Wcześniejsze uczenie się strachu umożliwia szybką asymilację nowych wspomnień strachu bezpośrednio do sieci korowych Część 3

Eksperymentalny projekt

Powtarzalność danych oceniano przy użyciu różnych replik (tabela S1). Pierwsze eksperymenty z inaktywacją CNQX w Te2 (ryc. 1A – 1C) przeprowadzono w większej liczbie powtórzeń, ponieważ były to pierwsze eksperymenty, które przeprowadziliśmy i posłużyły do ​​przetestowania głównej hipotezy naszego badania. Zwierzęta przypisano a priori do różnych grup behawioralnych w sposób zrównoważony pod względem masy. Samce z tego samego lęgu przydzielono losowo do każdej grupy doświadczalnej. Najpierw zajęliśmy się główną hipotezą naszego badania, tj. inaktywacja kory może w różny sposób wpływać na konsolidację nowego wspomnienia strachu u szczurów, które nie miały wcześniej doświadczenia ze strachem, oraz u zwierząt, które nauczyły się wcześniejszego zdarzenia związanego ze strachem.

Samce mają niezwykle silną pamięć, ponieważ mają silniejszy instynkt przetrwania i chęć rozmnażania się. Zwierzęta żyjące na wolności muszą pamiętać wiele informacji geograficznych, rodzajów pożywienia, śladów drapieżników i lokalizacji członków grupy, aby lepiej przystosować się do środowiska i chronić życie.

Na przykład samce lwów muszą pamiętać status całego terytorium, relacje członkowskie i lokalizacje konkurentów, aby chronić terytorium i swój status. Aby przetrwać i rozmnażać się, samce zebr muszą pamiętać lokalizację źródeł wody i pożywienia na użytkach zielonych. Firma produkująca napoje gazowane wypuściła kiedyś reklamę pokazującą, że samiec niedźwiedzia polarnego pamięta nurka i jego niepowtarzalny zapach, dzięki czemu może go zidentyfikować, gdy następnym razem go zobaczy.

Dlatego samce muszą mieć dobrą pamięć w zakresie ochrony swojego terytorium, zapewniania wystarczającej ilości pożywienia i reprodukcji potomstwa. To czyni je również ważnymi przedmiotami badań na ludziach, na przykład w celu zbadania chorób takich jak upośledzenie pamięci i choroba Alzheimera.

W świecie ludzi inspirację możemy czerpać także ze wspomnień samców zwierząt. Ciągły kontakt z nowymi rzeczami, ciągłe uczenie się i myślenie mogą poprawić naszą pamięć i zdolności adaptacyjne, a także poprawić nasz standard życia i wydajność pracy. Dlatego uczmy się od samców, kontynuujmy gromadzenie wiedzy i doświadczenia, miejmy silny instynkt przetrwania i pragnienia reprodukcyjne oraz twórzmy lepszą przyszłość. Widać, że musimy poprawić naszą pamięć. Cistanche desericola może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche desericola to tradycyjny chiński materiał leczniczy o wielu unikalnych efektach, z których jednym jest poprawa pamięci. Skuteczność mięsa mielonego wynika z różnych zawartych w nim składników aktywnych, w tym kwasów, polisacharydów, flawonoidów itp. Składniki te mogą na różne sposoby promować zdrowie mózgu.

Kliknij i poznaj sposoby na poprawę funkcjonowania mózgu

W przypadku różnic statystycznych między tymi grupami ostatecznie wykonaliśmy dodatkowe grupy kontrolne poprzez wstrzyknięcie soli fizjologicznej. Podobne podejście zastosowano do eksperymentów optogenetycznych, w których grupę kontrolną AAV przeprowadzono dopiero po wykryciu statystycznych różnic między szczurami naiwnymi i wcześniej wyszkolonymi. Te harmonogramy doświadczeń pozwoliły nam uniknąć niepotrzebnych grup kontrolnych i wykorzystania niepotrzebnych zwierząt, co jest kluczową kwestią w europejskim i włoskim ustawodawstwie dotyczącym doświadczeń na zwierzętach (zasada 3 R).

Procedury behawioralne

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w jasnej fazie dnia (od 8:00 do 16:00). Zwierzęta transportowano pojedynczo z obiektu do pomieszczeń doświadczalnych w różnych małych przezroczystych wiaderkach, w zależności od wymagań eksperymentalnych.

