilościowe określenie CPhGsCPhGs wCistanchetubulosazawiera dwaFenyloetanoilglikozydy, echinakozyd i akteozyd, a ich zawartość w CPhG określono metodą analizy HPLC (fig. 1) na odpowiednio 42,71 ± 0,42 procent i 14,27 ± 0,18 procent.

Wskaźniki wątroby i śledziony

Jak pokazano w Tabeli 1, wskaźniki wątroby i śledziony w grupie modelowej były istotnie podwyższone [P < 0.01,="" p="">< 0,05].="" wskaźniki="" wątroby="" i="" śledziony="" dla="" leku="" dodatniego="" bjrg="" i="" cphg="" w="" różnych="" grupach="" dawek="" były="" znacznie="" zmniejszone="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" modelową="" [plwątroba="0.004," plwątroba="0.003," pl="" wątroba="00,005;" pspleen="00,017," pspleen="00,027," pspleen="00,024," pspleen="00,070," odpowiednio].="" wskaźniki="" wątroby="" i="" śledziony="" były="" niższe="" niż="" w="" grupie="">

Wpływ CPhG na aktywność ALT, AST i markery zwłóknienia wątroby

W niniejszym badaniu poziomy enzymów wątrobowych AST i ALT w surowicy były znacząco podwyższone w grupie modelowej, odzwierciedlając uszkodzenie komórek wątroby u szczurów z włóknieniem wątroby wywołanym przez BSA. Jednak eksperymenty wykazały, że leczenie BJRG (600 mg/kg) i CPhG (125, 250 i 500 mg/kg) znacznie zmniejszyło odpowiednio AST[PAST < 0,001,="" past="">< 0,001,="" palt="">< 0,001,="" palt="">< 0,001]="" oraz="" alt="" [palt="0,117," palt="0,139," palt="0,189" ,="" palt="00,255" odpowiednio]="" u="" włóknistych="" szczurów.="" (tabela="">

Poziomy HA, LN, PC i IV-C u szczurów modelowych były znacząco podwyższone [PHA < 0.001,="" pln="">< 0.{{39}="" }01,="" ppciii="0.002," odpowiednio="" piv-c="">< 0,001].="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" modelową,="" poziomy="" odpowiednio="" ha="" [pha="00,009," pha="00,007,PHA=00,009," pha="00,023]," ln="" [odpowiednio="00,011,=00,004" zł,="" odpowiednio="00,026,=00,069]," pc="" iii[p="" pciii="" {{26="" }}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," odpowiednio]="" i="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001]="" u="" szczurów="" były="" znacznie="" zmniejszone="" przez="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" i="" cphg="" w="" różnych="" grupach="" dawek="" (125,="" 250="" i="" 500="" mg/kg).="" )="" (tabela="">

Treści Hyp i TGF- 1

Zawartość kolagenu wykryto również mierząc Hyplevels w tkance wątroby. Jak pokazano w Tabeli 4, średni poziom Hyp w grupie modelowej był znacznie wyższy niż w grupie prawidłowej, ale był znacznie obniżony w grupie BJRG i grupach z różnymi dawkami CPhGs.

Stężenie TGF w wątrobie{{0}} w grupie modelowej u szczurów było znacznie zwiększone [P < 0.001].="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" modelową,="" poziomy="" tgf-="" 1="" dodatniego="" leku="" i="" różnych="" grup="" dawek="" cphg="" były="" znacznie="" obniżone="" [p="" tgf-="" 1="">< 00,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf{{10="" }}="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" odpowiednio].="" wyniki="" podsumowano="" w="" tabeli="">

Badanie histopatologiczne

Obserwacje normalnych skrawków tkanki wątroby wybarwionych H&E i trichromem Massona wykazują wyraźne zraziki wątrobowe i sinusoidy wątrobowe. Struktura tkanki wątroby u szczurów modelowych była zaburzona, a tkanka wątroby i sinusoidy wątroby zostały zastąpione dużą ilością tkanki łącznej. Jednak w grupie leczonej wykryto bardziej prawidłową cytoarchitekturę i mniej tkanki łącznej niż w grupie modelowej.

