Ochronny wpływ nowego wywaru Wenshen Shengjing na wywołane cyklosporyną upośledzenie syntezy testosteronu i apoptozę spermatogenów
Mar 03, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
XIAOYAN PAN , XIYAN WANG , XUENAN WANG , WANSHENG ZHANG4 , ZHANXUAN SUN1 , XUAN XUAN LIANG , XUE ZHANG , WENJUN LI i ZHIXIN LI
Abstrakcyjny
Niniejsze badanie miało na celu zbadanie potencjalnego działania ochronnego nowego wywaru Wenshen Shengjing (nowego WSSJD; w tym Cornu Cervi Nippon Parvum, żeń-szenia Panax, solarium Cynomorium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum i Angelica Sinensis) na wywołane przez cyklosporynę upośledzenie syntezy testosteronu i apoptozę spermatogenną u myszy. W sumie 90 dorosłych samców myszy Kunming podzielono na następujące 6 grup: Kontrola (bez interwencji), dimetylosulfotlenek (DMSO; otrzymywał tylko DMSO), cyklosporyna A (CSA), cytrynian klomifenu (CC; CsA plus CC, 15 mg/kg /dzień), WSSJD (CsA plus WSSJD, surowy lek 12 g/kg/dzień) i nowy WSSJD (CsA plus nowy WSSJD, surowy lek 12 g/kg/dzień). Wszystkie myszy leczono przez 30 dni przez zgłębnik doustny. Następnie jądra utrwalano i barwiono hematoksyliną i eozyną w celu oceny rozwoju nabłonka nasiennego. Zastosowano techniki immunohistochemiczne do wykrywania ekspresji receptora hormonu luteinizującego (LHR) i rozszczepienia łańcucha bocznego P450 (P450scc) w jądrach komórek Leydiga. Ponadto apoptozę komórek spermatogennych w jądrach wykryto za pomocą końcowego testu dUTP, w którym pośredniczy transferaza deoksynukleotydylowa dUTP, a do analizy przeżywalności i wczesnej apoptozy plemników w najądrzach zastosowano cytometrię przepływową. W porównaniu z grupami CsA i CC nowe podanie WSSJD znacząco zwiększyło poziom testosteronu w surowicy oraz ekspresję LHR i P450scc w jądrach komórkach Leydiga (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">
Wstęp
Cyklosporyna A (CSA) jest powszechnie stosowanym środkiem immunosupresyjnym, który działa specyficznie na limfocyty T i hamuje wydzielanie interleukiny-2 i radykalnie zwiększa wskaźnik powodzenia przeszczepów wątroby, nerki i rogówki, a także przeżywalność odbiorcy (1-3). Jednak immunosupresja wywołana długotrwałym stosowaniem CsA znacznie zwiększa ryzyko chorób sercowo-naczyniowych, infekcji i nowotworów złośliwych (4). Eid i wsp. (5) stwierdzili, że stężenie i ruchliwość plemników były ujemnie skorelowane ze stężeniem CsA w surowicy u mężczyzn biorców przeszczepu nerki, co sugeruje, że CsA może indukować dysfunkcję układu rozrodczego u mężczyzn. Ponadto udokumentowano, że CsA może być odpowiedzialna za upośledzenie spermatogenezy i uszkodzenie męskiego układu rozrodczego (6).
Wcześniejsze badania wykazały, że CsA obniża poziom testosteronu w surowicy, wpływając na biosyntezę i wydzielanie testosteronu w jądrach. On i wsp. (7) zaobserwowali, że szczury leczone 40 mg/kg/dzień CsA wykazywały znacząco wyższe poziomy hormonu luteinizującego (LH) i znacząco niższe poziomy testosteronu w surowicy, co prowadziło do upośledzenia rozwoju jąder. Ali i wsp. (8) donieśli, że leczenie CsA zmniejszyło ekspresję receptora LH (LHR) na błonie komórek Leydiga, co z kolei zmniejszyło syntezę testosteronu za pośrednictwem LH i wydzielanie z komórek Leydiga. Inne badanie przeprowadzone przez Seethalakshmi i wsp. (9) wykazało, że CsA obniża poziom testosteronu poprzez hamowanie aktywności 17-alfa-hydroksylazy w sposób niekooperatywny i aktywności 17 -dehydrogenazy hydroksysteroidowej podczas biosyntezy testosteronu, a głównym miejscem hamowania CsA była przerwana cykliczna adenozyna stymulacja monofosforanem. Ponadto raport ten wskazywał, że zmniejszone wydzielanie testosteronu indukowane przez CsA w komórkach Leydiga bezpośrednio wpłynęło na rozwój męskiego układu rozrodczego i utrzymanie zdolności rozrodczych. Seethalakshmi i wsp. (10) wstrzyknęli egzogenny testosteron szczurom traktowanym CsA w celu zwiększenia poziomu endogennego testosteronu. Zaobserwowano, że podwyższone dawki egzogennego testosteronu istotnie przywróciły masę narządów rozrodczych, poziomy hormonu folikulotropowego (FSH) w surowicy i zwiększyły liczbę komórek rozrodczych, co wskazuje, że upośledzeniu spermatogenezy indukowanemu przez CsA można częściowo zapobiegać przez egzogenne podawanie testosteronu (10). Stwierdzono jednak, że egzogenny testosteron jest niewystarczający do naprawy uszkodzonej tkanki jąder, ponieważ sekrecja testosteronu i spermatogeneza nadal pozostawały pod wpływem CsA, a wysokie wskaźniki apoptozy obserwowano w plemnikach i komórkach spermatogennych (10).