Trening słuchowy: Pierwsza sesja behawioralna. Zwierzęta uwarunkowane słuchowo strachem (CS1-CS2). W tej grupie szczury delikatnie wyjęto z klatki domowej i przeniesiono z pomieszczenia mieszkalnego do pomieszczenia dźwiękoszczelnego. Tam zwierzęta umieszczono w aparacie kondycjonującym składającym się z prostokątnej czarnej klatki (35 × 40 cm) wyposażonej w siatkę z prętów ze stali nierdzewnej (o średnicy 1 cm w odstępach 1,5 cm) połączonej z układem dostarczania wstrząsu.

Szczury pozostawiono w spokoju przez 1 minutę. Po tym czasie podano 7 bodźców warunkowych (CS) składających się z czystego tonu o częstotliwości 15 kHz (czas trwania każdy 15 s, 80 dB, interwał próbny 36 s). Ostatnia 1 s każdego tonu została połączona z bolesnym USG (0,5 mA, 1 s). Pod koniec sesji kondycjonowania szczury sprowadzono z powrotem do klatki domowej.

Zwierzęta poddane wyłącznie wstrząsowi (wstrząs-CS2). W tej grupie szczury w podobny sposób umieszczono w tym samym aparacie kondycjonującym. Zaraz potem każdego szczura poddano, jeden po drugim, 7-wstrząsom w stopy (1 s, 0,5 mA). Po zakończeniu stymulacji zwierzęta sprowadzono z powrotem do klatki domowej. Trwałość czasowa w klatce kondycjonującej była mniejsza niż 9 sekund. Wcześniejsze badania wykazały, że zabieg ten pozwala uniknąć procesów skojarzeniowych pomiędzy bodźcami bólowymi i bodźcami sensorycznymi [29,30].

Zwierzęta uwarunkowane strachem węchowym (zapach-CS2). W tej grupie szczury umieszczono w tej samej prostokątnej czarnej klatce, co w powyższych grupach eksperymentalnych i podłączono do układu dostarczania wstrząsu. Szczury pozostawiono w spokoju na 2 minuty. Po tym czasie podano 7 CS składających się z zapachów waniliowych (czas trwania każdy 10 s, przerwa próbna 24 s). Ostatnią 1 sekundę każdego zapachu połączono z bolesnym USG (0,5 mA, 1 s). Moduł kondycjonujący umieszczono w pobliżu źródła wentylacji, aby uniknąć utrzymywania się dostarczonych bodźców po ich przesunięciu. Klatka została zabezpieczona górną kratką. Zapachy prezentowano za pomocą olfaktometru przepływowo-rozcieńczającego. Czyste powietrze (1,5 l/min) kierowane było do elektrozaworu, który po uruchomieniu przepuszczał powietrze do 15 ml butelki zawierającej 10 ml zapachu waniliowego.

Zwierzęta posiadające wyłącznie ton (Tone-CS2). Szczury w tej grupie umieszczono w tej samej czarnej klatce i podawano im ton 15- kHz (7 bodźców, czas trwania 15 s, 36 s ITI) dostarczany bez obecności USA.

Wstępnie naświetlone zwierzęta (Tone-CS1-CS2). Szczury umieszczono w klatce kondycjonującej i 1 minutę później podano im 20 razy sam ton 15- kHz, a 24 godziny później ten sam ton skojarzono z dźwiękiem US, który stał się CS1.

Zwierzęta uwarunkowane strachem białego szumu (WN-CS2). W tej grupie szczury umieszczono w prostokątnej czarnej klatce i pozostawiono w spokoju na 1 minutę. Po tym czasie podano 7 CS składających się z WN (czas trwania 15 s każdy, 75 dB, odstęp między próbami 36 s). Ostatnia 1 s każdego tonu została połączona z bolesnym USG (0,5 mA, 1 s). Pod koniec sesji kondycjonowania szczury sprowadzono z powrotem do klatki domowej.

Uczenie się strachu słuchowego: Drugi trening behawioralny. Dwa tygodnie po procedurach opisanych w powyższym akapicie zwierzęta szkolono w zakresie innego zadania słuchowego warunkowania strachowego. Szczury umieszczono w standardowym pudełku Skinnera, jak w naszej poprzedniej pracy [10] i pozostawiono w spokoju na 2 minuty. Po tym czasie dostarczono 7 CS składających się z czystych tonów o częstotliwości 3 kHz (czas trwania 8 s każdy, 80 dB, przerwa między próbami 22 s). Ostatnia 1 s każdego tonu została połączona z bolesnym USG (0,5 mA, 1 s). Pod koniec sesji kondycjonowania szczury sprowadzono z powrotem do klatki domowej.

