Ilościowe badanie proteomiczne ujawnia szlak fibrynogenu w policystycznej chorobie wątroby Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Wyniki
3.1. Nerki i wątroba nie podlegają tym samym mechanizmom torbielowatym
Wcześniejsze badania wykazały, że wczesna inaktywacja genu Pkd1 (przed p12) powoduje szybki rozwój choroby policystycznej (okno torbielowate), natomiast inaktywacja po p14 prowadzi do późnego powstania cysty po 4–5 miesiącach, o łagodnym fenotypie (okno nietorbielowate). [19]. Korzystając z tego samego ortologicznego modelu ADPKD (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], zbadaliśmy, czy to okno rozwoju nerek odpowiada w czasie podobnemu oknu rozwoju wątroby. Aby dokonać bezpośredniego porównania z naszymi poprzednimi badaniami [37], myszy indukowano tamoksyfenem w celu inaktywacji genu Pkd1 w 14. i 12. dniu po urodzeniu (p12) i uśmiercano w wieku 30 dni (p30). Co ciekawe, zaobserwowaliśmy fenotyp torbielowaty w obu punktach czasowych z różnym stopniem choroby (łagodnym i ciężkim), co sugeruje, że nerki i wątroba mają niezależne okna rozwojowe torbielowate (ryc. 1a) i/lub możliwe różne czasy i postęp choroby . Nie stwierdzono różnic pomiędzy samcami i samicami w tym wieku uboju pomiędzy obydwoma oknami inaktywacji (dla każdej grupy mutantów zastosowano n=6). Zwierzęta z mutacją p14 wykazywały łagodniejszy fenotyp niż grupa z mutacjami p12 z niższymi wartościami wskaźnika torbielowatości, liczbą cyst i funkcją wątroby zgodnie z wartością surowicy ALP (ryc. 1b – d). Jest to pierwsze badanie pokazujące różne okna/mechanizmy rozwojowe w przypadku niewydolności wątroby i nerek Pkd1. Te różnice molekularne będą musiały zostać określone w przyszłych badaniach.
Rycina 1. Charakterystyka fenotypu torbielowatej wątroby w dniu 30 w stadiach p12 i p14. Delecja Pkd1 w p12 niesie ze sobą poważniejszą cystogenezę. ( a ) Reprezentatywne obrazy makroskopowe i mikroskopowe barwione hematoksyliną-eozyną z wątrób Pkd1cond/cond; Mysz Tam-Cre typu dzikiego (WT, Pkd1cond/cond; Tam-Cre-) i mutanta (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre + ) z delecją genu Pkd1 indukowaną przez tamoksyfen w 14. dniu po urodzeniu (grupa p14) i 12. (grupa p12). Wszystkie myszy uśmiercono w p30. Pasek skali, 2 mm (górny panel) 100 µm (dolny panel). n oznacza liczbę próbek na grupę, a Bd oznacza przewód żółciowy. ( b, c ) Wskaźnik torbielowaty wątroby i liczba cyst o różnych fenotypach. ( d, e ) Wartości ALP i ALT w surowicy krwi. Słupki reprezentują średnie ± SEM we wszystkich przypadkach. Za wynik istotny uznano p < 0,05 w teście t-Studenta (dwustronny). ns oznacza brak znaczenia. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Kliknij, aby cistanche herba na chorobę nerek
3.2. Analiza proteomiczna strzelby i SWATH-MS w PLD
Jak przedstawiono na rycinie 2, przeprowadziliśmy różnicową analizę proteomu w obu stadiach torbielowatych (p12 – ciężka choroba torbielowata i p14 – łagodna choroba torbielowata) mutantów (KO) w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego (WT), w celu zidentyfikowania i scharakteryzować istotne mechanizmy molekularne podlegające cystogenezie wątroby i postępowi choroby.
