Ochronny wpływ olejku grasicy serrulatus na nefrotoksyczność indukowaną kadmem u szczurów, poprzez tłumienie stresu oksydacyjnego i regulację w dół ekspresji NF-κB, INOS i Smad2 MRNA
Mar 17, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Mohd Nazam Ansari1,*, Najeeb Ur Rehman1,*, Aman Karim2, Faisal Imam3 i Abubaker M. Hamad4,5
Cistanche deserticola ma na chorobę nerek, kliknij tutaj, aby pobrać próbkę
Abstrakcyjny:
Celem badań było zbadanie ochronnego działania olejku eterycznego z grasicy serru latus Hochst. ex Benth. (olej TSA) przeciwkokadm(Cd)-indukowanenerkowytoksyczność. Protokół eksperymentalny zaprojektowano z wykorzystaniem 30 zdrowych dorosłych szczurów rasy Wistar albinos przydzielonych do grup zawierających po sześć zwierząt w każdej grupie. Grupa 1 była traktowana jako normalna kontrola, a grupy 2, 3, 4 i 5 były traktowanekadmchlorek (CdCl2, 3 mg/kg, IP) przez 7 dni. Grupie 3 podawano również sylimarynę (100 mg/kg PO) jako grupę standardową, podczas gdy grupie 4 i 5 podawano olej TSA w dawkach odpowiednio 100 i 200 mg/kg PO. Nefrotoksyczność mierzono różnymi parametrami, takimi jak:nerkamarkery funkcji, markery stresu oksydacyjnego (glutation (GSH) i dialdehyd malonowy (MDA)) oraz poziom ekspresji informacyjnego kwasu rybonukleinowego (mRNA) czynników zapalnych. W protokole eksperymentalnym oceniono również badania histologiczne. Grupy leczone CdCl2- wykazały znaczny wzrost poziomu surowicynerkamarkery funkcyjne wraz z poziomami MDA w homogenacie nerek. Jednakże,nerkowyStwierdzono, że poziom GSH uległ znacznemu obniżeniu. Stwierdzono, że CdCl2 znacząco podwyższał poziom czynnika jądrowego kappaB(NF-κB p65), indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) i małych matek przeciwko dekapentapletycznym (Smad2) w porównaniu z normalną grupą kontrolną. Z drugiej strony olej TSA znacznie poprawił podwyższone poziomy markerów funkcji nerek w surowicy, nieenzymatycznych przeciwutleniaczy i peroksydacji lipidów. Ponadto olej TSA znacznie obniżał zwiększoną ekspresję NF-κBp65, iNOS i Smad2 u szczurów zatrutych Cd. Ponadto, zmiany histologiczne w próbkach tkanek nerki z grup traktowanych Cd były znacząco złagodzone w grupach traktowanych sylimaryną i olejem TSA. Obecne badanie ujawnia, że olej TSA łagodzi wywołany przez Cdnerkowyuszkodzenia, a także sugeruje się, że obserwowany efekt nefroprotekcyjny może być spowodowany potencjałem przeciwutleniającym oleju TSA i gojeniem się dzięki jego działaniu przeciwzapalnemu.
Słowa kluczowe:kadm; zapalenie; NF-κB; uszkodzenie nerek; Smad 2; Grasica serrulatus
1. Wstęp
Narażenie środowiska na chemikalia pozostaje głównym problemem zdrowia publicznego na całym świecie. W biosferze wzrosło narażenie na kadm (Cd), jeden z najbardziej reaktywnych metali toksycznych, zarówno ze źródeł naturalnych, jak i antropogenicznych [1]. Narażenie na Cd jest również spowodowane zanieczyszczeniem gleby, powietrza, wody i żywności, a także dymem papierosowym [2]. Znacznie zwiększona absorpcja wraz ze zmniejszoną szybkością wydalania prowadzi do zwiększonego obciążenia kadmu w różnych narządach. Cd może uszkadzać wiele narządów w zależności od dawki, drogi i czasu trwania, ale głównie wpływa na:nerkii powoduje zaburzenia czynności nerek [3].
Thenerkisą ważnymi narządami w ludzkim ciele i odpowiadają za różne podstawowe funkcje, w tym usuwanie szkodliwych metabolitów, odpadów azotowych i niektórych leków z moczem [4]. Wcześniejsze badania wykazały, że toksyczność Cd powoduje nieodwracalną dysfunkcjęnerkowykanaliki [5] i powoduje zmniejszone usuwanie toksycznych chemikaliów, leków lub obu, które prowadzą do ostregonerkaawaria. Ponadto,nerkowyuraz spowodowany przewlekłą ekspozycją na Cd może prowadzić do przewlekłej niewydolności nerek, a nieleczony może prowadzić do śmierci [6,7]. Nagromadzenie Cd w proksymalnych kanalikach krętych utrudnia reabsorpcję kanalikową i prowadzi do wielomoczu i białkomoczu. Prowadzono badania nad powszechnym nieprawidłowym wpływem kadmu na czynność nerek, ale nadal brakuje szczegółowych informacji na temat mechanizmów molekularnych i potrzeba dalszego badania tego [8].