Strach przed zatrzymaniem pamięci. Zachowanie słuchowej pamięci strachu niedawno nabytej w CS2 (3 kHz) testowano 4 dni później. W przypadku eksperymentów optogenetycznych test pamięci świeżej przeprowadzono za pomocą lasera 24 godziny po nauczeniu CS2-US, analogicznie do przedziału czasu, w którym przeprowadzaliśmy inaktywację kory poprzez podanie CNQX (tj. 24 godziny po szkolenie). Szczury przyzwyczajano do aparatu innego niż ten używany do warunkowania i umieszczano w innym pomieszczeniu, aby uniknąć zachowań związanych ze strachem warunkowym na podstawie wskazówek kontekstowych [10,62].

Nowe urządzenie składało się z przezroczystej plastikowej klatki z pomalowaną na czarno stroną, zamkniętej w dźwiękochłonnej obudowie wyposażonej w wentylator wyciągowy, który eliminował nieprzyjemne zapachy z obudowy i zapewniał hałas tła na poziomie 60 dB. Podczas sesji przyzwyczajającej zwierzęta mogły eksplorować klatkę przez 5 minut dziennie. W dniu testu zapamiętywania strachu, po 2 minutach swobodnej eksploracji, dostarczyliśmy 4 CS2 o częstotliwości 3 kHz (8 s – 22 ITI), po których nie nastąpiło żadne US.

Jeśli wymagało tego zapotrzebowanie eksperymentu, szczury badano następnie pod kątem zatrzymywania odległej pamięci strachu, uzyskanej 2 tygodnie przed drugą próbą słuchowego warunkowania strachem. W tym celu 7 dni po teście zapamiętywania strachu przy tonie 3- kHz zwierzęta umieszczano w nowym środowisku (klatka w czarno-białe paski), a następnie podawano im ton 15- kHz. Zaprezentowano cztery tony w odstępach 36 sekund.

Szkolenie kontekstowe: Pierwsza sesja behawioralna. Kontekstowa grupa warunkowania strachem (CtxA-CtxB). W tej grupie szczury delikatnie wyjmowano z klatki domowej, umieszczano w wiadrze i przenoszono z pomieszczenia mieszkalnego do pomieszczenia dźwiękoszczelnego. Tam zwierzęta umieszczono w aparacie kondycjonującym składającym się z wyżej wymienionej prostokątnej czarnej klatki, wyposażonej w siatkę z prętów ze stali nierdzewnej, połączoną z układem dostarczającym wstrząsy. Szczury pozostawiono w spokoju przez 1 minutę. Po tym czasie podano 5 US (0,5 mA, 1 s) w odstępach czasu wynoszących 51 s. Na koniec sesji zwierzęta sprowadzono z powrotem do klatki domowej.

Grupa tylko do wstrząsu (wstrząs-CtxB). Szczury umieszczone w aparacie kondycjonującym natychmiast otrzymywały 5-wstrząsy w stopy (1 s, 0,5 mA), jeden po drugim. Trwałość czasowa w klatce kondycjonującej była mniejsza niż 7 sekund. Wcześniejsze badania wykazały, że zabieg ten pozwala uniknąć procesów skojarzeniowych pomiędzy bodźcami bólowymi i bodźcami sensorycznymi [29,30].

Grupa tylko do wstrząsu (wstrząs-CtxB). Szczury umieszczone w aparacie kondycjonującym natychmiast otrzymywały 5-wstrząsy w stopy (1 s, 0,5 mA), jeden po drugim. Trwałość czasowa w klatce kondycjonującej była mniejsza niż 7 sekund. Wcześniejsze badania wykazały, że zabieg ten pozwala uniknąć procesów skojarzeniowych pomiędzy bodźcami bólowymi i bodźcami sensorycznymi [29,30].

Nowe kontekstowe warunkowanie strachu i niedawne zatrzymywanie pamięci o strachu. Dwa tygodnie po procedurach opisanych w powyższym akapicie wszystkie grupy zostały przeszkolone w zakresie kojarzenia nowego środowiska kontekstowego (moduł skrzynki Skinnera umieszczony w innym pomieszczeniu) z bolesnym USG (0,5 mA, 1 s) . Każde zwierzę umieszczono w nowej komorze i pozostawiono w spokoju na 2 minuty. Następnie poddano go działaniu 5 US w odstępach 30 sekund.

Zachowywanie kontekstowej pamięci strachu badano 4 dni po procedurze warunkowania strachem, umieszczając szczury ponownie w komorze Skinnera na 3 minuty. W przypadku eksperymentów optogenetycznych test pamięci świeżej przeprowadzono za pomocą lasera 24 godziny po nauczeniu się CtxB-US, analogicznie do przedziału czasu, w którym przeprowadziliśmy inaktywację kory poprzez podanie CNQX (tj. 24 godziny po treningu). Jeśli wymagało tego zapotrzebowanie eksperymentalne, szczury badano następnie pod kątem zachowywania odległej pamięci strachu, umieszczając zwierzęta w kontekście sparowanym z USA na 2 tygodnie przed nowym skojarzeniem.