Barwienie H&E

W grupie prawidłowej obserwowano integralność strukturalną zrazików wątrobowych bez nieprawidłowych obszarów wrotnych i sinusoid wątrobowych. Sznury wątrobowe były ułożone w uporządkowany sposób, z rdzeniem okrągłym i przezroczystym. Jądra znajdują się w centrum komórki, z obfitą cytoplazmą. Jedynie obszar portalu ma niewielką ilość tkanki włóknistej (ryc. 2a).

W grupie modelowej struktura zrazikowa była poważnie uszkodzona. Komórki wątroby wykazywały łagodną wodnistą degenerację, głównie zwyrodnienie balonowe i/lub zwyrodnienie tłuszczowe. Zaobserwowano również powstawanie nacieku komórek zapalnych, rozległy przerost tkanki włóknistej, tworzenie dużej liczby przegrody włóknistej, rozszczepionych zrazików i znaczną proliferację komórek wątroby. zwłóknienie wątroby (ryc. 2b).

W porównaniu z grupą modelową zaobserwowano zmniejszenie nacieku komórek zapalnych w różnych CPhG. Obserwowano również mniejszą martwicę i stłuszczenie komórek wątroby, a także złagodzenie zwłóknienia. CPhGs znacząco łagodził patologię zwłóknienia wątroby wywołanego przez BSA u szczurów, łagodził obrzęk komórek wątroby i skutecznie zapobiegał martwicy hepatocytów i infiltracji komórek zapalnych, co sugeruje, że CPhGs wywiera działanie ochronne na wywołane BSA zwłóknienie wątroby szczura. (Rys. 2c–f).

Barwienie trichromu Massona

W grupie prawidłowej tkanka wątroby była prawidłowa. Obszar portalu wątrobowego wykazywał niewielką liczbę włókien błękitkolagenu, a tkanka wątroby miała prawidłową strukturę (ryc. 3a). W porównaniu z tkanką wątroby z normalnej grupy, tkanka włóknista proliferowana przez listek centralny i rozszerzona do miąższu wątroby. Włókna kolagenowe rozciągały się, łączyły i otaczały cały zrazik i otaczały żyłę centralną. Efekty te, wraz ze zwłóknieniem hepatocytów, uszkodzeniem struktury zrazików, zwłóknieniem okołowrotnym i tworzeniem się pęcherzyków rzekomych (ryc. 3b) dostarczyły dowodów na to, że model został ustalony.

W porównaniu z grupą modelową, włókna kolagenowe w grupie pozytywnej kontroli leku były łagodnie wysunięte na zewnątrz od obwodowego obszaru portalu (ryc. 3c). W porównaniu z grupą modelową, włókna kolagenowe w grupach z różnymi dawkami CPhG były znacznie zmniejszone, proliferacja włókien została zahamowana, a proliferacja tkanki włóknistej w miąższu wątroby znacznie się zmniejszyła. Wyniki te sugerowały, że CPhG chronią szczury przed zwłóknieniem wątroby wywołanym przez BSA (ryc. 3d-f).

Barwienie immunohistochemiczne

Co ważne, ekspresja kolagenu typu I i kolagenu typu III odgrywa zasadniczą rolę w rozwoju zwłóknienia wątroby, a ich powstawanie i odkładanie w tkance wątroby może służyć jako ważny wyznacznik skuteczności przeciw zwłóknieniu wątroby. Wyniki podsumowano w tabeli 5.