Badania z ostatnich kilkudziesięciu lat wykazały, że maksymalne prawdopodobieństwonerkowyuszkodzenie jest spowodowane uwolnieniem Cd w komórce, co wywołuje stres oksydacyjny [9,10]. Jednym z sugerowanych mechanizmów jest zaburzenie naturalnego systemu obrony antyoksydacyjnej, co dodatkowo powoduje nadprodukcję wolnych rodników tlenowych (OFR) [11] i skutkuje obniżeniem poziomu glutationu (GSH), a co za tym idzie apoptozą związaną ze stresem oksydacyjnym [ 12]. Spośród kilku opisywanych mechanizmów, obniżona zawartość GSH i uszkodzenia komórek wywołane przez OFR są głównie odpowiedzialne za peroksydację lipidów [13,14].
W dotychczasowej literaturze stwierdzono również, że korelacja między stresem oksydacyjnym a stanem zapalnym wzmacnia różnenerkowychoroby [15]. Dlatego można zasugerować, że toksyczność nerkowa jest powodowana przez Cd poprzez złożone wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, które są głównie kierowane przez stres oksydacyjny. Czynnik jądrowy-κB (NF-κB) kontroluje kilka genów zapalnych we wszystkich typach komórek [16]. NF-κB jest główną przyczyną różnychnerkachoroby i mogą być aktywowane przez ekspozycję na Cd. Przewlekła choroba nerek została stwierdzona zarówno w modelach ludzkich, jak i zwierzęcych poprzez regulację w górę białek Smad2 [9]. We wcześniejszych badaniach stwierdzono, że obniżenie poziomu NF-κB i Smad2 może być korzystnym mechanizmem działania leków przeciwzapalnych [17].
Wśród strategii leczenia postawiono hipotezę, że łagodzenie stresu oksydacyjnego wywołanego przez Cd za pomocą przeciwutleniaczy ze źródeł naturalnych lub syntetycznych jest uważane za główne możliwe podejście do leczenia nefrotoksyczności wywołanej przez Cd. Dlatego badacze ostatnio poszukiwali mechanizmów obronnych przed toksycznością powodowaną przez chemikalia lub leki, a także rozważali związki biologicznie czynne o działaniu przeciwutleniającym i zapalnym [18,19].
W różnych częściach świata różne gatunki z rodzaju Thymus były tradycyjnie stosowane w leczeniu różnych schorzeń, takich jak zapalenie oskrzeli, astma, krztusiec, zapalenie krtani, zapalenie migdałków i kaszel [20]. Thymus serrulatus Hochst. Ex Benth (rodzina Lamiaceae) rośnie w Etiopii i jest tradycyjnie stosowany w leczeniu grypy [21] i kaszlu [22]. T. serrulatus jest silnie rozgałęzionym, wieloletnim krzewem rosnącym w strefach Afromontane i Afroalpine w Etiopii i Erytrei [23].
Opisano, że T. serrulatus ma działanie przeciwrobacze, przeciwbakteryjne, grzybobójcze [23], moczopędne [22], rozszerzające naczynia [24] i przeciwhiperlipidemiczne [25]. Ponadto doniesiono, że olejek eteryczny z T. serrulatus (olej TSA) ma między innymi właściwości antyseptyczne, przeciwgrzybicze i odrobaczające [26]. Olejek eteryczny rośliny z różnych etiopskich stanowisk wykazał obiecującą aktywność hepatoprotekcyjną u szczurów [27]. Ponadto wcześniejsze badania wykazały, że działanie farmakologiczne olejku eterycznego jest dodatnio skorelowane z obecnością składników aktywnych, takich jak tymol, karwakrol, p-cymen, -terpinen i kwas rozmarynowy [26,27]. Z drugiej strony, tymol i karwakrol, które zostały znalezione jako główne składniki olejku eterycznego, są ważnymi produktami naturalnymi o działaniu wymiatającym wolne rodniki i właściwościach przeciwutleniających [28]. W poprzednim badaniu stwierdzono, że połączenie tymolu i karwakrolu ma synergistyczne działanie nefroprotekcyjne
efekt, który można przypisać działaniom przeciwutleniającym, przeciwzapalnym i przeciwapoptotycznym [29]. Dodatkowo tymol i karwakrol, które zostały znalezione jako główne składniki roślin zawierających olejki eteryczne, również spowodowały spadek immunoglobuliny E (IgE), interleukiny-4 (IL-4), interleukiny{ {6}} (IL-5) i interleukiny-13 (IL-13), a także liczba komórek zapalnych powodujących zaburzenia dróg oddechowych [30].
