Kwantyfikacja zwyrodnienia neurytów ze zwiększoną dokładnością i wydajnością w modelu choroby Parkinsona in vitro, część 1

Abstrakcyjny

Zwyrodnienie neurytów wiąże się z wczesnymi stadiami chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona (PD) i stwardnienie zanikowe boczne. Jedna z metod powszechnie stosowanych do analizy degeneracji neurytów obejmuje obliczenie wskaźnika degeneracji (DI) po wykorzystaniu narzędzia Analyze Particles w programie ImageJ w celu wykrycia fragmentów neurytów na mikrofotografiach hodowanych komórek. Jednakże analizy DI są podatne na kilka rodzajów błędów pomiarowych, mogą być czasochłonne w wykonaniu i mają ograniczone zastosowanie.

Neurodegeneracja odnosi się do zmian zachodzących w neuronach lub wokół nich, które mogą wpływać na funkcje poznawcze, inteligencję, emocje, zachowanie itp. Wiele osób uważa, że ​​neurodegeneracja jest ściśle powiązana z pogorszeniem pamięci, ale może tak nie być.

Po pierwsze, neurodegeneracja nie musi oznaczać, że pamięć pogarsza się wraz z wiekiem. Niektórzy ludzie potrafią zachować dobrą pamięć i nawet rozumieć prawość. Dzieje się tak, ponieważ na pamięć danej osoby wpływa kombinacja czynników, takich jak ćwiczenia, dieta i styl życia.

Po drugie, ludzki mózg może ponownie ustanowić nowe połączenia nerwowe i utworzyć nowe wspomnienia, co nazywa się plastycznością. Niezależnie od wieku mózg stale się uczy i tworzy nowe wspomnienia. Dlatego neurodegeneracja jest po prostu naturalną zmianą w mózgu i niekoniecznie oznacza pogorszenie pamięci.

Wreszcie utrzymanie optymistycznego nastawienia może również poprawić pamięć. Zmartwienia i stres mogą mieć niekorzystny wpływ na mózg, prowadząc do utraty pamięci. Pozytywne nastawienie może promować zdrowie mózgu oraz poprawiać pamięć i zdolności poznawcze.

Podsumowując, neurodegeneracja niekoniecznie prowadzi do utraty pamięci, a optymistyczne podejście do życia może pomóc nam w utrzymaniu dobrej pamięci i zdolności poznawczych. Dlatego powinniśmy zachować optymistyczne nastawienie oraz zwiększyć intensywność ćwiczeń, diety i stylu życia, aby zachować zdrowie mózgu i pamięć. Widać, że musimy poprawić naszą pamięć. Cistanche może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche może również regulować równowagę neuroprzekaźników, takich jak zwiększanie poziomu acetylocholiny i czynników wzrostu. Substancje te są bardzo ważne dla pamięci i uczenia się. Ponadto mięso może również poprawić przepływ krwi i wspomagać dostarczanie tlenu, co może zapewnić mózgowi wystarczające odżywienie i energię, poprawiając w ten sposób witalność i wytrzymałość mózgu.

Kliknij i poznaj sposoby na poprawę funkcjonowania mózgu

Tutaj opisujemy ulepszoną metodę wykonywania analiz DI. Dokładność pomiarów zwiększono poprzez modyfikację kryteriów wyboru do wykrywania fragmentów neurytów, usuwanie z obrazów artefaktów i materiałów innych niż neuryty oraz optymalizację kontrastu obrazu. Takie ulepszenia zostały wdrożone w makrze ImageJ, które umożliwia szybką i w pełni zautomatyzowaną analizę DI wielu obrazów. Makro obejmuje operacje automatycznego usuwania ciał komórkowych z mikrofotografii, rozszerzając w ten sposób zastosowanie analiz DI do wykorzystania w eksperymentach z udziałem zdysocjowanych kultur.

Przedstawiamy wyniki eksperymentów potwierdzające, że w porównaniu z metodą konwencjonalną metoda ulepszonej analizy pozwala na pomiary z większą dokładnością, a ich wykonanie zajmuje znacznie mniej czasu.

Ponadto wykazujemy użyteczność metody do badania zwyrodnienia neurytów w modelu PD w hodowli komórkowej, przeprowadzając eksperyment ujawniający wpływ N-końcowej kinazy c-Jun (JNK) na zwyrodnienie neurytów wywołane stresem oksydacyjnym w ludzkich komórkach śródmózgowia. Tę ulepszoną metodę analizy można wykorzystać do uzyskania nowego wglądu w czynniki leżące u podstaw zwyrodnienia neuronów i postępu zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Słowa kluczowe:

Zwyrodnienie aksonów; wskaźnik zwyrodnienia; zwyrodnienie neurytów; neurodegeneracja; stres oksydacyjny; Choroba Parkinsona.