Kolagen typu I

Normalna grupa eksprymowała kolagen typu I głównie w naczyniach krwionośnych i obszarze wrotnym. Grupa modelowa zwłóknienie naczyń kolagenowych typu I o wysokiej ekspresji w obszarach wrotnych. W przestrzeni Dissego zaobserwowano wybarwienie kolagenu typu I jako smugę lub niejednolitą dystrybucję. Włókniste przegrody otoczone kolagenem tworzą pseudolobule. W tych eksperymentach utworzyło się mniej przegród włóknistych dla BJRJ (600 mg/kg) i grup z różnymi dawkami CPhGs (125, 250 i 500 mg/kg) [PCol I= 00,002, PCol I {{6 }}.001, PCol I=0.023 i PCol I=0.044, odpowiednio]. Wyniki półilościowe wykazały, że ekspresja ich kolagenu typu I była istotnie niższa w porównaniu z grupą modelową (ryc. 4).

Kolagen typu III

Kolagen typu III był słabo wyrażany w grupie normalnej, a obszary obwodowe otaczające żyły wrotne i wątrobowe wykazywały niewielką ilość drobnych żółtych włókien zamiast ciągłych włókien (ryc. 5a). W grupie modelowej włókna kolagenowe wykazywały szerokie i grube kordy, wskazujące na silną ekspresję, zlokalizowane głównie w obszarze wrotnym i tkance włóknistej (ryc. 5b).

Włókna kolagenowe BJRJ (600 mg/kg) i różne grupy dawek CPhG (125, 250 i 500 mg/kg) były nitkowate i rozmieszczone wokół żyły centralnej i obszarów wrotnych. W porównaniu z grupą modelową włókna kolagenowe były znacznie zmniejszone, barwienie było blade i cienkie, a barwienie immunohistochemiczne było słabo dodatnie (ryc. 5c–f ). Te wyniki półilościowe pokazują, że komórki z dodatnią ekspresją w grupach dodatnich i różnych dawek [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010 i PCol III=00,037 odpowiednio] różniły się od tych w grupie modelowej.

TGF- 1

Wystąpiła niewielka ekspresja TGIF- 1 w normalnych komórkach wątroby szczura. Ekspresja była ograniczona do niewielkiej liczby komórek śródmiąższowych (ryc. 6a). W grupie modelowej ekspresja TGF- 1 była szeroko rozpowszechniona w obszarze wrotnym, przestrzeniach włóknistych, komórkach gwiaździstych wątroby, komórkach zapalnych, ścianie zatok i cytoplazmie. Określony obszar portalu wykazywał silnie pozytywną ekspresję z brązowo-żółtym zabarwieniem (ryc. 6b)

Wystąpiła niewielka ekspresja w obszarze wrotnym i przegrodach włóknistych BJRJ (600 mg/kg) i różnych grupach dawek CPhG (125, 250 i 500 mg/kg). Zakres pozytywnego barwienia w tych grupach był znacznie zmniejszony w porównaniu z grupą modelową. Barwienie komórek śródmiąższowych w przegrodzie włóknistej i cytoplazmie komórek zapalnych uległo zmniejszeniu (ryc. 6c–f). Wyniki półilościowe wykazały, że BJRJ i różne grupy dawek CPhGs [PTGF- 1=00,001, PTGF- 1 <0,001, ptgf-="" 1="00,009," ptgf-="" 1="0." 004]="" były="" znaczące="" w="" porównaniu="" z="" grupą="">

Jak wspomniano wcześniej w artykule, TGF- 1 jest ważną cytokiną w patofizjologii zwłóknienia wątroby, stymulującą produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej [19]. Wykazaliśmy, że poziom TGF- 1 wzrósł w grupie modelowej w sposób zgodny z nasileniem zwłóknienia wątroby. Poziomy ekspresji TGF- 1 w wątrobie były zgodne z poziomami TGF- 1 w surowicy. Wskazuje to, że CPhG mogą znacząco zmniejszać zwłóknienie wątroby z powodu ekspresji TGF- 1 poprzez udział w syntezie i degradacji ECM.