O ile nam wiadomo, nie opisano wpływu T. serrulatus na nefrotoksyczność. Tak więc w tym badaniu postawiliśmy hipotezę i próbowaliśmy zbadać nefroprotekcyjne działanie olejku eterycznego wyekstrahowanego z T. serrulatus pochodzenia etiopskiego przeciwko nefrotoksyczności indukowanej przez Cd u szczurów Wistar albino poprzez ocenęnerkamarkerów funkcji, markerów stanu zapalnego, statusu antyoksydacyjnego i zmian histologicznych.
2. Wyniki
2.1. Wydajność olejku eterycznego ( procent )
Hydrodestylacja nadziemnej części T. serrulatus dała 00,09% (v/w) jasnożółtego olejku eterycznego o charakterystycznym zapachu.
2.2. Wpływ oleju TSA na biomarkery funkcji nerek
Stwierdzono, że poziomy mocznika we krwi, kwasu moczowego, kreatyniny i azotu mocznikowego we krwi (BUN) były znacząco podwyższone (p < 0="" 0,01)="" u="" szczurów,="" którym="" podawano="" tylko="" cd="" (3="" mg/kg,="" i.p.).="" )="" przez="" 7="" dni.="" jednak="" podawanie="" oleju="" tsa="" i="" sylimaryny="" szczurom="" zatrutym="" cd="" znacznie="" poprawiło="" indukowaną="">nerkauszkodzenia określone przez obniżone poziomy mocznika we krwi, kwasu moczowego, kreatyniny i BUN (ryc. 1A-D).
2.3. Wpływ oleju TSA na peroksydację lipidów i stres oksydacyjny
ThenerkowyTkanka szczurów wykazywała istotnie zwiększony poziom peroksydacji lipidów pod względem MDA i zmniejszenie zawartości GSH po podaniu Cd. Ponadto, leczenie olejem TSA w dawkach 100 i 200 mg/kg obniża poziom MDA w zależności od dawki u szczurów zatrutych Cd. Ponadto poziomy GSH były znacząco podwyższone w grupach traktowanych olejem TSA i sylimaryną w porównaniu z grupą Cd (Figura 2A, B).
2.4. Wpływ oleju TSA na ekspresję mRNA p65, NF-κB, iNOS i Smad2
Zmiany w zdarzeniach sygnalizacyjnych oceniano metodą Western blot. Analiza Western blot sugerowała, że ekspozycja na Cd znacząco (p < 0.001)="" podwyższyła="" ekspresję="" mrna="" nf-κb="" p65,="" inos="" i="" smad2="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" referencyjną.="" traktowanie="" olejem="" tsa="" znacząco="" obniżyło="" ekspresję="" mrna="" p65,="" nf-κb,="" inos="" i="" smad2="" w="" sposób="" zależny="" od="" dawki="" w="" stosunku="" do="" szczurów="" poddanych="" ekspozycji="" tylko="" na="" cd="" (figura="">
2.5. Wpływ oleju TSA na histopatologię
Analiza histopatologiczna szczurów z grupy kontrolnej wykazała normęnerkaarchitektura histologiczna z prawidłowymi kanalikami krętymi, kłębuszkiem i torebką Bowmana z prawidłową przestrzenią, jak również prawidłowym stanem włókien kolagenowych i materiałów wykazujących kwas nadjodowy–Schiffa (PAS), takich jak błona podstawna (ryc. 4). Fotomikrografie grupy toksycznej pokazują nieprawidłowe kłębuszki (G), zwyrodnienie (D) i martwicę (N) zwiniętych kanalików oraz zwyrodniałą i prawie nieobecną przestrzeń Bowmana. Nieprawidłowe zwinięte kanaliki wskazują na rozerwanie histologiczne (T), zablokowane przez uszkodzoną tkankę (B) i martwicę. Zdjęcie grupy toksycznej barwionej trichomem Massona (MT) pokazuje zwiększoną ilość materiałów kolagenowych (C). Ponadto mikrofotografia grupy toksycznej barwionej PAS pokazuje nieprawidłowe odkładanie się materiałów PAS-dodatnich (P), które przemieściły miąższ nerki; wykazuje również osłabienie lub utratę nienaruszonej błony podstawnej (L). Leczenie olejem TSA w małej dawce przywróciło prawidłowe kłębuszki i prawidłowe kanaliki kręte, chociaż nadal występowały niewielkie efekty toksyczne w postaci blokowania kanalików (B) i niewielki wzrost ilości materiału kolagenowego (C), a także nieprawidłowe odkładanie Materiały PAS-dodatnie (P). Traktowanie olejem TSA w wysokiej dawce dało obrazy histologiczne o prawie normalnym wyglądzie histologicznym bardzo zbliżonym do standardowego leczenia (powiększenie 400x i podziałka 20 µm dla wszystkich fotomikrografów).