Wenshen Shengjing Decoction (WSSJD) składa się z 15 leków ziołowych, w tym przede wszystkim Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, solarium Cynomorium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicorneum i Angelica Sinensis (11). Wykazano, że WSSJD łagodzi apoptozę spermatogenną wywoływaną przez cyklofosfamid (11). Aby jeszcze bardziej poprawić efekt terapeutyczny WSSJD, w niniejszym badaniu opracowano nowy WSSJD oparty na mechanizmie indukowanego przez CsA uszkodzenia tkanki jąder poprzez dostosowanie dawki składników WSSJD. Współczesne badania farmakologiczne wykazały, że aksamit z poroża w WSSJD może działać jako hormon płciowy (12); Radix Astragali może poprawiać proliferację i dostarczanie składników odżywczych do jąder komórek Sertoli (13), a Panax ginseng może zmniejszać poziom nadtlenku w jądrach i hamować apoptozę spermatogenną (14). Wyżej wymienione leki mogą również nasilać czynność nerek i pobudzać rozwój komórek spermatogennych (12-14). W poprzednich badaniach klinicznych wykazano, że cytrynian klomifenu (CC) wywiera działanie terapeutyczne na niepłodność u mężczyzn (15,16). Co więcej, CC wiąże się z poprawą parametrów testosteronu i nasienia, a mechanizmy ochronne CC mogą być podobne do mechanizmów WSSJD (15, 16). Ponadto w badaniu przeprowadzonym przez Wanga i wsp. (17) CC zastosowano jako kontrolę leczenia w celu zbadania wpływu chińskiego leku Shengjing na zaburzenia spermatogenezy u myszy. Na tej podstawie w niniejszym badaniu jako kontrolę pozytywną zastosowano CC.
W niniejszym badaniu zbadano mechanizm działania ochronnego nowego WSSJD w tkankach jąder w celu określenia skuteczności terapeutycznej zmodyfikowanego leku. Wyjaśnienie mechanizmu ochronnego może stanowić podstawę do zastosowania nowego WSSJD w łagodzeniu uszkodzeń spermatogennych wywołanych przez CsA.
Skutki Cistanche deserticola: Zapobieganieuszkodzenie spermatogenne
Materiały i metody
Zwierząt. W sumie 90 samców myszy Kunming (8-tygodniowe; 35-40 g) zostało dostarczonych przez Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd. (Changchun, Chiny). Niniejsze badanie zostało przeprowadzone za zgodą Komisji Etyki Uniwersytetu Medycznego w Jilin (Changchun, Chiny). Myszy trzymano w temperaturze 21±3˚C i wilgotności względnej 55-65% w 12-godzinnym cyklu ciemno-światło. Myszom zapewniono swobodny dostęp do standardowej laboratoryjnej diety myszy i sterylnej wody.