Rysunek 2. Ilustrowany schemat przepływu pracy. Zastosowaliśmy mysi model ADPKD (myszy Pkd1cond/cond; Tam-Cre), w którym genetyczną inaktywację Pkd1 indukowano przez podanie tamoksyfenu w 10. dniu po urodzeniu (p10) i p11 (szybki postęp choroby) lub p15 i p16 (opóźniony postęp choroby ) zgodnie z przełącznikiem rozwojowym cystogenezy nerek, definiując dwie grupy badania nazwane odpowiednio p12 i p14 [19]. W obu grupach użyliśmy n równego lub większego niż sześć osobników typu dzikiego (WT) i mutantów (KO) w każdym stanie, a wszystkie zwierzęta uśmiercono w p30. Badaliśmy różnicowy proteom wątroby WT i KO w obu stopniach ciężkości torbielowatości wątroby (ryc. 1), stosując zarówno ilościową analizę proteomiczną SWATH – MS, jak i analizę DDA-MS zależną od danych shotgun. Spośród białek o istotnej zmianie w liczebności skorzystaliśmy z bioinformatyki. Ryc. 2. Ilustrowany schemat przepływu pracy. Zastosowaliśmy mysi model ADPKD (myszy Pkd1cond/cond; Tam-Cre), w którym genetyczną inaktywację Pkd1 indukowano przez podanie tamoksyfenu w 10. dniu po urodzeniu (p10) i p11 (szybki postęp choroby) lub p15 i p16 (opóźniony postęp choroby ) zgodnie z przełącznikiem rozwojowym cystogenezy nerek, definiując dwie grupy badania nazwane odpowiednio p12 i p14 [19]. W obu grupach użyliśmy n równego lub większego niż sześć osobników typu dzikiego (WT) i mutantów (KO) w każdym stanie, a wszystkie zwierzęta uśmiercono w p30. Badaliśmy różnicowy proteom wątroby WT i KO w obu stopniach ciężkości torbielowatości wątroby (ryc. 1), stosując zarówno ilościową analizę proteomiczną SWATH – MS, jak i analizę DDA-MS zależną od danych shotgun. Spośród białek, których liczebność uległa znacznej zmianie, wykorzystaliśmy narzędzia bioinformatyczne do wykrycia nowych celów terapeutycznych i ścieżek zaangażowanych w chorobę. Na koniec zweryfikowaliśmy te cele, stosując najpierw strategie in silico (analiza DDA vs SWATH), a na końcu strategie in vivo, a także RT-qPCR, Western blot i immunohistochemię. p oznacza dzień poporodowy
Wzór ekspresji białek w cytogenezie wątroby Najpierw przeprowadziliśmy analizę proteomicznej spektrometrii masowej za pomocą akwizycji zależnej od danych typu shotgun DDA-MS lub DDA. Analiza ta pozwala na scharakteryzowanie proteomu na podstawie całych i pojedynczych próbek, zapewniając obecność/nieobecność białek z dużą czułością, ale bez zapewnienia ich ilościowego określenia. Rozważaliśmy wyłącznie wszystkie białka ulegające zróżnicowanej ekspresji w więcej niż pięciu niezależnych próbkach z łącznie sześciu próbek, odpowiednio dla stadiów p14 i p12 osobników typu dzikiego i zmutowanych (Rysunek S1). W p14 zidentyfikowano 1 białko wyłącznie WT (lub białko o obniżonej regulacji dla choroby) i 7 białek wyłącznie MUT (regulowane w górę), podczas gdy w p12 zaobserwowano osiem białek wyłącznych dla WT i sześć białek wyłącznych dla MUT (Rysunek S1).
Następnie zastosowaliśmy metodę, która pozwoliła nam określić ilościowo białka ulegające różnej ekspresji. Przeprowadziliśmy ilościową analizę proteomiczną SWATH – MS na tych samych próbkach, których użyliśmy do DDA, uzyskując ~ 1500 białek na próbkę i ponad 2000 białek w każdej badanej grupie. Najpierw przeprowadziliśmy normalizację sumy powierzchni całkowitej (TAS), aby ocenić, czy nasze próbki mają rozkład normalny, jak pokazano na rysunkach S2 i S3. Następnie badaliśmy białko wykazujące znaczące różnice między grupami typu dzikiego i zmutowanymi. Tabela 1 pokazuje białka o znaczącej zmianie w liczebności z dwukrotnym wzrostem (regulacja w górę) lub spadkiem (regulacja w dół) i znaczącą skorygowaną wartością p (zgodnie z parametrycznym testem t-Studenta) w WT vs Próbki MUT w p14 i p12. W sumie sześć białek wykazywało znaczące różnice w obfitości białka pomiędzy grupami WT p14 i MUT-p14 (pięć białek o zwiększonej ekspresji i jedno białko o obniżonej ekspresji). Pomiędzy WT-p12 i MUT-p12 26 białek (20 białek z regulacją w górę i 6 białek z regulacją w dół) wykazało znaczące różnice (ryc. 3a i tabela 1). Graficznie te różnice można zaobserwować za pomocą wykresów wulkanów, które wygenerowano poprzez wykreślenie log(2)-krotnych zmian dla wszystkich zidentyfikowanych białek względem ich wartości p -log(10) (Rysunek 3b). Znaczące różnice między poziomami obfitości białek można wizualizować na mapie cieplnej z zindywidualizowanymi wartościami zgodnie z obszarami biblioteki widmowej i poziomem grupowania w analizie mapy cieplnej klastrów (rysunki 3c i S4). Te skupiska wykryte za pomocą analizy SWATH – MS pomagają nam zidentyfikować jakościowo oddzielone próbki, które należy uwzględnić w analizie ilościowej (rysunek S5). Przeprowadzono nienadzorowaną wielowymiarową analizę statystyczną przy użyciu analizy głównych składowych (PCA) w celu porównania danych między próbkami (rysunek S6). Mapa cieplna i dane PCA wykazały powtarzalność próbek w trzech powtórzeniach, ponieważ trzy repliki były blisko skupione w obu analizach. Zarówno w PCA, jak i w analizie skupień na mapie cieplnej (rysunki S5 i S6) możemy zaobserwować, jak niektóre próbki nie grupowały się prawidłowo, nakładając się na oba skupienia. Niemniej jednak widzimy tendencję do oddzielania danych w klastrach typu dzikiego i zmutowanych. Niższą liczbę białek ze znaczącymi różnicami w p14 w porównaniu z p12 można uzasadnić różnym stopniem nasilenia (ryc. 2), co sugeruje, że liczba białek i szlaków wzrasta w zależności od ciężkości i statusu choroby fenotypu torbielowatego.