Oświadczenie o znaczeniu

Zwyrodnienie neurytów jest zdarzeniem komórkowym związanym z wczesnymi stadiami wielu typów zaburzeń neurodegeneracyjnych. Czynniki molekularne regulujące zwyrodnienie neurytów pozostają słabo poznane, a istniejące metody badania zwyrodnienia neurytów mają ograniczone zastosowanie i skuteczność. Tutaj identyfikujemy modyfikacje szeroko stosowanej procedury analizy zwyrodnienia neurytów, które zmniejszają błąd pomiaru.

Takie udoskonalenia metodologiczne włączono do makra ImageJ, ułatwiając w ten sposób szybką i całkowicie zautomatyzowaną analizę zwyrodnienia neurytów przy użyciu dużych zestawów mikrofotografii. Korzystając z modelu hodowli komórkowej choroby Parkinsona (PD), wykazujemy, że makro ułatwia dokładniejsze i wydajniejsze pomiary degeneracji neurytów, jednocześnie rozszerzając przydatność metody analizy do eksperymentów z udziałem zdysocjowanych kultur.

Wstęp

Degeneracja neurytów to proces komórkowy, podczas którego aksony lub dendryty ulegają postępującej dysfunkcji i zmianom morfologicznym, co prowadzi do utraty integralności neurytów. Degeneracja neurytów jest procesem konserwatywnym ewolucyjnie, który ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego tworzenia sieci neuronowych podczas rozwoju ośrodkowego układu nerwowego (Neukomm i Freeman, 2014).

Proces ten jest jednak uruchamiany również w odpowiedzi na różne formy urazów, takie jak uszkodzenia mechaniczne czy narażenie na leki stosowane w chemioterapii (Salvadores i in., 2017). Ponadto zwyrodnienie neuronów jest powiązane z postępem różnych chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem, w tym choroby Alzheimera, choroby Parkinsona (PD), choroby Huntingtona i stwardnienia zanikowego bocznego.

Co ciekawe, w przypadku wszystkich takich zaburzeń neurodegeneracyjnych coraz liczniejsze dowody sugerują, że zwyrodnienie neurytów jest kluczowym zdarzeniem na wczesnym etapie, które poprzedza śmierć neuronów lub wystąpienie objawów klinicznych (Serrano-Pozo i in., 2011; Adalbert i Coleman, 2013; Marangoni i in. ., 2014; Suzuki i in., 2020). Zatem badania badające czynniki regulujące ten proces komórkowy mogą ujawnić nowe cele w leczeniu różnych schorzeń neurodegeneracyjnych.

Badanie zwyrodnienia neurytów jest szczególnie ważne dla zrozumienia choroby Parkinsona, charakteryzującej się gromadzeniem agregatów białkowych zawierających α-synukleinę, postępującą utratą neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej pars Compacta (SNpc) oraz rozwojem różnorodnych objawów motorycznych i poznawczych (Aarsland i in., 2017).

Dowody z badań pośmiertnych i badań obrazowych u ludzi wskazują, że agregaty α-synukleiny występują w większej ilości we włóknach neuronalnych niż w ciałach komórkowych, a degradacja aksonów dopaminergicznych zachodzi w większym stopniu niż utrata neuronów dopaminergicznych w SNpc w okresie prowadzącym do wystąpienia objawów klinicznych (Tagliaferro i Burke, 2016).

Chociaż interakcje molekularne, które przyczyniają się do postępującego pogarszania się neurytów dopaminergicznych, pozostają nie do końca poznane, najnowsze dowody wskazują, że w degeneracji neurytów mogą pośredniczyć zdarzenia niezależne od kaskad sygnalizacyjnych leżących u podstaw śmierci neuronów (Fukui, 2016; Geden i Deshmukh, 2016). Dlatego badania bezpośrednio oceniające fizjologiczne podstawy zwyrodnienia neurytów mają kluczowe znaczenie dla opracowania terapii utrudniających wczesną progresję choroby Parkinsona.

W odpowiedzi na dowody wskazujące na kluczową rolę zwyrodnienia neurytów w postępie chorób neurodegeneracyjnych, opracowano różnorodne metody pomiaru zwyrodnienia neurytów za pomocą mikrofotografii hodowanych neuronów. Na przykład opracowano wiele różnych metod pomiaru zwyrodnienia neurytów za pomocą oprogramowania do wykrywania zmniejszonej liczby lub długości neurytów (Ofengeim i in., 2012; Johnstone i in., 2018).