Przygotowanie WSSJD. 15 składników medycyny chińskiej WSSJD, w tym Cornu Cervi Nippon Parvum, żeń-szeń Panax, solarium Cynomorium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum i Angelica Sinensis (11) zakupiono w Tongrentang (Pekin, Chiny). Materiały te zostały wywarzone zgodnie z tradycyjną metodą chińskiego wywaru leczniczego (18). W skrócie, składniki odważono zgodnie z przepisem i dodano łącznie 250 ml wody destylowanej, aby zanurzyć zioła. Zioła moczono przez 30 min, a następnie podgrzewano. Zioła były najpierw gotowane przez 10 minut, a następnie gotowane na wolnym ogniu przez 20 minut. Po 30 minutach ogrzewania płynny wywar oddzielono od ziół, które następnie wywarzono 200 ml wody destylowanej w temperaturze 80°C przez kolejne 30 minut. Proces ten został powtórzony i końcowa objętość wywaru została przefiltrowana przez 4-5 warstwy gazy. Płyn wyciskano również z ziół do przefiltrowanego wywaru. Wywar następnie ogrzewano w 80°C w łaźni wodnej przez 6-7 godzin, aż stężenie osiągnęło 2 g surowego leku/ml, a wywar przechowywano w 4°C przed użyciem. nowy WSSJD został przygotowany na bazie preparatu WSSJD z niewielkimi modyfikacjami dawek Panax ginseng, Cynomorium solarium, Radix Astragali i Epimedium brevicornum. Metoda wywaru była taka sama jak w przypadku WSSJD. nowy WSSJD składający się z następujących składników: Panax ginseng, 6 g; Solarium Cynomorium, 9 g; Radix Astragali, 12 g; Epimedium brevicornum, 6 g; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1 g;Cistanche deserticola9g; Angelica Sinensis, 6 g; Nasiona Mleczarki Płaskiej, 9 g; Rhizoma Dioscoreae, 15 g; Duża głowa Atractylodes Rhizome, 6 g; Ligusticum wallichii, 3 g; Radix Paeoniae Alba, 6 g; Kasja cynamonowa, 1 g; Costustoot 1,5 g i Fructus Foeniculi 3 g.
Stężenia surowych ekstraktów leków określono w następujący sposób: Waga surowego materiału/objętość końcowa. Ta metoda obliczeniowa jest szeroko stosowana w badaniach nad tradycyjną medycyną chińską (19-21).Podawanie leków. Myszy podzielono losowo na 6 grup (15 myszy w grupie) i podawano lek dożołądkowy. Grupy były następujące: Kontrola (sól fizjologiczna); dimetylosulfotlenek (DMSO); CsA; CC; WSSJD; i nowy WSSJD. Myszom w grupach CsA, CC, WSSJD i nowych grupach WSSJD wstrzykiwano dootrzewnowo (ip) 15 mg/kg/dzień CsA (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, Chiny) przez 30 dni, jak opisano wcześniej (8 ). Myszy w grupie kontrolnej i grupie DMSO poddano codziennemu wstrzykiwaniu ip równą objętością odpowiednio normalnej soli fizjologicznej lub rozpuszczalnika DMSO przez 30-dniowy okres doświadczalny. Stężenie DMSO rozcieńczonego w soli fizjologicznej wynosiło 3,25 procent (obj./obj.). Grupie CC podawano 21,6 mg/kg/dzień CC (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, Chiny), jak opisano wcześniej (13), który był również rozcieńczony w 3,25 procentach (obj./obj.) DMSO (pH{14} }.2). Myszom w grupach WSSJD i nowych WSSJD podawano odpowiednio 12 g surowego leku/kg/dzień WSSJD i nowego WSSJD.Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E). Jądra myszy zebrano i natychmiast utrwalono w 4% paraformaldehydzie (pH=7,2) w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, po czym przeprowadzono odwodnienie etanolem, potraktowanie ksylenem w celu usunięcia etanolu, zatopienie wosku i pocięcie skrawków. Skrawki histologiczne (5 µm) uzyskano przy użyciu mikrotomu obrotowego. Zostały one przymocowane do szkiełek do barwienia H&E. Skrawki jąder obserwowano za pomocą podświetlonej mikroskopii histopatologicznej w celu oceny rozwoju kanalików nasiennych i uzyskania danych histometrycznych. Rozwój kanalików nasiennych oceniano za pomocą systemu punktacji Johnsena (22).
ELISA. W dniu 3 0 leczenia myszy znieczulono 10% wodzianem chloralu (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd) w dawce 0,004 ml/g wagi ciała ip przed eutanazją za pomocą CO2. Pobrano krew z tułowia, oddzielono surowicę i przechowywano w temperaturze -20˚C. W skrócie, krew zebrano do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywano przez noc w temperaturze 4°C. Probówkę następnie odwirowano przy 1300 xg w 4°C przez 6 min i zebrano surowicę. Do określenia zawartości testosteronu w surowicy (nr kat. EIA-2380) i LH (nr kat. EIA-2385) użyto zestawów ELISA (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny). ) zgodnie z protokołem producenta. Gęstość optyczną (OD) określono stosując czytnik mikropłytek Model 680 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), a poziomy testosteronu i LH określono na podstawie krzywej standardowej.