Ekspresja kolagenu typu I, kolagenu typu III i TGF- 1 może wykryć patologiczny proces zwłóknienia wątroby. Ich poziomy ekspresji w grupach leczonych były znacznie zmniejszone i pokazały, że CPhG mogą poprawić aktywność kolagenazy, utrzymując dynamiczną równowagę syntezy i degradacji ECM wątroby, opóźniając w ten sposób i zapobiegając tworzeniu się zwłóknienia wątroby.

Ekspresja NF-κB p65 i kolagenu I po interwencji lekowej w komórkach HSC-T6

W celu scharakteryzowania sygnałów zwłóknienia wątroby, za pomocą testu RT-PCR określono dwa kluczowe geny regulatorowe w wątrobie. Dane wykazały, że komórki tHSC-T6 z grupy kontrolnej miały niższy poziom NF κB i mRNA kolagenu typu I. Odwrotnie, TGF- 1 indukował komórki HSC-T6 do znacznej regulacji w górę mRNA NF-κB (P < 0.01)="" i="" col-i="" (p="">< 0,01),="" z="" poziomami="" wyższymi="" niż="" osoby="" z="" grupy="" kontrolnej.="" w="" obecności="" różnych="" stężeń="" cphg,="" wyniki="" nf-κb="" p65="" [p="" nf-κb="0.001" dla="" 100="" ug/ml,="" p="" nf-κb="0.002" dla="" 75="" ug/ml="" ,="" p="" nf-κb="00,007" odpowiednio="" dla="" 50="" ug/ml="" i="" p="" nf-κb="00,012" dla="" 25="" ug/ml]="" i="" col-i="" [p="" col-i="" {{32="" }}.006,="" p="" col-i="0.009," p="" col-i="0.014," p="" col-i="0.019," odpowiednio]="" wykazały="" zmniejszoną="" ekspresję="" tych="" mrna="" (="" rys.="">

Analiza Western blot poziomu kolagenu I po interwencji lekowej w komórkach HSC-T6

Figura 8 przedstawia poziomy ekspresji białka kolagenu I w komórkach HSC-T6 w różnych grupach doświadczalnych. Poziom ekspresji białka kolagenu I był znacznie obniżony w różnych grupach dawek CPhG (100 ug/ml, 75 ug/ml, 50 ug/ml, i 25 ug/ml) w porównaniu z grupą TGF- 1.

Dyskusja

CPhGs to glikozyd fenyloetanoidowy wyizolowany i oczyszczony z kłącza Cistanche, który jest stosowany jako tradycyjny chiński lek ziołowy. W ostatnich latach wykazano, że CPhGshad posiada potężną zdolność zapobiegania urazom wątroby [20]. Dlatego naszym celem było zbadanie, czy CPhG mają hamujący wpływ na zwłóknienie wątroby wywołane przez BSA zwłóknienie wątroby u szczurów. BJRG jest powszechnie stosowany jako lek terapeutyczny na zwłóknienie wątroby w Chinach. Wykonany jest z muszli żółwi. Radix PaeoniaRubra, Cordyceps Sinensis, Radix isatidis itp. mają działanie uzupełniające Qi i krew, łagodzące zmęczenie, zmiękczające węzły. Ponadto wcześniejsze badania pokazują, że ma on oczywistą funkcję blokowania wczesnego włóknienia wątroby, hamowania proliferacji komórek magazynujących tłuszcz i zmniejszania syntezy kolagenu [21]. W związku z tym w tym badaniu jako pozytywny lek zastosowano BJRG.

Zmiany patologiczne zwłóknienia wątroby u szczurów wywołane wstrzyknięciami BSA są podobne do zmian w marskości wrotnej człowieka [22]. CPhGs w zależności od dawki łagodziły stopień zwłóknienia wątroby i hamowały transformację HSC do komórek podobnych do miofibroblastów, zmniejszały podwyższone poziomy ALT, AST, HA, LN, CIV, TGF- 1 w surowicy i znacznie tłumiły ekspresję kolagenu w surowicy I, kolagen III i TGF- 1 w tkance wątroby.