3. Dyskusja
W środowisku zwykle występują metale ciężkie, które są podatne na wchłanianie, utlenianie i zakłócanie losu komórek. W szczególności kadm jest naturalnym związkiem przemysłowym, który powoduje liczne toksyczne i niebezpieczne skutki, w tym nefrotoksyczność, na zdrowie człowieka [31,32]. Jego odkładanie się w różnych narządach powoduje stres oksydacyjny, który osłabia funkcję natywnego układu antyoksydacyjnego i w efekcie prowadzi do rozwoju różnych ciężkich chorób patologicznych [33]. Ścieżka toksyczności wywołanej przez Cd obejmuje produkcję reaktywnych form tlenu (ROS), które następnie powodują uszkodzenie nerek [34]. Dlatego można przypuszczać, że przeciwutleniacze mogą być dobrym celem dla ewentualnego podejścia terapeutycznego do toksyczności związanej z Cd [35]. W tym raporcie badaliśmy obiecujący łagodzący wpływ oleju TSA na wywołany przez Cd stres oksydacyjny i uszkodzenie nerek na szczurach.
Poważne uszkodzenie nerek wywołane przez Cd może być związane z podwyższonym poziomem mocznika, kwasu moczowego i kreatyniny w surowicy z powodu przecieku do krwioobiegu [36, 37]. W niniejszym badaniu po 7-dniowej ekspozycji na Cd zaobserwowano również znacznie podwyższone poziomy mocznika, kwasu moczowego i kreatyniny w surowicy, co potwierdziło ciężkie uszkodzenie nerek (ryc. 1). Obserwowane wyniki potwierdzają wcześniejsze badania [19,38]. Podawanie oleju TSA w obu dawkach (100 i 200 mg/kg, PO) znacząco poprawia dysfunkcję nerek wywołaną przez Cd, która była wspierana przez obniżony poziom mocznika, kwasu moczowego i kreatyniny w surowicy. W niniejszym badaniu zaobserwowano, że ekspozycja na Cd powoduje:nerkauszkodzenia poprzez zwiększenie peroksydacji lipidów i zakłócenie naturalnego systemu antyoksydacyjnego, co wskazuje na zwiększony stres oksydacyjny. Zaobserwowane odkrycia sugerują, że olej TSA może zapobiegać indukowanym przez Cd zmianom w zmiennych związanych z przeciwutleniaczami u szczurów. Te odkrycia są zgodne z odkryciami Kawamoto et al. [39], który zgłosił zwiększoną peroksydację lipidów po ekspozycji na Cd. Wcześniejsze badania wykazały, że przewlekła ekspozycja na Cd powodowała zmniejszenie antyoksydantów nieenzymatycznych (tkankowego GSH) [40]. Wyniki niniejszego badania potwierdzają wyniki Koyuturka i in. [41], którzy opisali zmniejszoną zawartość GSH w nerkach u szczurów zatrutych Cd. Zmniejszona zawartość GSH może wynikać z jego zużycia w zapobieganiu peroksydacji lipidów wywołanej stresem oksydacyjnym [41] i detoksykacji metali ciężkich [42, 43]. Jednak nasze odkrycia nie zgadzają się z odkryciami Kamiyamy i in. [44], którzy opisali podwyższony poziom nerkowego GSH u szczurów traktowanych Cd. Peroksydacja lipidów i poziom antyoksydantów u szczurów traktowanych Cd były znacząco modulowane po podaniu oleju TSA, co wskazuje na spadek ROS, przywrócenie równowagi systemu obrony antyoksydacyjnej lub jedno i drugie. Odkrycia te potwierdzają te z wcześniejszego badania, które opisywało łagodzący wpływ tymochinonu na chemicznie wywołane uszkodzenie nerek [45].
Apoptoza występuje w tkankach i różni się od martwicy w niektórych zaburzeniach czynnościowych [46]. Apoptoza jest jedną z głównych cech związanych z Cdnerkauraz. Wcześniej opisano, że toksyczność Cd powoduje apoptozę w kanalikach proksymalnych poprzez stymulację szlaku NF-kB, który przyczynia się do dysfunkcji nerek [47,48]. Również w tym badaniu zaobserwowano zwiększoną ekspresję białka NF-kBp65 u szczurów traktowanych Cd. Jednak podawanie oleju TSA szczurom traktowanym Cd zasadniczo przywróciło ekspresję białka NF-kBp65. Obserwowane wyniki są zgodne z wcześniejszymi [18,19]. Zatem hamowanie NF-kB u szczurów zatrutych Cd dowodzi przeciwzapalnej zdolności oleju TSA.