Immunohistochemia. Tkanki jąder utrwalano w 4% formaldehydzie w temperaturze pokojowej przez 24 godziny i zatapiano w parafinie. Skrawki parafinowe pocięto na skrawki 5 µm, a następnie odparafinowano. Odzyskanie antygenu osiągnięto przez inkubację skrawków w 0.01 M buforze cytrynianowym (pH=6.0) w 95-98˚C przez 5 min. Skrawki następnie zablokowano 5% albuminą surowicy bydlęcej (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy; A3675) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po zablokowaniu skrawki inkubowano z króliczymi przeciwciałami poliklonalnymi przeciwko LHR (nr kat. L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) lub rozszczepieniu łańcucha bocznego P450 (P450scc; nr kat. ab75497; Abcam, Cambridge, Wielka Brytania) 1:200) w 4°C przez noc w ciemności. Metodę kompleksu streptawidyna-biotyna (SABC) zastosowano do wykrywania ekspresji LHR i P450scc przy użyciu zestawu SABC (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA), zgodnie z protokołem producenta. W przypadku tkanek izolowanych od myszy będących kontrolą ujemną, pierwotne przeciwciało zastąpiono PBS. Komórki Leydiga z żółtym lub brązowym zabarwieniem na błonie lub osoczu uznano za komórki LHR-dodatnie. Z każdej próbki uzyskano pięć preparatów, a pięć pól w obszarach tkanki Leydiga wybrano losowo i oceniono pod mikroskopem fluorescencyjnym (powiększenie, x400). Średnią OD komórek dodatnich w obszarach tkanki Leydiga uzyskano stosując oprogramowanie Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Ekspresja LHR i P450scc była proporcjonalna do wartości OD, przy czym wyższe wartości OD reprezentują wyższe ekspresje białek.
Test TUNEL za pośrednictwem terminalnej transferazy deoksynukleotydylowej (TdT) dUTP. Jądra myszy wycięto, zatopiono w wosku i pocięto na skrawki. Skrawki (grubość 5- µm) następnie wybarwiono przy użyciu zestawu testowego TUNEL (MK1024; Boster Biological Technology), zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, tkanki jąder z grupy kontrolnej (normalna sól fizjologiczna), DMSO, CsA, CC, WSSJD i nowych grup WSSJD barwiono przy użyciu rozcieńczenia 1:100 znakowanego biotyną przeciwciała digoksyny przez 30 min w 37°C. Jako kontrolę pozytywną zastosowano wybarwioną tkankę śródmiąższową szczura (dostarczoną w zestawie), a jako kontrolę negatywną zastosowano próbki inkubowane z PBS zamiast znakowanego biotyną przeciwciała digoksyny. Częstość komórek TUNEL-dodatnich wykazujących zielone zabarwienie jąder oceniano za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Oceniono w sumie 10 losowych pól w dużym powiększeniu (x400) i zliczono komórki dodatnie. Obliczono średnią liczbę dodatnich komórek na pole.
Barwienie jodkiem propidyny (PI) lub izotiocyjanianem aneksyny V-fluoresceiny (FITC) i analiza metodą cytometrii przepływowej. Ogon najądrza zebrano w następnym uśmierceniu i naskórek pocięto ostrzem w celu uwolnienia plemników z najądrza do 2 ml PBS w 37°C w celu uzyskania zawiesiny najądrza. Zawiesiny następnie inkubowano w 37°C przez 10 min, aby umożliwić wypłynięcie plemników. Agregacje plemników odrzucono, a pozostałe próbki plemników wyizolowano i ponownie zawieszono w PBS do stężenia 106 komórek/ml. Apoptozę plemników analizowano przy użyciu zestawu Annexin V-FITC Apoptosis Detection (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Chiny), zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, 1 ml zawiesiny plemników barwiono 10 µl PI lub 500 µl buforu wiążącego i 5 µl aneksyny V-FITC w ciemności przez 10 min w temperaturze pokojowej. Komórki natychmiast analizowano metodą cytometrii przepływowej Epics XL (Beckman Coulter, Inc.) i stosując system TetraONE™ (6915050; Beckman Coulter, Inc.). Komórki we wczesnych stadiach apoptozy identyfikowano za pomocą barwienia aneksyną V-dodatniego, a komórki martwicze identyfikowano za pomocą barwienia PI-dodatniego.