Etapy zwłóknienia wątroby są skorelowane z tymi poziomami HA, LN i IV-C, które jako markery mogą odgrywać rolę w wykrywaniu stopnia zwłóknienia wątroby [23]. Doniesiono, że HA jest głównym zasobem macierzy zewnątrzkomórkowej. IV-C jako zasadniczy element błony podstawnej będzie syntetyzowany obficie i silnie odkładany we wcześniejszych fazach marskości wątroby. Stężenia LN i IV-C w surowicy są wskaźnikami szybkości obrotu błony podstawnej i pokazują stopień zwłóknienia w obszarze wrotnym i naczyniach włosowatych sinusoidalnych [24]. PC III jest markerem w diagnostyce zwłóknienia wątroby i wczesnej marskości wątroby, ale jej czułość i swoistość nie są wysokie, aw wielu publikacjach nie ma istotnej różnicy między poszczególnymi stadiami zwłóknienia [24, 25]. W badaniu tym uzyskano podobny wynik.

Ponadto, obserwacje H&E i Massona na skrawkach barwionych trichromem wykazały prawidłowe tkanki wątroby z wyraźnymi zrazikami wątrobowymi i zatokami wątrobowymi. Struktura tkanki wątrobowej w grupie modelowej była zaburzona, a tkanka wątroby i sinusoida wątrobowa zostały zastąpione dużą ilością tkanki łącznej. Jednak istotną poprawę zaobserwowano w grupach leczonych w porównaniu z grupą modelową.

Co ważne, ekspresja kolagenu typu I i kolagenu typu III odgrywa zasadniczą rolę w rozwoju zwłóknienia wątroby, którego blokowanie może zapobiegać i leczyć zwłóknienie wątroby. Zatem wytwarzanie i odkładanie w tkance wątroby kolagenu typu I i kolagenu typu III może służyć jako ważny wyznacznik skuteczności przeciw zwłóknieniu wątroby. TGF- 1 jest również ważną cytokiną profibrogenną w uszkodzeniu wątroby i jest biologicznie aktywna z wieloma działaniami farmakologicznymi [26]. Równowaga między tymi działaniami jest wymagana do utrzymania homeostazy tkanek. Nieprawidłowa ekspresja TGF 1 jest zaangażowana w patogenezę chorób wątroby [27, 28]. Wiadomo, że TGF- 1 jest kluczową cytokiną, która bierze udział we wczesnych stadiach zwłóknienia wątroby. Stres oksydacyjny wyzwala TGF- 1, powodując, że ten ostatni stymuluje produkcję i odkładanie ECM [29]. Dlatego jedną ze skutecznych strategii wytwarzania leku przeciw zwłóknieniu wątroby jest identyfikacja środków anty-TGF- 1. Analiza immunohistochemiczna wykazała, że ​​ekspresja kolagenu typu I, kolagenu typu III i TGF- 1 może wykryć patologiczny proces zwłóknienia wątroby. Ekspresja kolagenu typu I, kolagenu typu III i TGF- 1 w leczonych grupach jest zmniejszona, co było znacznie niższe w szczególności w grupie leczonej wysokimi dawkami CPhGs i sugerowało, że CPhGs jest skutecznym kolagenem typu I, kolagenem typu III i inhibitor TGF- 1. Przypuszczalnie CPhGs mogą poprawiać aktywność kolagenazy, utrzymując dynamiczną równowagę syntezy i degradacji ECM, opóźniając w ten sposób i zapobiegając powstawaniu zwłóknienia wątroby.

CPhG nie tylko mogą łagodzić indukowane przez BSA zwłóknienie wątroby u szczurów, ale również mogą być związane z hamowaniem aktywacji HSC in vitro. Uważa się, że aktywacja HSC stanowi kluczowy etap fibrogenezy. W tym badaniu wyniki pokazały, że podawanie CPhG od 25 do 100 µg/ml znacząco osłabiało obniżoną ekspresję NF-κB p65, ekspresję mRNA kolagenu I i ekspresję białka kolagenu I w HSC.