Indukowana syntaza tlenku azotu (iNOS) jest silnie wyrażana w stanach zapalnych i zakażeniach. Jest to zatem istotny składnik adaptacyjnej odpowiedzi gospodarza na szkodliwe bodźce. Wcześniej donoszono, że w uszkodzeniu nerek wywołanym przez Cd pośredniczy synteza tlenku azotu przez stymulację iNOS [49]. W tym badaniu również stwierdzono, że ekspozycja na Cd powoduje zwiększoną ekspresję iNOS (Figura 3B), podczas gdy olej TSA w obu dawkach może znacząco odwrócić ekspresję iNOS u szczurów zatrutych Cd.
Wcześniejsza literatura donosiła, że Cd jest jednym z najbardziej toksycznych metali ciężkich i jest wchłaniany głównie przez kanaliki proksymalne i akumulowany głównie w korze nerkowej, co prowadzi do zmian w proksymalnych kanalikach krętych [50]. Odkrycia te potwierdzają wyniki niniejszego badania. Poważnynerkauszkodzenie zostało zweryfikowane przez obecność znacznego uszkodzenia kłębuszków u szczurów traktowanych Cd. Wyniki te potwierdzają tezy Damka Poprawy i Sawickiej-Kapusty [51], którzy zgłosili atrofię naczyń włosowatych kłębuszków i martwicę kanalików proksymalnych. Ustalenianerkamarkery funkcyjne i markery stresu oksydacyjnego – gdzie olej TSA łagodził zmiany zwyrodnieniowe wywołane przez Cd i poprawiałnerkafunkcja ze względu na możliwe działanie przeciwutleniające i przeciwzapalne – zostało to potwierdzone obserwacjami histopatologicznymi.
4. Materiały i metody
4.1. Chemikalia i odczynniki
Chlorek kadmu (CaCl2) otrzymano z Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA).Nerkazestawy do diagnostyki funkcjonalnej uzyskano z firmy Crescent Diagnostics (Jeddah, KSA). Przeciwciała (pierwotne i wtórne) uzyskano z Santa Cruz (Dallas, TX, USA). Stosowane chemikalia były czystości analitycznej i wysokiej jakości, które nie wymagały dalszego oczyszczania.
4.2. Materiał roślinny i ekstrakcja
Świeże nadziemne części T. serrulatus Hochst. ex Benth został zebrany z obszaru Amba Alajemountain, South Tigray, Etiopia. Materiał roślinny został uwierzytelniony przez botanika, dr. Getineta Masresha z Wydziału Biologii Uniwersytetu Gondar, a okaz został zdeponowany w zielniku uniwersytetu (TH-001/2011).
Świeże nadziemne części pocięto na małe kawałki i poddano hydrodestylacji przez 3 h za pomocą aparatu Clevenger. Hydrodestylację przeprowadzono 11 razy aż do zebrania wystarczającej ilości. Otrzymany olejek eteryczny suszono bezwodnym siarczanem sodu i przechowywano w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze 4◦C do dalszego użycia [26]. Obliczony uzysk olejku eterycznego wyrażono w procentach (procent v/w), w oparciu o masę świeżego materiału roślinnego.
4.3. Zwierząt
Trzydzieści samców szczurów albinosów o wadze 180-220 g uzyskano z Animal House, College of Pharmacy, Prince Sattam Bin Abdulaziz University (PSAU), KSA. Szczury aklimatyzowano przez 1 tydzień i utrzymywano w 12-godzinnych cyklach światło/ciemność w standardowych warunkach laboratoryjnych. W okresie doświadczalnym i aklimatyzacji zwierzęta żywiono paszą granulowaną i swobodnym dostępem do wody. Podczas przeprowadzania wszystkich eksperymentów przestrzegano instrukcji i wytycznych dostarczonych przez jednostkę opieki nad zwierzętami, PSAU, KSA. Protokół został wstępnie zatwierdzony przez Bio-Ethical Research Committee (BERC), PSAU (BERC-004-12-19).
4.4. Projekt eksperymentalny
W celu oceny nefroprotekcyjnego działania oleju TSA przeciwko toksyczności wywołanej przez Cd, szczury losowo przydzielono do pięciu grup (n=6). Grupa 1 (kontrola normalna) otrzymywała roztwór soli fizjologicznej (0,9 procent NaCl) codziennie przez 7 dni. Grupa 2 (kontrola toksyczna) otrzymywała chlorek kadmu (3 mg/kg, IP, 7 dni). Grupie 3 (kontrola pozytywna) podawano jednocześnie CdCl2 i sylimarynę (100 mg/kg, PO) przez 7 kolejnych dni. Grupom 4 i 5 podawano jednocześnie CdCl2 i olej TSA w dawkach odpowiednio 100 i 200 mg/kg (po, 7 dni). Dawkę CdCl2 wybrano na podstawie wcześniej doniesień literaturowych [19,52].