Analiza statystyczna. Analizę danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) i wyrażono jako średnią plus lub ± odchylenie standardowe, jak wskazano. Różnice między grupami oceniano pod kątem istotności za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji, a następnie testu post hoc Tukeya. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche deserticola
Wyniki
Wpływ nowej WSSJD na rozwój kanalików nasiennych jąder. Aby zbadać potencjalny wpływ ochronny nowego WSSJD na rozwój kanalików nasiennych jąder myszy, porównano morfologię jąder myszy barwionych H&E pod mikroskopem świetlnym. Kanaliki nasienne myszy z grup CsA i CC wykazywały kurczenie się obrzeża kanalików, zmniejszoną średnicę kanalików i zmniejszoną liczbę warstw nabłonka nasiennego jąder w porównaniu z kontrolą. Ponadto komórki spermatogenne wykazywały nieuporządkowany układ, liczba komórek spermatogennych była zmniejszona, a w świetle widoczne było niewiele dojrzałych plemników (ryc. 1). U myszy z grup DMSO, WSSJD i nowych WSSJD, więcej warstw nabłonka nasiennego jąder było widocznych, a brzeg kanalików nasiennych był zintegrowany bez kurczenia się lub zapadania (ryc. 1). Wyniki Johnsena nie różniły się istotnie między grupą DMSO a grupami kontrolnymi ani między grupami CC i DMSO. Jednak punktacja Johnsena była istotnie obniżona w grupie CsA i grupie WSSJD w porównaniu z grupą kontrolną, a wyniki grup WSSJD i nowych WSSJD były istotnie podwyższone w porównaniu z grupą CC lub CsA (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">
Wpływ nowego WSSJD na testosteron w surowicy i LH. Następnie zmierzono poziomy testosteronu i LH w surowicy. Poziomy testosteronu i LH w surowicy pozostały niezmienione po podaniu DMSO. Dla kontrastu, poziom testosteronu w surowicy był znacząco obniżony, a LH był znacząco podwyższony u myszy traktowanych CsA, w porównaniu do kontroli (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">
Wpływ nowego WSSJD na ekspresję LHR i P450scc. Ekspresję P450scc i LHR oceniano w jądrach komórkach Leydiga metodą immunohistochemiczną (Fig. 3 i 4). W grupie kontrolnej LHR ulegał ekspresji na zewnętrznych błonach komórek Leydiga między kanalikami nasiennymi (ryc. 3A), a P450cc ulegał ekspresji w cytoplazmie jąder komórek Leydiga (ryc. 4A). Traktowanie DMSO nie miało znaczącego wpływu na ekspresję LHR i P450scc. Natomiast leczenie CsA znacząco zmniejszyło ekspresję LHR i P450scc w porównaniu z myszami kontrolnymi (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">
Wpływ nowego WSSJD na apoptozę komórek spermatogennych. Apoptozę komórek spermatogennych w jądrach myszy analizowano za pomocą testu TUNEL. Jądra komórek apoptotycznych obserwowano głównie w spermatogonii i pierwotnych spermatocytach (ryc. 5A). Spermatogonia są większe niż spermatocyty i znajdują się bliżej błony podstawnej (23). Traktowanie DMSO nie miało istotnego wpływu na liczbę apoptotycznych komórek spermatogennych w jądrach. Natomiast leczenie CsA znacząco zwiększyło liczbę apoptotycznych komórek spermatogennych w porównaniu z grupą kontrolną i DMSO (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">
Wpływ nowego WSSJD na przeżycie i wczesną apoptozę plemników. Aby zweryfikować ochronne działanie nowego WSSJD przeciwko apoptozie plemników indukowanej CsA, określono przeżycie i wczesną apoptozę plemników w najądrzu. Plemniki najądrza wybarwiono PI lub aneksyną V i analizowano metodą cytometrii przepływowej (ryc. 6 i 7). Zgodnie z powyższymi wynikami, leczenie CsA znacząco zmniejszyło odsetek żywych plemników i znacząco zwiększyło odsetek plemników wcześnie apoptotycznych (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">
Dyskusja
Wcześniej udokumentowano, że długotrwałe stosowanie CsA jako środka immunosupresyjnego wpływa na zdolność rozrodczą (6). Xu (24) poinformował, że morfologia i żywotność plemników u pacjentów leczonych CsA były znacznie niższe niż w grupie nieleczonej, co zaobserwowano w próbkach nasienia 26 biorców przeszczepu nerki leczonych różnymi dawkami CsA i 12 zdrowych ochotników. Zaobserwowano również, że wskaźniki deformacji głowy plemników były istotnie wyższe u biorców leczonych CsA(24). Wyniki te sugerowały, że CsA ma zależny od dawki wpływ na parametry nasienia. Dlatego uzasadnione są badania mające na celu zidentyfikowanie nowych środków farmakologicznych zdolnych do łagodzenia uszkodzeń jąder wywołanych przez CsA i poprawy zdolności rozrodczych mężczyzn po przeszczepieniu narządu.
Specyficzne mikrośrodowisko jądra sprzyja spermatogenezie, a zatem upośledzenie budowy i funkcji jąder może prowadzić do zatrzymania spermatogenezy(25). Monteiro i wsp. (26) podawali szczurom Wistar CsA w dawce 15 mg/kg dziennie przez 56 dni i zaobserwowali zwiększoną proporcję objętościową tkanki łącznej i zmniejszoną proporcję objętościową komórek Leydiga u szczurów traktowanych CsA. Zaobserwowano również, że CsA powodowała zwyrodnienie nabłonka nasiennego, powodując wakuolizację komórek Sertoliego, nieprawidłowe okrągłe i wydłużone plemniki oraz akumulację resztkowej cytoplazmy na granicy nabłonka przylegającej do światła (26). W niniejszym badaniu myszom Kunming podawano 15 mg/kg CsA dziennie przez 30 dni, co prowadziło do kurczenia się i zmniejszenia średnicy kanalików nasiennych, zmniejszenia warstw nabłonka nasiennego, zaburzenia ułożenia komórek nasiennych, zmniejszenia plemniki w świetle i znacznie obniżony wynik Johnsena.