Zwierzęta przenoszono w dwóch różnych wiadrach do komór kondycjonujących zgodnie z różnymi procedurami kontekstowymi.

Środek zamrażający. We wszystkich procedurach eksperymentalnych ocenę zatrzymania pamięci strachu określano jako reakcję zamrożenia [10], analizowaną jako całkowity brak ruchliwości somatycznej za wyjątkiem ruchów oddechowych. W przypadku każdego zwierzęcia ilość czasu (w sekundach) spędzonego w zamrażaniu mierzono w trybie offline przez 2 niezależnych obserwatorów, którzy nie rozróżniali grup zwierząt.

Zabiegi chirurgiczne

W celu podania wybranych substancji w miejsca docelowe szczury znieczulono izofluranem: indukcję przeprowadzono przy 4% [obj./obj.] w powietrzu medycznym o przepływie 2 l/min i przedłużono do ciągłej ekspozycji przy 2% [obj./obj.]). gdy szczury umieszczono w aparacie stereotaktycznym.

Wykonano nacięcie czaszki i wywiercono małe otwory, aby umożliwić penetrację igły infuzyjnej o rozmiarze 28-. Do podawania substancji użyto strzykawki 10-ul Hamiltona zamontowanej na pompie infuzyjnej. Po infuzji igłę pozostawiono na miejscu na dodatkowe 3 minuty. Następnie nacięcie zamknięto zaciskami ze stali nierdzewnej i zwierzęciu podano podskórny zastrzyk ketoprofenu o działaniu przeciwbólowym/przeciwzapalnym (2 mg/kg masy ciała), po czym zwierzę trzymano w cieple i obserwowano aż do wybudzenia ze znieczulenia.

Podobnie jak w poprzednich badaniach [10,32–34], kaniulacja zwierząt nie była konieczna, a związki aktywne podawano bezpośrednio stereotaktycznie. Procedura ta jest korzystna, ponieważ pozwala uniknąć urazu chirurgicznego nieodłącznie związanego z procedurą kaniulacji trwałej, ograniczając w ten sposób uraz do penetracji pojedynczą igłą [10,32–34]. Rzeczywiście znieczulenie ogólne nie wpływa znacząco na konsolidację pamięci [10,32–34]. Aby zapewnić, że czas podawania związków związany z próbą uczenia się był dokładny, tak aby szczury otrzymywały wybrane związki około 1 godziny i około 1 dnia po treningu, znieczulenie izofluranem indukowano 5 minut przed planowanym momentem wstrzyknięcia, np. o 55 min u szczurów leczonych 60 minut po treningu oraz 23 godziny i 55 minut u zwierząt, którym wstrzyknięto 24 godziny po treningu. Każdego szczura kondycjonowano, a następnie operowano osobno. Zwierzętami należącymi do różnych grup behawioralnych manipulowano w przeplatany sposób.

Selektywny inhibitor receptorów AMPA/kainianowych glutaminianu CNQX ({{0}}cyjano-7-nitrochinoksalina-2,3-dion) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] rozpuszczono w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (NaCl, 0,9%) i pH doprowadzono do 7,4 za pomocą HCl. Inhibitor syntezy białek, anizomycynę (Merck, 125 ug/ul) rozpuszczono w równomolowym HCl, rozcieńczono sterylną solanką i doprowadzono pH do 7,4 za pomocą NaOH. Jako kontrolę nośnika zastosowano jałową sól fizjologiczną (0,9% NaCl). Substancje te wstrzykiwano obustronnie z szybkością 0,1 ul/min i objętością 0,5 ul na miejsce, pod następującymi współrzędnymi stereotaktycznymi zaczerpniętymi z atlasu Paxinos i Watsona [26], z polem korowym Te2 odniesionym do atlasu Zillesa [25]:

Wtórna kora słuchowa (Te2): 1) AP: –5,8 L: ±7,2 DV: –6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Przednia kora obręczy (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Objętość wstrzyknięcia (0,5 ul na miejsce) dobrano na podstawie wcześniejszych badań, w których wstrzykiwano związki aktywne w Te2 [10,34] i ACC [55,63] u dorosłych szczurów.