Jednakże, ponieważ takie metody nie oceniają bezpośrednio fragmentacji neurytów, interpretacja wyników w celu określenia wpływu zmiennej na zwyrodnienie neurytów może być zaburzona przez potencjalny wpływ zmiennej na przerost neurytów. Niektóre grupy badawcze mierzyły również zwyrodnienie neurytów, subiektywnie oceniając obrazy neurytów na podstawie cech morfologicznych i stopnia widocznej fragmentacji (Zhai i in., 2003; Nakamura i in., 2016; Krishtal i in., 2017). Jednakże ta alternatywna metoda jest czasochłonna i może wprowadzić błąd badacza.

Jedna z metod ułatwiających obiektywny i bezpośredni pomiar fragmentacji neurytów polega na zastosowaniu algorytmu Analyze Particles firmy ImageJ do pomiaru powierzchni fragmentów neurytów na mikrofotografiach hodowanych komórek. Pomiary służą do obliczenia wskaźnika degeneracji (DI), skali od {{0}}.0 do 1,0, odzwierciedlającej stopień zwyrodnienia neurytów (Sasaki i in., 2009).

Chociaż analizy DI można stosować do wykrywania różnego stopnia fragmentacji neurytów, dokładność pomiarów jest zwykle ograniczona przez kilka źródeł błędów, a zastosowanie tej metody ogranicza się głównie do hodowli eksplantów lub komórek hodowanych w podzielonych na przedziały urządzeniach mikroprzepływowych. Co więcej, analizy DI są czasochłonne, jeśli ekstrapoluje się je na duże zestawy obrazów. W związku z tym staraliśmy się przezwyciężyć te ograniczenia, modyfikując procedurę analizy DI, aby ułatwić większą dokładność i wydajność, jednocześnie rozszerzając jej zastosowanie.

W niniejszym badaniu identyfikujemy kilka źródeł błędów powszechnie związanych z analizami DI i zgłaszamy zmiany metodologiczne, które redukują różne formy błędów. Uwzględniamy udoskonalenia proceduralne w makrze ImageJ zwanym automatycznym wskaźnikiem degeneracji neurytów (ANDI), aby całkowicie zautomatyzować analizy DI z dużych zestawów obrazów. Działanie ANDI Macro wymaga jedynie oprogramowania i plików o otwartym kodzie źródłowym i ogólnodostępnych. Pomiary uzyskane przy użyciu ANDI charakteryzują się większą dokładnością, a jednocześnie znacznie skracają czas wymagany do przeprowadzenia analiz.

Ponadto pokazujemy, w jaki sposób można zastosować nową metodę analizy do dokładnego i szybkiego pomiaru zwyrodnienia neurytów w modelu hodowli komórkowej PD obejmującym zdysocjowane komórki hodowane bez podziału na przedziały. Łącznie te udoskonalenia metodologiczne mogą prowadzić do nowego wglądu w czynniki leżące u podstaw ważnego procesu komórkowego związanego z neurodegeneracją.

Materiały i metody

Hodowlę komórkową

Hodowle ludzkich komórek śródmózgowia Lund (LUHMES) założono w ośmiostudzienkowych szkiełkach komorowych Lab Tek II pokrytych poli-L-ornityną (PLO) i fibronektyną, poli-D-lizyną (PDL) i lamininą, wszystkimi czterema substratami lub nie podłoża, jak wskazano. Aby pokryć PLO i fibronektyną, szkiełka inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej z roztworem zawierającym 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, nr katalogowy P3655).

Po przemyciu sterylną wodą (Avantor) szkiełka inkubowano z 2 mg/ml fibronektyny (Sigma-Aldrich, nr katalogowy F0895) przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Następnie szkiełka przemyto sterylnym PBS (Corning Life Sciences, nr katalogowy21-040-CV) i pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu. Aby pokryć PDL i lamininą, szkiełka inkubowano w temperaturze pokojowej z roztworem zawierającym 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, nr katalogowy P7280) i 10 mg/ml lamininy (Corning, nr katalogowy 354232).

Po całonocnej inkubacji szkiełka przemyto sterylnym PBS i pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu. Aby pokryć wszystkie cztery podłoża, powyższe procedury wykonano sekwencyjnie. Komórki LUHMES (ATCC, RRID: CVCL_B056) wysiano na powlekane szkiełka komorowe we wskazanych gęstościach w pożywce różnicującej składającej się z DMEM/F12 (Invitrogen, nr katalogowy 11330057) uzupełnionej 2 mM glutaminą (VWR), 1% (v/v) suplement N-2, 1 mg/ml tetracykliny (Sigma-Aldrich, nr katalogowy87128-25G), 1 mM N6,29-Odibutyryladenozyna cAMP (db-cAMP ; Enzo Life Sciences, katalog #BML-CN125-0100) i 2 ng/ml czynnika neurotroficznego pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF; R&D Systems, katalog #212-GD-010).