Po 24 godzinach leczenia wszystkie samce szczurów znieczulono niewielką ilością eteru dietylowego w celu pobrania próbek krwi ze splotu zaoczodołowego, a następnie odwirowano, a następnie przeprowadzono rozdział surowicy i przechowywano w temperaturze -20◦C do dalszego użycia do określenianerkamarkery funkcyjne (takie jak kwas moczowy, kreatynina i mocznik). Po pomyślnym pobraniu surowicy od wszystkich szczurów wyizolowano obie nerki. Lewonerkabył natychmiast przechowywany w temperaturze -80 C do dalszej analizy markera stresu oksydacyjnego (MDA i GSH) i analizy Western blot. Tymczasem prawą nerkę przechowywano do badań histopatologicznych.
4.5. Oznaczanie biomarkera funkcji nerek
sBiomarkery znerkafunkcję, tj. kwas moczowy, mocznik i kreatyninę, oceniano przy użyciu specjalnych komercyjnych zestawów zgodnie z metodami wymienionymi w protokołach producentów.
4.6. Oznaczanie markerów stresu oksydacyjnego w nerkach
Tkanki homogenizowano i rozdrobniono (10 procent wag./obj.) w lodowatym 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4, a roztwór wirowano przez 30 min przy 12,000 x g i 4 ◦ C. Otrzymany homogenat posłużył do oszacowania poziomu GSH i MDA.
Marker peroksydacji lipidów MDA oszacowano wcześniej opisaną metodą [53]. W skrócie, 0,25 ml homogenatu inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę w wytrząsarce metabolicznej. Po inkubacji dodano 00,5 ml 0,67 procent kwasu tiobarbiturowego (TBA) i 0,5 ml 5 procent (w/v) schłodzonego kwasu trichlorooctowego (TCA). , a następnie wirowanie (1000 x g, 15 min). Następnie supernatant trzymano we wrzącej łaźni wodnej przez 10 min. Rozwiniętą absorbancję zmierzono przy 535 nm, tj. zaobserwowano różowy kolor.
W przypadku GSH, Jollow i in. [54] zastosowano metodę. Krótko, po wytrąceniu 1 ml PMS z 1 ml kwasu sulfosalicylowego (4 procent), próbki testowe inkubowano (4 ◦C, 1 h), a następnie odwirowano (1200×g , 15 min, 4°C). Mieszanina testowa zawierała supernatant (0,1 ml), bufor fosforanowy (0,1 M, pH 7,4) (1,7 ml) i ditiolo-bis-2-kwas nitrobenzoesowy (DTNB) (0,4 procent w buforze fosforanowym, 0,1 M, pH 7,4) (0,2 ml) w całkowitej objętości 2,0 ml. Absorbancję próbek analizowano przy 412 nm w ciągu 5 min po dodaniu DTNB do mieszanin reakcyjnych.
4.7. Technika Western Blot
Analizę Western blot i ekstrakcję białka przeprowadzono, jak wspomniano w poprzednim badaniu [55].NerkaTkanki rozdrobniono, a homogenat przygotowano w mieszaninie inhibitorów proteazy i zimnym buforze do lizy białek [55]. Aby wyizolować białka całkowite, lizaty tkankowe przechowywano w lodzie przez 60 min, z alternatywnym worteksowaniem (po 10 min), kontynuowano wirowanie przy 12 000 x g (4 C, 10 min). Metoda Lowry'ego i in. [56] stosowano w celu określenia całkowitego białka. Do analizy Western blot białko (25–50 µg) krótko wyizolowano z każdej grupy i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe otrzymane z Bio-Rad USA. Natychmiastowe blokowanie blotów białkowych przeprowadzono w 4°C (przez 24 godziny); następnie przeprowadzono inkubację z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko NF-κB p65, iNOS i Smad2 oraz przeciwciałami drugorzędowymi skoniugowanymi z peroksydazą w temperaturze pokojowej. Białka analizowano za pomocą zestawu do wykrywania chemiluminescencji (GE Health Care, Mississauga, Kanada). Intensywność prążków białka znormalizowano do prążków beta-aktyny przy użyciu ImageJ (NIH, Bethesda, USA). Obrazy rejestrowano za pomocą chemiluminescencyjnego skanera Western blot aC-Digit uzyskanego z LI-COR, USA.