NF-κB odgrywa ważną rolę w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej na infekcję lub bodźce [30]. Nagromadzenie NF-κB w komórkach wątroby może skutkować rekrutacją cytokin/mediatorów zapalnych, indukując w ten sposób rozwój zwłóknienia [31, 32]. Co więcej, kolagen jest również czułym wskaźnikiem, który odzwierciedla stopień zwłóknienia i stanowi około 50% całkowitego białka w włóknistej wątrobie [33]. W rezultacie postulowaliśmy, że mechanizm molekularny przeciwko zwłóknieniu wątroby jest powiązany z dezaktywacją ekspresji NF-κB za pośrednictwem CPhGs, w której korzyść przyczynia się do synergicznej roli łagodzenia immunotoksyczności i stresu zapalnego w tkance wątroby uszkodzonej przez BSA, co dodatkowo koryguje dysmetabolizm do funkcji polepszenia wątroby.

Wnioski

Podsumowując, nasze badania wskazują, że CPhG znacząco osłabiają stopień zwłóknienia wątroby indukowanego przez BSA u szczurów. Jego mechanizm może przynajmniej częściowo wynikać z hamującego wpływu CPhG na skład ECM i stymulacji degradacji ECM i/lub bezpośredniego hamowania syntezy kolagenu typu I, kolagenu typu III oraz ekspresji TGF{{0 }}. Dlatego spodziewaliśmy się, że CPhG mogą być stosowane w produktach opieki zdrowotnej lub w lekach klinicznych do zapobiegania zwłóknieniu wątroby u ludzi. Potrzebne są dalsze badania, aby ustalić skuteczność CPhG jako silnego leku przeciw zwłóknieniu wątroby.

Skróty

CPhG: glikozydy anolowe z cistanche;

BSA: albumina surowicy bydlęcej;

HSC-T6: komórki gwiaździste wątroby;

Hyp: Hydroksyprolina;

BJRG: tabletki CompoundBiejiarangan;

TGF- 1: transformujący czynnik wzrostu 1;

ALT: aminotransferaza alaninowa;

AST: aminotransferaza asparaginianowa;

HA: kwas hialuronowy;

LN: laminina; PC III: prokolagen typu III;

IV-C: kolagen typu IV;

NF-κB: nuklearny wzmacniacz łańcucha lekkiego kappa aktywowanych komórek B;

RT-PCR: łańcuchowa reakcja polimerazy odwrotnej transkryptazy;

SDS-PAGE: Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu.

Konkurujące interesy

Autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów

Wkład autorów

TL, JZ, SPY, LM, MT i SLZ wymyślili i zaprojektowali eksperymenty. SPY, TL i JZ przeanalizowali dane. SPY i JZ napisali manuskrypt. TL, LM i JZ dokonali przeglądu manuskryptu. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję rękopisu.

Potwierdzenie

Badania te były wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (81260624). Autorzy chcieliby wyrazić szczere podziękowania profesorowi Tao Liu za jego sugestie usprawnień w pisaniu tego artykułu.

Dane autora

1 Wydział Toksykologii, Szkoła Zdrowia Publicznego, Uniwersytet Medyczny Xinjiang, nr 393 Xinyi Road, Urumqi 830011 Xinjiang Ujgurski Region Autonomiczny, Chiny. 2Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of MateriaMedica w Xinjiang, Urumqi 830004, Chiny. 3Nie. 140 Xinhua South Road, dystrykt Tianshan, Urumqi 830000 Xinjiang Ujgurski Region Autonomiczny, Chiny.