Aby inaktywować hipokamp grzbietowy, wstrzyknięto aktywne związki w objętości 0,6 ul na miejsce, pod następującymi współrzędnymi stereotaktycznymi:

Hipokamp grzbietowy: 1) AP: –2,8 L: ±1,6 DV: –3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Nieodwracalne uszkodzenia hipokampa grzbietowego wywołano przez podanie NMDA (Tocris, 18 µg/ul, rozpuszczony w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, 0,4 ul na miejsce) z szybkością 0,1 ul/ min w punktach o ww. współrzędnych. Te same współrzędne zastosowano w przypadku zwierząt kontrolnych, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną i zwierząt poddanych pozorowanej operacji.

Czerwone Retrobeads (Lumafluor, rozcieńczenie 1:2 w soli fizjologicznej, 0,6 ul) wstrzyknięto do BLA zgodnie z następującymi współrzędnymi: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8,3.

Na zakończenie doświadczeń zweryfikowano histologicznie ślady igieł w przypadku iniekcji CNQX, anisomycyny lub soli fizjologicznej oraz rozległość zmian w przypadku iniekcji NMDA. Szczury głęboko znieczulono i poddano dosercowej perfundacji 4% formaldehydem. Ich mózgi pocięto na kriostat o grubości 30 µm. Przygotowano seryjne skrawki barwione Nisslem stosując konwencjonalną procedurę, a skrawki weryfikowano histologicznie pod mikroskopem powiększonym 2,5x.

Eksperymenty optogenetyczne

Zastrzyk wirusa. Wirus związany z adenowirusem AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cherry i wektor kontrolny AAV5:CaMKII-cherry uzyskano z Vector Core Uniwersytetu Północnej Karoliny (Chapel Hill, Karolina Północna, Stany Zjednoczone Ameryki). Zdanie Miano wirusa wynosiło 5:8 Miano wirusa wynosiło 5,8 × 10^12 vg/ml dla obu wirusów. Zastosowanie promotora CaMKII umożliwia ekspresję transgenu faworyzującą neurony piramidowe. Wirusy trzymano w zamrażarce o temperaturze -80˚C. Wlewy wirusowe ukierunkowane na Te2 lub ACC przeprowadzono przy powyższych współrzędnych stereotaktycznych w objętościach 0,5 ul na każdy otwór. Wirusa wstrzykiwano z szybkością 0,1 ul/min i igłę pozostawiono na miejscu przez dodatkowe 5 minut. Zastrzyki wirusowe wykonano na 4 tygodnie przed eksperymentami optogenetycznymi.

Oświetlenie.

Włókna światłowodowe (Plexon, rdzeń 200/230 μm; długość 10 mm) wszczepiono obustronnie do BLA (AP=-2,8, L=± 5,4, V=-8,2 mm z Bregmy). Optogenetyczne hamowanie projekcji Te2 do BLA lub projekcji ACC do BLA uzyskano stosując system stymulacji optogenetycznej PlexBright sprzężony z diodą laserową (Laserglow Technologies). Generowane jest światło żółte (589 nm), które przepuszczane jest przez światłowód. Gęstość mocy szacowana na końcówce światłowodu wynosiła od 10 do 15 mW dla oświetlenia miejsc projekcyjnych. Podczas zapamiętywania strachu emisja światła została zainicjowana 4 sekundy przed początkiem tonu, trwała przez cały czas trwania tonu i została zatrzymana 4 sekundy po przesunięciu tonu. Zwierzęta należące do grup kontekstowego warunkowania strachem otrzymały stymulację światłem podczas całej eksploracji kontekstu (3 minuty). Szczury zaznajamiano z patchcordem przez 2 dni przed próbą zachowania pamięci.

Immunohistochemia. Po zakończeniu eksperymentów optogenetycznych szczury głęboko znieczulono i poddano śródsercowej perfuzji 4% PAF w celu zbadania dyfuzji wirusa. Mózgi wypreparowano, przechowywano przez noc w temperaturze 4°C i na koniec przeniesiono do 30% sacharozy. Skrawki czołowe (30 µm) pocięto na kriostacie i zebrano w PBS. Swobodnie pływające skrawki inkubowano w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubowano je z pierwotnym mysim przeciwciałem monoklonalnym anty mCherry (rozcieńczenie 1:500, Abcam) w roztworze blokującym przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie skrawki przemyto PBS i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z drugorzędowym fluorescencyjnym przeciwciałem antymysim AlexaFluor-568 (1:600, Invitrogen) rozcieńczonym w PBS. Skrawki przemyto w PBS, zatopiono w pożywce do mocowania zawierającej DAPI (Vector) i zakryto szkiełkiem nakrywkowym.