O ile nie wskazano inaczej, wszystkie hodowle wysiano na płytki z gęstością 115,000 komórek na studzienkę. Do czasu leczenia co 48 godzin wymieniano podłoże w ilości 50%. Aby zapobiec dryfowi genetycznemu, we wszystkich eksperymentach wykorzystano komórki, które pasażowano sześć lub mniej razy.

Eksperymenty z pierwotnymi kulturami neuronów współczulnych zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Wschodniego Kentucky i Uniwersytecie Wirginii. Od myszy 0–6 C56Bl/6 w dniu po urodzeniu wycięto górne zwoje szyjne, inkubowano w temperaturze 37 stopni w enzymatycznym buforze do dysocjacji i przemyto pożywką wzrostową w celu usunięcia enzymów proteolitycznych i roztarto.

Zawiesiny komórek wysiano na płytki z ośmiodołkową komorą Lab Tek II przy gęstości 7000 komórek na studzienkę. Pożywki zmieniano pierwszego dnia in vitro (DIV), a następnie wymieniano je co drugi dzień. Pożywki uzupełniono arabinofuranozydem cytozyny (Ara-C, Millipore-Sigma) na DIV1 – DIV3, aby zapobiec wzrostowi komórek nieneuronalnych, a następnie usunięto Ara-C z pożywki na co najmniej 24 godziny przed leczeniem, jak wskazano. W przypadku eksperymentów przeprowadzonych na Uniwersytecie Eastern Kentucky obejmujących traktowanie nadtlenkiem wodoru, szkiełka komory pokryto 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, katalog #P3655), 2 mg/ml fibronektyny, 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, katalog #P7280) i 10 mg/ml lamininy (Corning, nr katalogowy 354232) przed użyciem, a dysocjację przeprowadzono poprzez 30-min inkubację w buforze składającym się z DMEM (ThermoFisher, nr katalogowy11960- 044) zawierającym 0,025% trypsyna (Corning Life Sciences, nr katalogowy25-053-CI) i 0,3% kolagenaza (Worthington Biochemical, nr katalogowy LS004176).

Pożywka wzrostowa do takich eksperymentów składała się z DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (Invitrogen, nr katalogowy26140-079), 2 mM L-glutaminą (Corning, nr katalogowy25-005-CI) i 40 ng/ml czynnik wzrostu nerwów (Fisher Scientific, nr katalogowy13-257-019); Do usuwania komórek nieneuronalnych zastosowano 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich).

W przypadku eksperymentów przeprowadzonych na Uniwersytecie Wirginii obejmujących odstawienie NGF, komórki wysiano na szkiełka komorowe pokryte 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) i 10 mg/ml lamininy (Invitrogen), a dysocjację przeprowadzono przez 20-min inkubacja w buforze składającym się z DMEM/F12 zawierającym BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), kolagenazę typu 2 (4 mg/ml, Worthington Biochemical), deoksyrybonukleazę 1 (Millipore Sigma) i hialuronidazę (Sigma-Aldrich). Pożywka wzrostowa do takich eksperymentów składała się z DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (Invitrogen), 1 U/ml penicyliny/streptomycyny (Invitrogen) i 45 ng/ml NGF (oczyszczonego z gruczołów ślinowych); Do usuwania komórek nieneuronalnych zastosowano 10 mM Ara-C.

Zabiegi komórkowe

Zróżnicowane komórki LUHMES eksponowano na działanie {{0}}hydroksydopaminy (6-OHDA; Sigma-Aldrich, nr katalogowy 162957) lub roztworu nośnika we wskazanych stężeniach piątego dnia w pożywce różnicującej. Zapasy 6- OHDA przygotowano w schłodzonym PBS zawierającym 0,02% askorbinianu (Sigma-Aldrich, katalog #A5960), a porcje przechowywano w fiolkach chronionych przed światłem w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze 80°C. Po 24 godzinach traktowania komórki utrwalono poprzez inkubację w PBS zawierającym 4% paraformaldehydu (PFA) przez 25 minut w temperaturze pokojowej.

Aby określić rolę N-końcowej kinazy c-Jun (JNK) w zwyrodnieniu neurytów wywołanym stresem oksydacyjnym, hodowle traktowano wstępnie przez 1 godzinę 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, nr katalogowy S5567) lub roztworem nośnika przed całkowitą wymianą pożywki na pożywkę zawierającą 7,5 mM 6-OHDA, 7,5 mM 6-OHDA i 10 mM SP600125 lub roztwory nośnika. Zapasy SP600125 przygotowano przez rozpuszczenie inhibitora w sterylnym dimetylosulfotlenku (DMSO), a zamrożone porcje przechowywano w chronionych przed światłem fiolkach wypełnionych gazem obojętnym w temperaturze 20°C. Traktowanie przeprowadzono w taki sposób, że komórki były eksponowane na działanie nie większe niż 0,1% DMSO.