Kliknij tutaj, aby sprawdzićCistanchetubulosaprodukty

Bibliografia
1. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Aktualny stan nowych terapii przeciwwłóknieniowych u pacjentów z przewlekłą chorobą wątroby. Ther Adv Gastroenterol. 2011;4(6):391–417.
2. Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Komórki gwiaździste wątroby i zwłóknienie wątroby. Compr Physiol. 2013;3(4):1473-92.
3. Hernandez-Gea V, Friedman SL. Patogeneza zwłóknienia wątroby. Annu Rev Pathol. 2011;6:425–56.
4. Sohrabpur AA, Mohamadnejad M, Malekzadeh R. Artykuł przeglądowy: odwracalność marskości wątroby. Apteka Żywnościowa Ther. 2012;36(9):824–32.
5. Raven PH, Zhang LB, Ventenat O. Chińska akademia nauk. Wydanie 23. Chiny: Komitet Redakcyjny Flora of China; 2013. s. 1-16.
6. Komisja Farmakopei Chińskiej Ministerstwa Sanitarnego Chińskiej Republiki Ludowej. Farmakopea chińska, część 1. Chiny: Wydawnictwo Przemysłu Chemicznego; 2010. s. 126.
7. Yan GH, Tian JH, Long BW, Li N. Postęp badańfenyletanoidglikozydyzCistanchetubulosa. Farma Środkowo-Południowa. 2012;10:692-5.
8. Li J, Huang D, He L. Wpływ Rou Cong Rong (Herba Cistanches Deserticolae) na toksyczność reprodukcyjną u myszy wywołaną glikozydem Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J Tradit Chin Med. 2014;34(3):324–32.
9. Xing Y, Liao J, Tang Y, Zhang P, Tan C, Ni H i in. ACE i inhibitory agregacji płytek z Tamarix hohenackeri Bunge (roślina żywicielskaHerbaCistanches) rośnie w Sinkiangu. Pharmacogn Mag. 2014;10(38):111–7.
10. Jia Y, Guan Q, Jiang Y, Salh B, Guo Y, Tu P i in. Złagodzenie zapalenia okrężnicy wywołanego sodem siarczanu dekstranu u myszy za pomocą ekstraktu wzbogaconego w echinakozydCistanchetubulosa. Phytother Res. 2014;28(1):110–9.
11. Wong HS, Ko KM. Herba Cistanches stymuluje komórkowy cykl redoks glutationu przez reaktywne formy tlenu generowane z oddychania mitochondrialnego w kardiomiocytach H9c2. Farmacja Biol. 2013;51(1):64–73.
12. Zhang SJ, Liu L, Yu JY. ARP: Metoda RP-HPLC do równoczesnego oznaczania echinakozydu i akteozydu w Herbie Cistanches. Chin Pharm J 2004; 39(10): 740-741.
13. Zhu QG, Fang BW, Zhu QN, Wu HS, Fu QL. Badanie zwierzęcego modelu odporności na zwłóknienie wątroby wywołane albuminą surowicy bydlęcej. Chin J Pathol. 1993;22:121-2.
14. Qin DM, Wen ZP, Nie YR, Yao GM. Wpływ ekstraktów z Cichorium glandulosum na zwłóknienie wątroby wywołane przez CCl4-. Iran Czerwony Półksiężyc Med J. 2013;15, e10908.
15. Niu HM, Zeng DQ, Long CL, Peng YH, Wang YH, Luo JF i in. Diterpenoidy Clerodane i prenylowane flawonoidy z Dodonaea viscosa. J Asian Nat Prod Res. 2010;12(1):7-14.
16. Li WW, Piosenka XW, Wang HW, Shen BS, Wang QC. Korelacja NF-κB i patologicznego zaawansowania zwłóknienia wątroby u pacjentów z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu B. Chin J Immunol. 2013;29(3):251–4.
17. Zhang GL, Shi XF, Ran CQ, Xu M, Zhu ZJ. Skutki całkowitej saponin Panax notoginseng przeciwko zwłóknieniu wątroby u szczurów. Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiary. 2007;29:2212–4.
18. Rossi O, Maggiore L, Necci F, Koberling O, MacLennan CA, et al. Porównanie testów kolorymetrycznych z ilościową analizą aminokwasów do oznaczania ilościowego białek uogólnionych modułów dla antygenów błonowych (GMMA). Mol Biotechnol. 2015;57(1):84–93.
19. Dang SS, Li YP. Postępy w zrozumieniu roli transformującego czynnika wzrostu- 1 w patogenezie zwłóknienia wątroby. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2010;18:1631–6.
20. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z i in. Ochronny wpływ akteozydu na immunologiczne uszkodzenie wątroby wywołane przez Bacillus Calmette-Guerin plus lipopolisacharyd. Planta Med. 2009;75(14):1463-9.
21. Yang FR, Fang BW, Lou JS. Wpływ tabletek Fufang Biejia Ruangan na zwłóknienie wątroby in vivo i in vitro. Świat J Gastroenterol. 2013;19(32):5326–33.