4.8. Analiza histopatologiczna
Prawidłowynerkapróbki tkanek utrwalone w 10% obojętnej formalinie poddano obróbce w maszynie do obróbki tkanek (ASP300s, Leica Biosystems, IL, USA); każdą próbkę zatopiono w parafinie i pocięto na skrawki o grubości 4–5-µm. Wybrano trzy sekcje z każdej grupy i wybarwiono barwnikiem hematoksyliną i eozyną (H&E), barwnikiem kwasem nadjodowym-Schiffa (PAS) oraz barwnikiem trichromowym Massona (MT) [57]. Wszystkie skrawki tkanki analizowano przy użyciu mikroskopu (Olympus BX 52) w celu uzyskania opisu histopatologicznego, który był rejestrowany przez histopatologa nieznającego grup doświadczalnych. Do robienia zdjęć użyto aparatu Olympus DP21 zamocowanego nad mikroskopem.
4.9. Analiza statystyczna
Wartości wyrażono jako średnią ± SEM. Do pomiaru istotności danych biochemicznych różnych grup zastosowano jednokierunkową analizę ANOVA przy użyciu testu post hocTukey'a. Różnice mierzono istotnie przy wartościach p < 0.05="" w="" stosunku="" do="" normalnej="" grupy="" kontrolnej="" lub="" toksycznej="" grupy="" kontrolnej.="" badanie="" statystyczne="" przeprowadzono="" przy="" użyciu="" graphpadprism="" v.="" 4.0="">
5. Wnioski
W badaniu tym stwierdzono, że olejek eteryczny z T. serrulatus łagodził zaburzenia czynności nerek wywołane przez Cd, w czym prawdopodobnie pośredniczyła poprawa zmienionych parametrów stresu biochemicznego i oksydacyjnego, oprócz poprawy struktur histologicznych. Ponadto T. serrulatus może być odpowiednim lekiem, który zostanie opracowany w przyszłości w celu ochrony nerek inerkazwiązane z zaburzeniami.
Finansowanie:Badania te nie otrzymały finansowania zewnętrznego.
Oświadczenie o dostępności danych:Udostępnianie danych nie ma zastosowania.
Konflikt interesów:Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu rękopisu; lub w decyzji o opublikowaniu wyników.
Dostępność próbki:Próbki olejku eterycznego TSA są dostępne u autorów.
Bibliografia
1. Dua, TK; Dewanjee, S.; Khanra, R.; Bhattacharya, N.; Bhaskar, B.; Zia-Ul-Haq, M.; De Feo, V. Wpływ dwóch popularnych ziół jadalnych, Ipomoea aquatic i Enhydra fluctuans, na patofizjologię indukowaną kadmem: nacisk na obronę oksydacyjną i mechanizm antyapoptotyczny. J. Przeł. Med. 2015, 13, 245. [Odsyłacz] [PubMed]
2. Elkhadragy, MF; Abdel Moneim, AE Ochronne działanie ekstraktu metanolowego Fragaria ananassa na hepatotoksyczność indukowaną chlorkiem kadmu (CdCl2) u szczurów. Toksykol. Mech. Metody 2017, 27, 335–345. [Odn.]
3. Wu, H.; Liao, Q.; Chillrud, SN; Yang, Q.; Huang, L.; Bi, J.; Yan, B. Środowiskowe narażenie na kadm: ocena ryzyka zdrowotnego i jego związki z nadciśnieniem i upośledzoną funkcją nerek. Nauka. Rep. 2016, 6, 29989. [CrossRef]
4. Ferguson, MA; Vaidya, VS; Bonventre, JV Biomarkery nefrotoksycznego ostrego uszkodzenia nerek. Toksykologia 2008, 245, 182–193. [Odsyłacz] [PubMed]
5. Ibrahim, mgr; Almaden, AH; El Moneim, MA; Tammam, HG; Khalifa, AM; Nasibe, MN Toksyczność hematologiczna, nerkowa i wątrobowa indukowana kadmem: poprawa przez Spirulina platensis. Saudyjska J. Forensic Med. Nauka. 2018, 1, 5–13. [Odn.]
6. Kambuz, HF Czy można zapobiec ostrej niewydolności nerek? JR Dz. Chirurg. Edinb. 2000, 45, 45-50. [PubMed]
7. Finn, W.; Porter, G. Biomarkery moczu i nefrotoksyczność. W Clinical Nephrotoksyny, wyd. 2; Wydawnictwo Akademickie Kluwer: Norwell, MA, USA, 2003; s. 621-655.