3.3. Klastrowanie, wzbogacanie szlaków i analiza interakcji białko-białko ekspresji genów w PLD
Aby ustalić funkcję związaną z białkami o różnej ekspresji zidentyfikowanymi za pomocą analizy SWATH-MS, wykorzystaliśmy kilka narzędzi bioinformatycznych i form analiz. Analizy terminów i ścieżek Gene Ontology (GO) przeprowadzono przy użyciu FunRich [39,40], String [41] i Reactome [42]. Białka sortowano w analizie wzbogacania genów FunRich. Jeśli chodzi o proces biologiczny, najbardziej wzbogacona grupa białek dla grupy p14 (łagodna torbielowata) była związana z transportem kwasów tłuszczowych i biosyntezą prostaglandyn, a dla grupy p12 (silna torbielowata) z aktywnością fibrynogenu/fibryny, adhezją komórka-komórka/macierz i metabolizmem procesu (Rysunek 4a, górny panel). ANXA2 i kompleks fibrynogenu były dwoma najbardziej wzbogaconymi składnikami komórkowymi odpowiednio w grupach p14 i p12. Ponadto przestrzeń zewnątrzkomórkowa była składnikiem komórkowym o najwyższym odsetku białek w obu grupach (ryc. 4a, dolny panel). Podobnie tę samą analizę przeprowadzono za pomocą analizy strun, identyfikując różne procesy metaboliczne jako główny proces biologiczny i przestrzeń zewnątrzkomórkową jako najbardziej wzbogacony składnik komórki; zgodne z wynikami GO (rysunek S7a). Na koniec powtórzyliśmy analizę za pomocą platformy Reactome, stwierdzając, że najbardziej wzbogaconymi szlakami są metabolizm i układ odpornościowy (rysunek S7b).
Przeprowadzono również analizę białko-białko lub analizę skupień opartą na analizie strun w celu zbadania możliwych interakcji białko-białko (interakcje z dowodami eksperymentalnymi). Zidentyfikowano liczne interakcje białek w różnych grupach (Rysunek S8), ale jeden klaster w p14 i drugi w p12 były najbardziej istotne w oparciu o liczbę interakcji między białkami i poziom ekspresji (Rysunek 4b). Klaster p14- zawiera białko aneksyny A2 (ANXA2_P07356) związane z kilkoma funkcjami komórkowymi, takimi jak fibrynoliza, ruchliwość komórek (w komórkach nabłonkowych), białko powiązane z aktyną interakcje cytoszkielet i macierz komórkowa [43], oddziałując z dwoma innymi białkami biorącymi udział w wewnątrzkomórkowym transporcie lipidów (FABP1_P12710 i FABP5_Q05816). Co ciekawe, w klastrze p12- zidentyfikowano inną istotną grupę białek z bardzo silną interakcją białko-białko pomiędzy kilkoma fibrynogenami (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22 }}E9PV24 i FIBGG_Q8VCM7). Fibrynogeny biorą udział we wzroście hepatocytów, pośredniczą w rozprzestrzenianiu się płytek krwi, powstawaniu kolagenu śródmiąższowego i zmianach zwłóknieniowych [44]. Ponadto odkryto, że dodatkowe białka oddziałują z fibrynogenami (Rysunek S8), takimi jak składnik p amyloidu w surowicy (SAMP_P12246), hemopeksyna (HEMO_Q91X72) lub oksydaza hydroksykwasów 2 (HAOX{ {37}}Q9NYQ2). Zgodnie z wynikami ciągów, kompleksy ANXA2 i fibrynogenu były również najbardziej wzbogaconymi składnikami komórkowymi zidentyfikowanymi za pomocą analizy FunRich (ryc. 4a). Co ciekawe, porównując dane uzyskane za pomocą analizy DDA i SWATH, potwierdziliśmy, że kilka białek zidentyfikowanych za pomocą SWATH zostało również zidentyfikowanych za pomocą analizy DDA, w tym kilka związanych z białkami kompleksu fibrynogenu (SAMP/Apcs i S10A9/S100a9; Tabela S3).