W podobny sposób zebrano mózgi szczurów, którym podano zastrzyki NMDA. Swobodnie pływające skrawki, po kilku płukaniach, inkubowano z pierwotnym mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-Neun (rozcieńczenie 1:1000, Merck) w roztworze blokującym przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie skrawki przemyto PBS i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z biotynylowanym końskim przeciwciałem przeciwko mysim (rozcieńczenie 1:200, Vector). Kompleks awidyna-biotyna (kompleks ABC 1:100, Vector, 2 godziny i połowa inkubacji) połączono z diaminobenzydyną (0,03%, Merck) w celu wybarwienia Neuna. Skrawki następnie przepłukano w PBS i przeniesiono na szkiełka pokryte żelatyną, odwodniono i przykryto szkiełkiem nakrywkowym.

Skrawki Te2 szczurów, którym wstrzyknięto kulki retro, inkubowano z pierwotnym króliczym przeciwciałem anty-Fos (1:2,000, Cell Signaling) w roztworze blokującym przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie skrawki przemyto PBS i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z antykróliczym Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, w PBS). Na koniec znakowane immunologicznie skrawki przemywano PBS, osadzano na szkiełkach pokrytych żelatyną i przykrywano środkiem do mocowania uzupełnionym DAPI.

Mikroskopia

Znakowanie mCherry badano za pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss Airyscan: zastosowano dwa lasery (405 i 561 nm), każdy odpowiadający szczytowemu widmu emisji dla DAPI (barwienie Nissla dla jąder komórkowych) i Alexa 568 (mCherry ), odpowiednio. Aby przeanalizować rozprzestrzenianie się wirusa w miejscach wstrzyknięcia, uzyskano mikrografie Te2 i ACC w postaci obrazów mozaikowych (każdy pojedynczy uzyskano przy użyciu obiektywu 10×). Końcówki aksonów w BLA analizowano przy użyciu obiektywu 40 × jako stosu Z składającego się z 10 przekrojów, oddalonych od siebie o 1 μm (kwadrat 159 μm; ułamek powiększenia, 1,0).

W przypadku zwierząt, którym wstrzyknięto retrobeads i które przeszły znakowanie immunologiczne cFos, uzyskano obrazy przy powiększeniu 40× (159 μm kwadrat; ułamek powiększenia, 1,0) za pomocą 3 różnych laserów, odpowiadających szczytowemu widmu emisji odpowiednio dla DAPI (barwnik Nissla dla jąder komórkowych), AlexaFluor 488 (cFos) i Texas Red (Retrobeads). Pobrano przekroje o grubości 0,7 µm wzdłuż stosu z o wartości 10-µm. Liczbę jąder wyrażających cFos, kulki znakowane i podwójnie dodatnie (kulki znakowane cFos+) określono ilościowo dla każdego zwierzęcia w regionie Te2 w współrzędnych przednio-tylnych od 6,7 do 7,3 mm od bregmy [10]. Dane następnie uśredniono w celu uzyskania średniej dla każdego zwierzęcia, a wyniki porównano statystycznie. Obrazy skrawków Neuna barwionych DAB analizowano przy użyciu oprogramowania Neurolucida połączonego z mikroskopem za pomocą kolorowej kamery CCD [10].

Analiza danych i kryteria wykluczenia

Wartość n dla każdej grupy została ustalona a priori zgodnie z naszymi wcześniejszymi badaniami [10,16,17], wcześniej opublikowanymi pracami w tej dziedzinie (patrz odniesienia do ACC [6,22,55] i Te2 [10,59]), oraz poprzez szacunki mocy G, zgodnie z poniższą tabelą (Tabela 1):

Dla każdej analizy oszacowaliśmy ostateczną średnią liczbę 8 do 10 zwierząt w każdej grupie. Grupy badano z kontrolą wewnętrzną w tej samej sesji eksperymentalnej (tabela S1). Biorąc pod uwagę zmienność procedur chirurgicznych i behawioralnych, włączyliśmy a priori większą liczbę pacjentów eksperymentalnych (do 15% więcej), którzy w niektórych przypadkach spełniali kryteria eksperymentalne i zostali włączeni, unikając w ten sposób arbitralnego wykluczenia. W przypadku badań hipokampa, aby ocenić wpływ zastrzyków NMDA i CNQX w różnych odstępach czasu, zbilansowaliśmy całkowitą liczbę zwierząt kontrolnych pomiędzy szczurami z nośnikiem i szczurami z operacją pozorowaną w różnych grupach.