Pierwotne hodowle neuronów współczulnych traktowano DIV5. Do eksperymentów obejmujących degenerację neurytów wywołaną nadtlenkiem wodoru, hodowle poddano działaniu 500 mM nadtlenku wodoru (Sigma-Aldrich, katalog #H1009-100ML) lub roztworu nośnika składającego się ze sterylnej wody (Cytiva, katalog #SH30529.02). przez 24 godziny.

W przypadku eksperymentów obejmujących wycofanie NGF, hodowle SCG albo zastąpiono pożywkę pożywką wzrostową, albo poddano pozbawieniu NGF. Hodowle SCG pozbawione NGF przepłukano trzykrotnie pożywką wzrostową niezawierającą NGF, a następnie inkubowano w pożywce wzrostowej niezawierającej NGF przez 80 godzin bez zmiany pożywki. Po traktowaniu komórki utrwalono poprzez inkubację w 4% PFA w PBS przez 30 minut, a następnie usunięto PFA przez przepłukanie PBS.

Mikroskopia barwiąca i fluorescencyjna

Do eksperymentów z komórkami LUHMES, jak również do eksperymentów z neuronami współczulnymi traktowanymi nadtlenkiem wodoru, szkiełka z ośmioma studzienkami zawierające utrwalone komórki permeabilizowano 0,1% Triton X-100 w PBS i blokowano dla 1 godz. z 10% normalnej surowicy koziej w PBS zawierającym 0,1% Triton X-100. Następnie szkiełka inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem swoistym dla b1 tubuliny (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) w roztworze blokującym w temperaturze 4 stopni przez noc. Następnie szkiełka przemyto PBS, inkubowano z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) przez 90 minut w temperaturze pokojowej i poddano dodatkowemu przemywaniu.

W przypadku doświadczeń obejmujących barwienie hydroksylazą tyrozynową (TH), szkiełka poddano dodatkowej inkubacji w PBS zawierającym 10% normalnej surowicy koziej, 0,1% Triton X-100, przeciwciało specyficzne dla TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) w temperaturze 4 stopni przez noc. Następnie szkiełka przemyto PBS, inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889) i poddano dodatkowemu przemywaniu PBS.

Po zakończeniu znakowania immunologicznego dla bIII-tubuliny lub TH, szkiełka inkubowano z 5 mg/ml 49,69-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI; nr katalogowy D9542) w PBS przez 5 minut. Następnie szkiełka przemywano PBS i szkiełka nakrywkowe zamykano przy użyciu podłoża do mocowania Fluoromount G (Southern Biotech, nr katalogowy0100-01).

W przypadku eksperymentów z udziałem neuronów współczulnych poddanych odstawieniu NGF, szkiełka blokowano na 1 godzinę poprzez inkubację w temperaturze pokojowej w buforze składającym się z 5% normalnej surowicy koziej (Life Technologies) i 0.0005% Triton X-100 w PBS, a następnie inkubacja w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych zawierającym mysie przeciwciało przeciwko mysim Tuj1 (1:1000, Covance) przez noc w temperaturze 4°C. Następnie szkiełka przepłukano PBS, inkubowano przez 1 godzinę w kozim anty-mysim IgG Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) i 0,1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) w buforze blokującym, poddano dodatkowym płukaniom PBS i pozwolono do wyschnięcia. Szkiełka mocowano za pomocą Fluoromount-G (Southern Biotech, nr katalogowy0100-01) i przechowywano w temperaturze pokojowej.

Szkiełka zawierające komórki LUHMES wizualizowano przy użyciu obiektywu nr 20 systemu mikroskopu odwróconego Nikon Eclipse II Ti-U ze źródłem światła LED Lumencor Mira 4-Channel. Zdjęcia w 1280 1024-pikselach wykonano przy użyciu aparatu Nikon DSQi1Mc 5 MP CCD i oprogramowania NIS Elements 3.22.15 (kompilacja 738). O ile nie wskazano inaczej, wszystkie obrazy z kontrastem fazowym wykonano przy użyciu ustawień natężenia światła i czasu ekspozycji, które dały średnią intensywność tła wynoszącą 165 w 8--bitowych obrazach.

Aby zmniejszyć cieniowanie tła lub inne niespójności, przed każdą sesją mikroskopową rejestrowano obraz pustej studzienki i wykorzystywano go do korekcji tła podczas obrazowania komórek LUHMES. Slajdy zawierające neurony współczulne hodowane na Uniwersytecie Wschodniego Kentucky lub Uniwersytecie Wirginii obrazowano odpowiednio przy użyciu systemu mikroskopowego Zeiss LSM 800 lub systemu mikroskopowego Zeiss LSM 980. Obrazy wykonano przy powiększeniu 20 i rozdzielczości 1024 1024 przy użyciu oprogramowania Zen (Carl Zeiss Microscopy).