Ponadto leczenie CsA poważnie uszkodziło strukturę jąder. W niniejszym badaniu oceniono również ochronne działanie nowego WSSJD, jako nowego chińskiego leku, na jądra myszy leczonych CsA. Zaobserwowano, że warstwy nabłonka nasiennego jądra i ułożenie komórek nasiennych zostały przywrócone po leczeniu nowym WSSJD. Ponadto myszy z nowej grupy WSSJD wykazywały zintegrowane kanaliki nasienne bez kurczenia się lub zapadania i miały znacznie wyższą punktację Johnsena w porównaniu z myszami leczonymi CsA. Wyniki te sugerowały, że WSSJD znacząco naprawiało uszkodzenia jąder wywołane przez CsA, wskazując, że ten ziołoleczniczy związek może być skutecznym leczeniem w zapobieganiu uszkodzeniom jąder wywołanym przez CsA. To, czy naprawa komórek zależy od niszy w nabłonku, jest również ważnym pytaniem, które należy zbadać w przyszłych badaniach.
Ważną rolę w regulacji czynności narządów płciowych odgrywa oś podwzgórze-przysadka-jądra (27). Rozwój i funkcjonalność męskich narządów płciowych regulują hormony z podwzgórza i przysadki mózgowej (28). Krueger i wsp. (29) traktowali szczury Sprague Dawley CsA w dawce 25 mg/kg/dzień CsA lub 40 mg/kg/dzień CsA przez 6 dni i zaobserwowali, że poziomy LH i FSH w surowicy wzrosły 2-4-krotnie, podczas gdy ekspresja P450scc spadła do 30 procent w grupie kontrolnej. Ponadto poziomy testosteronu w surowicy były znacznie obniżone u myszy traktowanych CsA, co prowadziło do upośledzenia spermatogenezy (29). W niniejszym badaniu wykazano, że traktowanie CsA znacząco obniżyło ekspresję LHR w komórkach Leydiga. Chociaż LH w surowicy zostało zwiększone, zmniejszona ekspresja LHR może mieć upośledzony odzysk biosyntezy testosteronu za pośrednictwem LH i zmniejszyć ekspresję P450scc, jako enzymu ograniczającego szybkość biosyntezy testosteronu (30), wpływając w ten sposób na biosyntezę testosteronu przez komórki Leydiga. Nowe składniki nowego WSSJD, takie jak poroża włosowatego, wykazują działanie podobne do hormonów płciowych (12), które mogą poprawić poziom testosteronu w surowicy i obniżyć poziom LH w surowicy, zwiększając w ten sposób ekspresję LHR i p450scc w komórkach Leydiga. Warto zauważyć, że obecne wyniki wskazują, że nowy WSSJD stymuluje biosyntezę i wydzielanie testosteronu w komórkach Leydiga w celu promowania spermatogenezy.
Stres oksydacyjny wywołany przez CSA i uszkodzenie jąder wywołują dysplazję plemników i komórek spermatogennych (31). Doniesiono, że długotrwałe leczenie CsA uszkadza system antyoksydacyjny w zwierzęcych tkankach jąder, prowadząc do obniżenia poziomu glutationu, peroksydazy glutationowej i poziomu nadtlenku wodoru oraz zwiększonego poziomu dialdehydu malonowego w jądrach (31). Dlatego nie można wyeliminować nadmiernego poziomu reaktywnych form tlenu w tkankach jąder, co prowadzi do peroksydacji lipidów błony plemników, uszkodzenia DNA i zmniejszenia żywotności plemników. W niniejszym badaniu zaobserwowano, że traktowanie CsA znacząco zwiększyło pękanie DNA i tempo apoptozy komórek spermatogennych w kanalikach nasiennych. Zmniejszyła się również przeżywalność plemników w najądrzach, natomiast wzrósł odsetek plemników wcześnie apoptotycznych, co wskazuje na znaczne uszkodzenie spermatogenezy jąder. Türk i wsp. (32) udokumentowali, że ochronny wpływ kwasu elagowego na uszkodzenia jąder wywołane przez CsA był związany ze stresem oksydacyjnym u samców szczurów. Nowy WSSJD zastosowany w niniejszym badaniu zawiera różne składniki przeciwutleniające, w tym ziołowy lek żeń-szeń, który, jak wcześniej wykazano, znacznie zmniejsza poziom nadtlenku w jądrach (14).