22. Liu P, Fang BW, Liu C. Rola transformującego czynnika wzrostu 1 i jego receptora w indukowanej immunologicznie fibrogenezie wątroby u szczurów i wpływ na nie polisacharydu kordycepsu. Chin J Hepatol. 1998;6:232–3.

23. Xu GG, Luo CY, Wu SM, Wang CL. Związek między etapami wątrobyzwłóknienie i poziomy biochemii surowicy. HBPD WN. 2002; 1:246-8.Ty i in. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Strona 12 z 13

24. Liu J, Wang JY, Lu Y. Markery zwłóknienia surowicy w diagnostyce zwłóknienia wątroby. PodbródekJ Stażysta Med. 2006;145:475–7.

25. Li CZ, Wan MB, Zeng MD, Mao YM, Fan ZP, Cao AP i in. Wstępne badanie kombinacji parametrów nieinwazyjnych w diagnostyce zwłóknienia wątroby. Chin J Hepatol. 2001;9:261–3.

26. Chen YL, Li ZY. Związek między TGF- 1, PDGF-BB, CTGF i przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu B ze zwłóknieniem. Chin J Diffic Compl Cas. 2010;9:19-20.

27. Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, Ammanniti S, Pompili S, Melideo D i in. Ekstrakty z Boswellia serrata i Salvia miltiorrhiza zmniejszają indukowane przez DMN zwłóknienie wątroby u myszy poprzez regulację w dół TGF-beta1. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012;16(11):1484–98.
28. Liu L, Li XM, Chen L, Feng Q, Xu LL, Hu YY i in. Wpływ gypenozydów na szlak TGF- 1/Smad w zwłóknieniu wątroby wywołanym przez tetrachlorek węgla u szczurów. Stażysta J Integr Med. 2013; 1:1–6.
29. Zhang BJ, Xu D, Guo Y, Ping J, Chen LB, Wang H. Ochrona przez mechanizm antyoksydacyjny berberyny przed zwłóknieniem wątroby szczura wywołanym przez wiele czynników hepatotoksycznych. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2008;35(3):303–9.
30. Tornatore L, Thotakura AK, Bennett J, Moretti M, Franzoso G. Ścieżka sygnalizacyjna czynnika jądrowego kappa B: integracja metabolizmu ze stanem zapalnym. Trendy Biol. 2012;22(11):557–66.
31. Luedde T, Schwabe RF. NF-κB w uszkodzeniu wątrobowym, zwłóknieniu i raku wątrobowokomórkowym. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011;8(2):108-18.
32. Petrasek J, Csak T, Szabo G. Receptory Toll-podobne w chorobach wątroby. Adv Clin Chem. 2013;59:155-201.
33. Wang Y, Cheng M, Zhang B, Nie F, Jiang H. Suplementacja diety sokiem z jagód zwiększa ekspresję metalotioneiny w wątrobie i łagodzi zwłóknienie wątroby u szczurów. PLoS Jeden. 2013;8, e58659.