Analiza żywotności komórek

Zróżnicowane hodowle komórkowe LUHMES założono na szkiełkach komorowych Lab Tek II z ośmioma studzienkami, które powleczono, jak wskazano, różnymi substratami. Co 48 godzin przeprowadzano zmianę 50% pożywki, a komórki utrwalono 4% PFA w PBS w szóstym dniu różnicowania. Szkiełka zawierające utrwalone komórki poddano barwieniu za pomocą DAPI, a obrazy barwienia jądrowego rejestrowano za pomocą systemu mikroskopu odwróconego Nikon Eclipse II Ti-U i kamery Nikon DS-Fi1 5 MP CCD.

Zaślepiony badacz oceniał komórki jako zdrowe lub niezdrowe na podstawie wyglądu jąder. Komórki ze zmniejszoną powierzchnią jądrową lub fragmentacją jądrową uznano za niezdrowe. W każdym eksperymencie oceniano liczbę zdrowych komórek na obraz dla co najmniej pięciu pól widzenia na warunek.

Pomiary DI

Tradycyjne pomiary DI przeprowadzono przy użyciu pakietu Fiji Is Just ImageJ (FIJI) zawierającego ImageJ 1,52p metodą obejmującą szeroko cytowane parametry analizy DI (Shin i in., 2012; Di Stefano i in., 2015; Sasaki i in., 2016; Loreto i in., 2020; Shin i Cho, 2020). Ośmiobitowe obrazy zróżnicowanych komórek LUHMES z dobrze oddzielonymi drogami aksonów poddano binaryzacji przy użyciu domyślnego algorytmu binaryzacji, z opcjami binarnymi skonfigurowanymi tak, aby generować obraz z czarnymi komórkami na pierwszym planie i białym tłem.

Do ręcznego śledzenia wszystkich obszarów obrazu zawierających ciała komórek wykorzystano narzędzie do rysowania odręcznego, a wszystkie czarne piksele w obrysowanych obszarach zostały przekonwertowane na białe. Zastosowano narzędzie Pomiar w programie ImageJ do pomiaru całkowitego czarnego obszaru binarnych obrazów zawierających wyłącznie neuryty. Następnie zastosowano narzędzie Analyze Particle przy ustawieniu rozmiaru 20–10,000 pikseli i ustawieniu kołowości 0,2–1,0 w celu wykrycia fragmentów neurytów. Zsumowany obszar wszystkich fragmentów neurytów podzielono następnie przez całkowity czarny obszar, aby obliczyć DI obrazu.

W eksperymentach związanych z optymalizacją parametrów wielkości w celu identyfikacji fragmentów neurytów, do wszystkich pomiarów cząstek zastosowano kryteria kolistości {{0}}.2–1.00. Wtyczka Particle Remover (wersja 20{{10}}4/02/09), opracowana przez Wayne’a Rasbanda, została pobrana z https://imagej.nih.gov/. Tam, gdzie wskazano, zastosowano wtyczkę Particle Remover przy użyciu parametrów rozmiaru 0–9 pikseli i parametrów kołowości 0,0–1,0 w celu usunięcia małych obiektów niebędących neurytami z binarnych obrazów uzyskanych z mikrofotografii z kontrastem fazowym.

Podobnie, parametry wielkości {{0}}–4 pikseli i parametry kołowości 0–1,0 zastosowano do usunięcia małych obiektów z binarnych obrazów uzyskanych z mikrografii fluorescencyjnych przedstawiających barwienie immunologiczne b III-tubuliny. O ile nie wskazano inaczej, przed analizą DI wszystkie obrazy z kontrastem fazowym poddano wzmocnieniu kontrastu za pomocą ImageJ w celu zastosowania tabeli przeglądowej (LUT) z minimum 90 i maksymalnie 205.

Pomiar sztucznej fragmentacji

Hodowle zawierające zdrowe komórki LUHMES utrwalono 4% PFA w szóstym dniu różnicowania i znakowano immunologicznie pod kątem beta-tubuliny. Przy użyciu 20 obiektywów wykonano 1280 1024-mikrografie z kontrastem fazowym i mikrografie fluorescencyjne, z których każda przedstawiała identyczne pola widzenia, z losowo wybranych obszarów. W sumie wykonano dziesięć zestawów zdjęć z dziewięciu różnych kultur.