3.4. Walidacja analizy SWATH–MS demaskuje kompleks fibrynogenu jako nowy mechanizm molekularny powiązany z PLD
Na podstawie tych danych wybraliśmy z analizy SWATH – MS (rysunek S9) zmienione białka związane z kompleksem fibrynogenu na etapach p12 i p14 do walidacji in vivo za pomocą RT-qPCR, Western blot i immunohistochemii, aby ustalić ich możliwie potwierdzenie cele choroby. Osiem z 10 z tych wybranych białek zostało zweryfikowanych na poziomie mRNA metodą RT-qPCR (Rysunek 5); jeden zwiększony na etapie 14-(ANXA2_P07356) i w grupie p12-(SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 i FIBG_Q8VCM7) i jeden w dół- regulowany w grupie p12 (HAOX2_Q9NYQ2). Co ciekawe, ekspresja genów dwóch białek z większą odległością lub mniejszą liczbą interakcji z grupą fibrynogenu (ILK i S10A9) była jedyną, która nie została potwierdzona (ryc. 5c).
Zwiększenie poziomu kompleksu fibrynogenu (białka ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG i HAOX2) zostało dodatkowo potwierdzone analizą Western blot (WB) (Figura 6). Ogólnie ekspresja genów i WB były wysoce zgodne z danymi proteomicznymi SWATH-MS. Na koniec przeprowadziliśmy także walidację immunohistochemiczną kompleksu fibrynogenu w próbkach zmutowanej i policystycznej wątroby (ryc. 7). Barwienie fibrynogenu było silnie zwiększone w komórkach nabłonkowych wyściełających torbiele i poszerzeniach dróg żółciowych (ryc. 7a). Wyniki te po raz pierwszy demaskują kompleks fibrynogenu jako możliwy szlak związany z cystogenezą wątrobową i możliwy przyszły cel terapeutyczny PLD.
Rysunek 5. Walidacja możliwych celów PLD metodą RT-qPCR. Ekspresja genów 8 do 10 wybranych celów skorelowana z danymi SWATH-MS. RT-qPCR zwiększonej ekspresji wybranej docelowej aneksyny A2 p14 (Anxa2) (a); regulowane w górę p12 celuje w składnik amyloidu p, surowicę (Apcs, gen SAMP), fibrynogenopodobny 1 (Fgl1), łańcuch beta fibrynogenu (Fgb), hemopeksynę (Hpx), łańcuch alfa fibrynogenu (Fga), łańcuch gamma fibrynogenu (Fgg) (b), kinaza połączona z integryną (Ilk) i S10{{30}} białko wiążące wapń A9 (S100a9) (c); i obniżona docelowa oksydaza hydroksykwasowa 2 p12 (Hao2) (d). dla każdej grupy białek zastosowano n=6. Gapdh użyto jako genu sprzątania. Słupki reprezentują średnie ± SEM. Zastosowano dwustronny test t-Studenta i za istotną uznano wartość p < 0,05. ns: nieistotne (p większe lub równe 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Rycina 7. Zwiększenie poziomu kompleksu fibrynogenu w nabłonku torbielowatym. ( a, b ) Reprezentatywne obrazy immunohistochemii fibrynogenu w przewodzie żółciowym (górny panel) i miąższu wątroby (dolny panel) ( a ) i jego ocena ilościowa ( b ). Dla każdej grupy użyto n=6. Analiza immunohistochemiczna wykazała zwiększoną regulację fibrynogenu przez nabłonek torbielowaty. Próbki odpowiadały grupie p12. Paski skali reprezentują 100 µm. Bd oznacza przewód żółciowy. Słupki reprezentują średnie ± SEM. Zastosowano dwustronny test t-Studenta i za istotną uznano wartość p < 0,05. *** p < 0,001.
Wsparcie dla Wecistanche – największego eksportera Cistanche w Chinach:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kup więcej szczegółów specyfikacji:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