W niniejszym badaniu zbadano wpływ nowego WSSJD na indukowane przez CsA upośledzenie syntezy testosteronu i apoptozę spermatogenną i zaobserwowano, że nowy WSSJD znacząco zmniejszył tempo apoptozy komórek spermatogennych i plemników, a tym samym naprawił uszkodzenia jąder nasiennych. nabłonek. Za pomocą histochemii i cytometrii przepływowej zbadano morfologię kanalików nasiennych jąder oraz apoptozę komórek spermatogennych i plemników. Chociaż dystrybucja cyklu komórkowego i codzienna produkcja plemników nie zostały zbadane, będą one przedmiotem przyszłych badań naszej grupy.
WSSJD znacząco podniósł poziom testosteronu w jądrach i zmniejszył apoptozę komórek spermatogennych i plemników, co skutecznie naprawiało uszkodzenia jąder wywołane przez CsA. Wyniki te wskazują, że nowy WSSJD może być użytecznym środkiem farmakologicznym w leczeniu i zapobieganiu uszkodzeniom jąder wywołanym przez CsA.
Cistanche deserticola całe korzenie
Bibliografia
1. Pedersen M i Seetharam A: Zakażenia po ortotopowym przeszczepie wątroby. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360, 2014.
2. Vora GK i Ciolino JB: Reakcja przeszczepu rogówki związana z zapaleniem pozagałkowym. Cyfra J Oftalmol 20: 29-31, 2014.
3. De Pasquale C, Veroux M, Indelicato L, Sinagra N, Giaquinta A, Fornaro M, Veroux P i Pistorio ML: Psychopatologiczne aspekty przeszczepu nerki: Skuteczność zespołu multidyscyplinarnego. World J Transplant 4: 267-275, 2014.
4. El-Gowelli HM i El-Mas MM: Centralna modulacja nadciśnienia indukowanego cyklosporyną. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361, 2015.
5. EidMM, Abdel-Hamid IA, SobhMA i el-SaiedMA: Ocena charakterystyki ruchu plemników u niepłodnych biorców przeszczepu nerki za pomocą analizy komputerowej. Int J Androl 19: 338-344, 1996.
6. Zahra A, Gholamreza N, Farokhi F i Shalizar Jalali A: Atenuacja wywołanego cyklosporyną upośledzenia nasienia i embriotoksyczności przez wodny ekstrakt z owoców crataegus monogyna. Komórka J 15: 198-205, 2013.
7. He Z, Qiu J, LiJ, Zhao D, Chen G i Chen L: Długoterminowe skutki konwersji cyklosporyny do rapamycyny na funkcję i morfologię jąder w szczurzym modelu przeszczepu. Procedura Transplantacyjna 45: 763-769, 2013.
8. AliRB, KlouzA, Boubaker S, LakhalM i BelkahiaC: Zwierzęcy model toksyczności jąder przez cyklosporynę: Ocena i ochrona. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246, 2009.
9. Seethalakshmi L, Flores C, Malhotra RK, Pallas JD, Tharakan D, Khauli RB i Menon M: Mechanizm działania cyklosporyny w hamowaniu biosyntezy testosteronu przez szczurze komórki Leydiga in vitro. Transplantacja 53: 190-195, 1992.
10. SeethalakshmiL, FloresC, CarboniAA i Menon M: Ilościowe utrzymanie spermatogenezy u szczurów leczonych cyklosporyną przez egzogenne podawanie propionianu testosteronu. J Androl 11: 491-497, 1990.
11. Pan XY, Wang XY, Wang XN, Sun ZX, Wang D, Wang X, Yang YY i Li ZX: Wpływ „Wywaru Wenshen Shengjing” na wywołaną cyklofosfamidem apoptozę komórek spermatogennych i dimetylację histonu H3K9. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86, 2014 (w języku chińskim).
12. Xu ZH, Li SF, Wang JY, Zhou R i Tian SJ: Ekstrakcja hormonów płciowych z aksamitu z poroża za pomocą nadkrytycznego CO2. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003, 2007 (w języku chińskim).
13. Zhao LP, Xu Z, Zhang M, Sun HC i Tang F: Wpływ Fructus Lycii i Radix astragali na funkcję komórek Sertoliego w jądrach szczurów. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86, 2007 (w języku chińskim).
14. Xu L, Liu XH i Zhang L: Wpływ całkowitych ginsenozydów na NO, NOS i całkowitą pojemność antyoksydacyjną w jądrach myszy. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508, 2006 (w języku chińskim).