Do wygenerowania binarnych kopii oryginalnych mikrografii z kontrastem fazowym i fluorescencji, a także kopii mikrografii z kontrastem fazowym, które poddano binaryzacji po wzmocnieniu kontrastu poprzez zastosowanie LUT z minimalną wartością 90 i maksymalną wartością 205. Dla każdego zestawu obrazów oślepiony badacz zidentyfikował mały, 150 150-pikselowy obszar oryginalnej mikrofotografii z kontrastem fazowym, przedstawiający wyłącznie zdrowe i nienaruszone neuryty.

Rozmiar i współrzędne regionu zostały następnie zapisane w menedżerze obszaru zainteresowania (ROI) w ImageJ i wykorzystane do wykonania pomiarów DI w analogicznych obszarach binarnych obrazów z tego samego zestawu obrazów. Pomiary DI wykonano metodą tradycyjną, wykorzystując parametry wielkości fragmentów wynoszące 20 -10,000 pikseli. Ponieważ wszystkie zmierzone obszary zawierały wyłącznie nienaruszone neurony, wszelkie wykryte fragmenty uznawano za sztuczne.

ANDI Makro

Makro ANDI zostało napisane przy użyciu języka ImageJ Macro. Makro zawiera szereg operacji, które umożliwiają użytkownikowi wybranie ścieżek dla trzech katalogów, jednego katalogu zawierającego obrazy neuronów znakowanych immunologicznie markerem neuronalnym, takim jak b III-tubulina, drugiego katalogu zawierającego odpowiednie obrazy przedstawiające barwienie jądrowe i trzeciego katalogu przeznaczony do zapisywania plików wynikowych. Następnie za pomocą serii operacji ImageJ obliczane są obszary fragmentów i całkowite obszary neurytów obrazów w wybranych katalogach. W skrócie, obraz przedstawiający oznakowanie jądrowe jest otwierany, poddawany wzmocnieniu kontrastu i binaryzowany. Wtyczka do usuwania cząstek służy do usuwania małych, niejądrowych artefaktów z binarnego obrazu, a binarny obraz jest poddawany serii rozszerzeń i erozji.

Otwiera się odpowiedni obraz komórek znakowanych immunologicznie beta-tubuliną (lub innym markerem neuronalnym) i poddaje wzmocnieniu kontrastowemu. Binarny obraz przedstawiający powiększone jądra komórkowe jest następnie odejmowany od obrazu przedstawiającego komórki znakowane immunologicznie pod kątem b III-tubuliny, tworząc w ten sposób obraz przedstawiający wyłącznie neuryty. Obraz neurytów jest następnie binaryzowany i poddawany usuwaniu cząstek o wielkości od 0 do 4 pikseli. Obszar fragmentu Neurite jest obliczany poprzez zastosowanie algorytmu analizy cząstek do pomiaru cząstek o kolistości od 0.2 do 1.0 i rozmiarze od 5 do 10,0000 pikseli. Całkowity obszar neurytów oblicza się, stosując narzędzie Pomiar w celu obliczenia całkowitego czarnego obszaru. Obraz przedstawiający binarny obszar neurytów z wyróżnionymi fragmentami jest zapisywany w katalogu wyznaczonym przez użytkownika wraz z plikami .csv raportującymi pomiary fragmentarycznego obszaru neurytów i całkowitego obszaru neurytów.

Oprócz wyżej wymienionych operacji, makro zawiera kilka dodatkowych operacji, które ułatwiają obsługę i ograniczają błędy użytkownika. Należą do nich funkcje usuwające informacje o skali z obrazów i zapewniające uzyskiwanie pomiarów w jednostkach pikseli; skonfiguruj ustawienia kolorów ImageJ i opcje binarne w celu odpowiedniego odejmowania i binaryzacji obrazu; sprawdzić, czy wybrane katalogi dla obrazów barwienia b III-tubuliną i barwienia DAPI zawierają równą liczbę obrazów; zamknij wcześniej używane obrazy, aby wydłużyć czas przetwarzania; jasne wyniki z poprzednich analiz przed wykonaniem nowych analiz; i zapobiegaj błędom związanym z tworzeniem pliku .ini w systemie Windows 10.

Na potrzeby eksperymentów obejmujących analizę neuronów współczulnych makro ANDI zostało poprawione w celu uwzględnienia operacji przedstawiającej okno dialogowe umożliwiające użytkownikowi kontrolowanie, ile razy binarne obrazy jąder zostaną rozszerzone. Wersja ANDI zawierająca tę wersję została nazwana ANDI v1.1. Zmiana wartości w oknie dialogowym na wyższą liczbę zwiększa wielkość usuwania somy, natomiast zmiana wartości na niższą liczbę zmniejsza wielkość usuwania somy. Wartość domyślna to 12, co oznacza liczbę rozszerzeń stosowanych we wszystkich eksperymentach z udziałem komórek LUHMES. Wartość 16 zastosowano do usunięcia większych obszarów ciała komórkowego podczas analiz neuronów współczulnych.