8. Prozialeck, WC; Edwards, JR Mechanizmy indukowanego kadmem uszkodzenia kanalików proksymalnych: Nowe spostrzeżenia z implikacjami dla biomonitoringu i interwencji terapeutycznych. J. Pharmacol. Do potęgi. Tam. 2012, 343, 2–12. [Odsyłacz] [PubMed]
9. Lan, HY Różne role TGF-8/Smads w zwłóknieniu i zapaleniu nerek. wewn. J. Biol. Nauka. 2011, 7, 1056-1067. [Odsyłacz] [PubMed]
10. Luo, T.; Liu, G.; Długi, M.; Yang, J.; Song, R.; Wang, Y.; Yuan, Y.; Bian, J.; Liu, X.; Gu, J.; i in. Leczenie wywołanego kadmem uszkodzenia oksydacyjnego nerek u szczurów przez podanie kwasu alfa-liponowego. Otaczać. Nauka. Zanieczyszczenia. Res. wewn. 2017, 24, 1832-1844. [Odsyłacz] [PubMed]
11. Angeli, JK; Cruz Pereira, Kalifornia; de Oliveira Faria, T.; Stefanon, I.; Padilha, AS; Vassallo, DV Narażenie na kadm powoduje uszkodzenie naczyń w wyniku stresu oksydacyjnego śródbłonka: rola miejscowej angiotensyny II i COX-2. Wolna Rada. Biol. Med. 2013, 65, 838-848. [Odn.]
12. Orororo, OC; Asagba, SO; Tonukari, NJ; Okandeji, Dz.U.; Mbanugo, JJ Wpływ antocyjanów Hibiscus Sabdarrifa L. na wywołany kadmem stres oksydacyjny u szczurów Wistar. J. Appl. Nauka. Otaczać. Zarządz. 2018, 22, 465–470. [Odn.]
13. Inoue, M. Mechanizmy ochronne przed reaktywnymi formami tlenu. In The Liver: Biology and Pathobiology, wyd. 5; Arias, IM, Boyer, JL, Fausto, N., Jokoby, WB, Schachter, DA, Shafritz, DA, wyd.; Raven Press: Nowy Jork, NY, USA, 2011; s. 443-459.
14. Yadav, RK; Singh, M.; Roy S.; Ansariego, Minnesota; Saeed, AS; Kaithwas, G. Modulacja odpowiedzi na stres oksydacyjny przez olej lniany: rola peroksydacji lipidów i podstawowych mechanizmów. Prostaglandyny Inne lipidy Mediat. 2018, 135, 21-26. [Odsyłacz] [PubMed]
15. Gong, X.; Iwanow, WN; Davidson, MM; Hei, TK Tetrametylopirazyna (TMP) chroni przed nefrotoksycznością wywołaną arseninem sodu poprzez hamowanie produkcji ROS, dysfunkcję mitochondriów, prozapalne szlaki sygnałowe i zaprogramowaną śmierć komórki. Łuk. Toksykol. 2015, 89, 1057-1070. [Odsyłacz] [PubMed]
16. Bonizzi, G.; Karin, M. Dwa szlaki aktywacji NF-KB i ich rola w odporności wrodzonej i adaptacyjnej. Trendy. Immunol. 2004, 25, 280-288. [Odn.]
17. Imam, F.; Al-Harbi, NIE; Al-Harbi, MM; Ansari, MA; Al-Asmari, AF; Ansariego, Minnesota; Al-Anazi, Waszyngton; Bahaszwan, S.; Almutairi, MM; Alshammari, M.; i in. Apremilast zapobiega apoptozie i stanom zapalnym serca wywołanym przez doksorubicynę poprzez hamowanie aktywacji szlaków sygnałowych NF-B za pośrednictwem stresu oksydacyjnego. Pharmacol. Rep. 2018, 70, 993-1000. [Odn.]
18. Erboga, M.; Kanter, M.; Aktas, C.; Sener, U.; Erboga, ZF; Donmez, YB; Gurel, A. Thymoquinone łagodzi wywołaną przez kadm nefrotoksyczność, apoptozę i stres oksydacyjny u szczurów w oparciu o jego właściwości antyapoptotyczne i przeciwutleniające. Biol. Śledź element. Res. 2016, 170, 165–172. [Odn.]
19. Ansariego, Minnesota; Aloliet, RI; Ganaie, MA; Chan, TH; Rehman, N.; Imam F.; Hamad, AM Roflumilast, inhibitor fosfodiesterazy 4, łagodzi toksyczność nerkową wywołaną kadmem poprzez modulację aktywacji NF-KB i indukcję NQO1 u szczurów. Eksperyment ludzki Toksykol. 2019, 38, 588-597. [Odn.]
20. Rosnąć, F.; Engelbertz, J.; Feistel, B.; Lehnfeld, R.; Bauer, K.; Verspohl, EJ Wpływ tymolu w ekstraktach z tymianku na ich działanie przeciwskurczowe i klirens rzęskowy. Planta Med. 2010, 76, 311–318. [Odn.]