15. Patel DP, Brant WO, Myers JB, Presson AP, Johnstone EB, Dorais JA, Aston KI, Carrell DT i Hotaling JM: Bezpieczeństwo i skuteczność cytrynianu klomifenu u mężczyzn hiperandrogennych i niepłodnych. Int J Impot Res 27: 221-224, 2015.
16. ElSheikh MG, Hosny MB, Elshenoufy A, Elghamrawi H, Fayad A i Abdelrahman S: Połączenie witaminy E i cytrynianu klomifenu w leczeniu pacjentów z idiopatycznym oligonukleotydem jako azoospermią: prospektywne, randomizowane badanie. Andrologia 3: 864-867, 2015.
17. Wang R, Xu L, Zhang WX, Wu YF, Shi JH i Zhang YX: Granulat Shengjing: skuteczna chińska medycyna na zaburzenia spermatogenne u myszy. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049, 2008 (w języku chińskim).
18. Fan BT: Chinese Medicine Pharmacy, Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68, 1997 (w języku chińskim).
19. Zhang J, Li H, Lu L, Yan L, Yang X, Shi Z i LiD: Formuła Yiqi i Yangyin łagodzi uszkodzenia układu krwiotwórczego wywołane napromieniowaniem całego ciała. J Radiat Res 58: 1-7, 2017.
20. Minami M, Konishi T, Jiang Z, Arai T i Makino T: Wpływ Shin'iseihaito na mysie reakcje alergiczne wywołane uczuleniem z nosa. J Tradit Complement Med 6: 252-256, 2015.
21. Rong R, Li RR, Hou YB, Li J, Ding JX, Zhang CB i Yang Y: wywar z Mahuang-xixin-fuzi zmniejsza zakażenie wirusem grypy u myszy z zespołem niedoboru nerek-yang. J Ethnopharmacol 192: 217-224, 2016.
22. Johnsen SG: Wynik biopsji jąder – metoda rejestracji spermatogenezy w jądrach ludzkich: wartości prawidłowe i wyniki u 335 mężczyzn z hipogonadyzmem. Hormony 1: 2-25, 1970.
23. Mays-Hoopes LL, Bolen J, Riggs AD i Singer-Sam J: Przygotowanie spermatogonii, spermatocytów i okrągłych spermatyd do analizy ekspresji genów przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Biol Reprod 53: 1003-1011, 1995.
24. Xu LG: Wpływ cyklosporyny A na parametry nasienia pacjentów po przeszczepieniu nerki. J Clin Urol 20: 603-605, 2005.
25. Pintus E, Ros-Santaella JL i Garde JJ: Poza wielkością jąder: Związek między spermatogenezą a cechami plemników u sezonowego ssaka rozrodczego. PLoS One 10: e0139240, 2015.
26. Monteiro JC, Predes FS, Matta SL i Dolder H: Infuzja Heteropterys aphrodisiaca zmniejsza uboczne działanie cyklosporyny A na jądra. Anat Rec (Hoboken) 291: 809-817, 2008.
27. Oseko F, Note S, Morikawa K, Endo J, Taniguchi A i Imura H: Wpływ przewlekłej hiperprolaktynemii wywołanej przez sulpiryd na oś podwzgórze-przysadka-jądra u zdrowych mężczyzn. Fertil Steril 44: 106-111, 1985.
28. Wisniewski P, Romano RM, Kizys MM, Oliveira KC, Kasamatsu T, Giannocco G, Chiamolera MI, Dias-da-Silva MR i Romano MA: Narażenie dorosłych na bisfenol A (BPA) u szczurów rasy Wistar obniża jakość nasienia z zakłóceniami osi podwzgórze-przysadka-jądra. Toksykologia 329: 1-9, 2015.
29. Krueger BA, Trakshel GM, Sluss PM i Maines MD: Zależna od cyklosporyny depresja receptorów hormonu luteinizującego i biosynteza hemu w jądrach szczurów: możliwy mechanizm spadku testosteronu w surowicy. Endokrynologia 129: 2647-2654, 1991.
30. Nolan CJ i Payne AH: Genotyp w locus P450scc determinuje różnice w ilości białka P450scc i maksymalnej produkcji testosteronu w mysich komórkach Leydiga. Mol Endocrinol 4: 1459-1464, 1990.
31. Türk G, Ateşşahin A, Sönmez M, Yüce A i Ceribaşi AO: Likopen chroni przed toksycznością jąder wywołaną cyklosporyną A u szczurów. Theriogenology 67: 778-785, 2007. 32. Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A i Ateşşahin A: Tłumienie wywołanych cyklosporyną A uszkodzeń jąder i plemników związanych ze stresem oksydacyjnym przez kwas elagowy. Int Immunopharmacol 10: 177-182, 2010.