Analizę behawioralną, badania histologiczne i liczenie komórek przeprowadzono na ślepo. Zwierzęta z nieodpowiednią lokalizacją śladu igły lub zmiany w przypadku zmian nieodwracalnych NMDA zostały wyłączone z analizy danych (tabela S1). Z badań farmakologicznych wykluczyliśmy 57 zwierząt z łącznej liczby 465 zwierząt z powodu nieprawidłowego umieszczenia igły (22/255 dla Te2, 31/179 dla ACC i 4/31 dla hipokampa). W badaniach śledzenia na 21 zwierzętach wyeliminowaliśmy 3 osobniki, u których wstrzyknięcie retroperełek ominęło BLA. W badaniach optogenetycznych Te2 łącznie na 30 zwierzętach wykluczyliśmy 1 szczura, ponieważ położenie włókien światłowodowych nie znajdowało się powyżej obszaru docelowego, 1 szczura. Ostatecznie wirusa nie było w Te2 i 2 szczurach, ponieważ dyfuzja wirusa wynosiła odpowiednio mniej niż 4,7% i 5,3% powierzchni Te2 w miejscach wstrzyknięcia. U szczurów objętych analizą statystyczną minimalna dyfuzja wirusa wyniosła 39,6% w przypadku bardziej przedniej współrzędnej stereotaktycznej i 50,2% w przypadku bardziej tylnej współrzędnej stereotaktycznej.

Podobnie w eksperymentach optogenetycznych ACC na łącznie 32 zwierzętach wyeliminowano 2 szczury, ponieważ położenie włókien światłowodowych nie znajdowało się powyżej obszaru docelowego. Dwa szczury wykluczono ze względu na brak wirusa w ACC, 1 zwierzę ze względu na obecność wirusa w sąsiadującej wtórnej korze ruchowej i 1 szczur ze względu na to, że dyfuzja wirusa wynosiła mniej niż 2,3% powierzchni ACC w miejscach wstrzyknięcia. U pozostałych szczurów minimalna dyfuzja wirusa wyniosła 33,3% w przedniej współrzędnej stereotaktycznej i 42,2% w tylnej współrzędnej.

W badaniach zmian NMDA zmiany dotyczyły głównie obszaru CA1 hipokampa grzbietowego. Minimalne (czerwone) i maksymalne rozszerzenie (różowe) zmian w hipokampie na całym obszarze hipokampa grzbietowego wynosiło odpowiednio 23,2% i 53,5% w bardziej przedniej współrzędnej stereotaktycznej oraz 28,3% i 62,3% w tylnej współrzędnej. W sumie na 73 zwierzętach 4 szczury wyeliminowano ze względu na brak zmian chorobowych, natomiast dodatkowe 3 zwierzęta odrzucono, ponieważ zasięg zmian był mniejszy niż 5,0% (tj. 4,8%, 4,3%, 3,1 %) dotyczące obszaru hipokampa na 2 współrzędnych.

Analizę konturu obszaru przeprowadzono poprzez kontrolę wizualną i ręczną ocenę ilościową przy użyciu narzędzia konturu regionu w oprogramowaniu ZEN 3.0. Następnie wartości powierzchni znormalizowano w stosunku do całkowitej powierzchni regionu. Współrzędne stereotaktyczne Te2, ACC i hipokampa wyznaczono na podstawie atlasu Paxinos [26], a w przypadku Te2 na podstawie pola korowego odniesiono do atlasu Zillesa [25].

Analiza statystyczna

Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Wszystkie dane przeszły test Levene’a na równość wariancji. Dlatego we wszystkich eksperymentach zastosowano statystykę parametryczną. Dane z 2 grup porównano za pomocą 2-dokładnych niesparowanych testów t-Studenta. Porównania wielogrupowe oceniano za pomocą 1-testu ANOVA z testem post hoc Tukeya. Aby uwzględnić różnice pomiędzy grupami i wewnątrz grup, obliczyliśmy model ANOVA o mieszanym projekcie 3 × 2 z grupą (CS1-CS2, Ton-CS1-CS2, WN-CS2) jako wartością pomiędzy- zmienna osobnicza i stan (przed i po niedawnym kondycjonowaniu + wstrzyknięciu) jako zmienna wewnątrzobiektowa. Tam, gdzie interakcja grupa × warunek była znacząca, przeprowadziliśmy prostą analizę efektów głównych i dostosowaliśmy każdą wartość p za pomocą poprawki Bonferroniego. Dla każdego mieszanego modelu ANOVA oceniliśmy założenie sferyczności za pomocą testu sferyczności Mauchly'ego.