Makro ANDI jest oprogramowaniem typu open source i jest swobodnie dostępne do użytku lub modyfikacji za pośrednictwem następującego adresu URL: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Dokładne działanie ANDI zostało sprawdzone na wielu komputerach osobistych z systemem operacyjnym Windows 10. Zestaw obrazów przedstawiający kultury komórkowe LUHMES wykazujące różne stopnie degeneracji neurytów jest również dostępny pod wyżej wymienionym adresem internetowym i może zostać wykorzystany do zbadania dokładnego wykonywania makra przez inne typy komputerów. Adres internetowy umożliwia także dostęp do protokołu opisującego sposób użycia makra.

Szacunki czasowe

Aby ocenić czas wymagany do ręcznego wykonania pomiarów DI, mikrografie z kontrastem fazowym przedstawiające komórki LUHMES potraktowane roztworem nośnika, 2,5 mM 6-OHDA, 5,0 mM 6-OHDA lub 7,5 mM 6-OHDA poddano punktacji DI przy użyciu wcześniej ustalonych metod (Kraemer i in., 2014). Każdy obraz poddano wzmocnieniu kontrastu i binaryzacji. Następnie użyto odręcznego narzędzia ImageJ do cyfrowego usunięcia wszystkich przedstawionych ciał komórek z binarnych obrazów. Narzędzie Analiza cząstek zostało użyte do pomiaru fragmentów o kolistości od 0,2 do 1,0 i rozmiarze od 20 do 10000 pikseli, a narzędzie Zmierz zostało użyte do określenia całkowitego obszaru neurytów.

Wartości dotyczące fragmentarycznego obszaru neurytów i całkowitego obszaru neurytów przeniesiono do arkusza kalkulacyjnego w programie Microsoft Excel, a do obliczenia wyników DI zastosowano operację matematyczną w programie Excel. Po otwarciu obrazu za pomocą programu ImageJ zmierzono czas wymagany do ręcznego wykonania każdej z tych procedur. Średni czas analizy obliczono na podstawie łącznie 36 obrazów. Obrazy uzyskano z dziewięciu niezależnych preparatów hodowli komórkowych, a analizy przeprowadzono przy użyciu jednego obrazu na warunki leczenia z każdego preparatu hodowli komórkowej. Aby określić szybkość pomiarów DI wykonywanych przy użyciu makra ANDI, wykorzystano te same zestawy obrazów do określenia czasu wymaganego do otwarcia makra w ImageJ, uruchomienia operacji na makrach, przeniesienia danych do arkusza kalkulacyjnego Excel i obliczenia DI.

Statystyka

Porównania ilościowe przedstawiono w postaci wykresów pudełkowych i wąsów, gdzie środkowa linia przedstawia medianę, prostokąty rozciągają się do 25. i 75. percentyla, a wąsy przedstawiają 5. i 95. percentyla. Średnie porównano statystycznie w GraphPad Prism 9.1.2 za pomocą powtarzanych pomiarów ANOVA z porównaniami post hoc przy użyciu poprawki Sidáka. Normalność danych ilościowych sprawdzono za pomocą testu Shapiro – Wilka w IBM SPSS 26.

W przypadku naruszenia założenia normalności (rys. 1C, 3D) porównania grupowe przeprowadzono za pomocą nieparametrycznego testu Friedmana z testem Dunna dla porównań post hoc. Analizy korelacji są przedstawiane w postaci wykresów rozrzutu i obejmują linie najlepszego dopasowania. Zależności takie analizowano za pomocą korelacji iloczynu Pearsona lub r Spearmana w przypadku naruszenia założenia normalności. Normalność reszt do analizy korelacyjnej oceniano poprzez wizualną kontrolę odpowiednich wykresów QQ.

Współczynniki korelacji iloczynu Pearsona porównano ze sobą za pomocą asymptotycznego testu z-Steigera (Steiger, 1980; Lee i Preacher, 2013). Nie wykluczono żadnych wartości odstających. Za istotność statystyczną przyjęto p, 0,05. Wartości P zaokrągla się do czterech miejsc po przecinku i podaje w całym tekście. Wielkości efektów i 95% przedziały ufności podano także dla analiz parametrycznych, przy czym wielkości efektów opisano w tekście głównym, a przedziały ufności wymieniono w Tabeli 1.

Dostępność danych

Dodatkowe dane dotyczące niniejszego artykułu zostaną udostępnione na uzasadnioną prośbę.

Dostępność kodu

Kod/oprogramowanie opisane w artykule jest bezpłatnie dostępne w Internecie pod adresem https://github.com/kraemerb/kraemerlab. Kod jest dostępny jako Dane Rozszerzone 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com