Parametry statystyczne (tj. dokładna wartość n dla każdej grupy, SEM, test statystyczny, wielkość efektu i dokładna wartość p) są podane w legendach. Dla równych wielkości próbek wielkości efektów dla niesparowanych testów t określono poprzez obliczenie d Cohena lub d Glassa zgodnie z podobieństwem SD, natomiast dla różnych wielkości prób - g Hedgesa. Korelacje między liczbą komórek a zamrożeniem obliczono przy użyciu współczynnika Pearsona. Aby ustalić, czy dane spełniają założenia podejścia statystycznego, odrzuciliśmy hipotezę zerową na poziomie P < 0,05. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu programu SPSS Statistics 22 (IBM).

Informacje pomocnicze

S1 Ryc. Powiększenie śladów igieł Te2 (A) i kory ACC (B), do których wstrzyknięto CNQX, wybrane jako przykłady. (C) Zwierzęta poddane wyłącznie wstrząsowi, przedstawione w tym samym kontekście, wykazały niską reakcję strachu, co pokazuje, że procedura nie wywołała warunkowego zamrożenia w kontekście, w którym zastosowano wstrząs. (D) Podobne wyniki jak na rys. 1 uzyskano przez zrównoważenie 2 tonów zastosowanych jako CS (CS1, 3 kHz i CS2, 15 kHz) (test t-Studenta, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, d Glassa=4.14). (E) U szczurów warunkowanych zapachem CS zamrożenie na zapach, 2 tygodnie po kondycjonowaniu, było wysokie, nawet jeśli testowano je w innym środowisku pod względem kontekstu warunkowania, co pokazało, że strach był specyficznie powiązany z tym dostarczaniem sygnału. Paski skali, 300 µm. ��P < 0,01. Wszystkie dane są średnie i SEM. Dane podsumowujące dla S1 Fig można znaleźć w informacjach pomocniczych w pliku o nazwie S1 Supporting Rysunek Data. (TIF)

S2 Ryc. Zastrzyk CNQX zaburzał zachowanie niedawnych słuchowych wspomnień strachu u szczurów, u których uogólnienie strachu zostało zmniejszone przez sam ton przed ekspozycją lub poprzez zastosowanie tonu białego szumu jako CS1. ANOVA 3 × 2 o mieszanym projekcie (efekt główny grupy: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0.236, efekt główny warunku: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, grupa × interakcja warunków F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) pokazała, że ​​zamrożenie do tonu 3 kHz przed skojarzeniem z USA było mniejsze u zwierząt, które otrzymały wstępną ekspozycję na ton 15 kHz przed parowaniem 15 kHz-US (n=10, p=0.001) lub u szczurów warunkowanych białym szumem (n=13 , p=0.008) w porównaniu ze zwierzętami CS1-CS2 (n=22), które wykazały zmienną reakcję uogólnienia strachu. Jednakże po uczeniu się CS-US i zastrzykach cnqx w korze Te2, pamięć o ostatnim strachu została zaburzona we wszystkich grupach (p > 0,05). Prosty efekt główny w grupach (przed i po uczeniu się CS-US, a następnie wstrzyknięciu cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Ton-CS1-CS2, s.=0.189; WN-CS2, p=0,347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Wszystkie dane są średnie i SEM. Dane podsumowujące dla S2 Fig można znaleźć w informacjach pomocniczych w pliku o nazwie S1 Supporting Rysunek Data. (TIF)

S3 Ryc. (A) Losowy przykład wstrzyknięcia retroperełek ukierunkowanych na BLA. (B i C) Przykłady umieszczenia włókien optycznych powyżej BLA zwierząt, którym wstrzyknięto wektory AAV w korze Te2 (B) i ACC (C). Paski skali, 500 µm.

Podziękowanie

Dziękujemy doktorowi E. Manassero za jego ciągłe wsparcie i rady.

Autorskie Wkłady

Konceptualizacja: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Kurator danych: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Analiza formalna: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Pozyskanie finansowania: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Dochodzenie: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodologia: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Opieka: Benedetto Sacchetti.

Walidacja: Benedetto Sacchetti.

Tekst – wersja oryginalna: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Tekst – recenzja i redakcja: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Bibliografia
1. Frankland PW, Bontempi B. Organizacja wspomnień niedawnych i odległych. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Neurobiologia konsolidacji, czyli jak stabilny jest engram? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Konsolidacja pamięci. Zimna wiosna Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P., Squire LR. Konsolidacja pamięci i przyśrodkowy płat skroniowy: prosty model sieciowy. Proc Natl Acad Sci USA A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Dlaczego w hipokampie i korze nowej istnieją uzupełniające się systemy uczenia się: spostrzeżenia z sukcesów i porażek koneksjonistycznych modeli uczenia się i pamięci. Psychol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com