R. Vesicarius L. Wykazuje Nefroprotekcyjne działanie przeciw stresowi oksydacyjnemu wywołanemu przez cisplatynę
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Md. Mahmudul Hasan1, Bardzo. Sayla Tasmin2, Ahmed M. El-Shehawi3, Mona M. Elseehy4Abu Reza1i Ariful Haque2*
Abstrakcyjny
Tło:Cisplatyna jest wybitnym lekiem przeciwnowotworowym, ale jej stosowanie zostało znacznie zmniejszone ze względu na ciężką nefrotoksyczność. R. vicarious L. to warzywo liściaste, które wykazuje działanie antyangiogenne, przeciwzapalne, antyproliferacyjne, hepatoprotekcyjne i nefroprotekcyjne. Dlatego to badanie zostało zaprojektowane w celu sprawdzenia ekstraktu metanolowego (RVE) pod kątem możliwego działania nefroprotekcyjnego.
Metody:Przede wszystkim, in vitro, aktywność antyoksydacyjna RVE została potwierdzona na podstawie zdolności wymiatania wolnych rodników 2, 2-difenyl-1-pikrylohydrazyl (DPPH). Następnie samce myszy Swiss Albino traktowano cisplatyną (2,5 mg/kg) przez 5 kolejnych dni w celu wywołania nefrotoksyczności. Wyzdrowienie z nefrotoksyczności analizowano przez podawanie zwierzętom RVE (25, 50 i 100 mg/kg) dootrzewnowo (ip) przez następne 5 kolejnych dni. Po zakończeniu leczenia myszy uśmiercono i pobrano nerki. Część z nich została zhomogenizowana w buforze fosforanu sodu do oceny poziomu dialdehydu malonowego (MDA), druga część została wykorzystana do oceny ekspresji genów (NQO1, p53 i Bcl-2). Ponadto oceniano zdolność RVE do neutralizacji nadtlenku wodoru (H2O2) w komórkach HK-2 in vitro. Wreszcie bioaktywne fitochemikalia w RVE zostały określone za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS).
Wyniki:RVE wykazywał aktywność przeciwutleniającą in vitro w sposób zależny od dawki z wartością IC50 37,39 ± 1,89 ug/ml.
Leczenie RVE znacząco (p < {{0}}.05)="" zmniejszyło="" zawartość="" mda="" w="" tkance="" nerek.="" poza="" tym="" ekspresja="" genów="" nqo,="" p53="" i="" bcl-2="" była="" istotnie="" (p="">< 0,05)="" osłabiona="" w="" sposób="" zależny="" od="" dawki="" w="" wyniku="" podania="" rve.="" rve="" istotnie="" (p="">< 0,05)="" odwrócił="" poziom="" h2o2="" w="" komórkach="" hk-2="" do="" prawie="" normalnego.="" z="" gc-ms,="" dziesięć="" związków,="" w="" tym="" trzy="" znane="" przeciwutleniacze="" "4h-piran-4-jeden,="" 2,="" 3-dihydro-3,="" 5-dihydroksy-6-metylo-"="" ,="" wykryto="" „kwas="" heksadekanowy”="" i="" „skwalen”.="" ekstrakt="" był="" bogaty="" w="" alkaloid="">
Wniosek:Ogólnie rzecz biorąc, RVE ma działanie ochronne przed uszkodzeniem nerek wywołanym cisplatyną.
Słowa kluczowe:Cisplatyna, R. zastępczy, myszy, nerki, komórki HK-2, stres oksydacyjny, gen NQO1
Cistanche deserticola zapobiega chorobie nerek, kliknij tutaj, aby pobrać próbkę
Wstęp
Stres oksydacyjny jest wynikiem dysproporcji między powstawaniem reaktywnych form tlenu (ROS) a regularnymi mechanizmami obrony antyoksydacyjnej [1]. Regularne reakcje biochemiczne, częsta ekspozycja na niekorzystne środowisko oraz zwiększone spożycie ksenobiotyków powodują wytwarzanie ROS [1]. ROS oddziałują z resztami cysteinowymi cząsteczek sygnałowych wrażliwych na redoks, w tym czynników transkrypcyjnych, białkowych fosfataz tyrozynowych i kinaz białkowych; w konsekwencji utlenianie grup tiolowych w tych resztach prowadzi do zmian docelowych białek, działań biologicznych, zdolności sygnalizacyjnych, odporności i dodatkowych paradygmatów żywych/martwych komórek [2]. Związki chemiczne zawierające tlen o właściwościach reaktywnych są znane jako ROS, które obejmują wolne rodniki i cząsteczki nierodnikowe, takie jak odpowiednio ponadtlenek i H2O2 [3]. Stres oksydacyjny wywoływany przez ROS jest powiązany z etiologią wielu chorób, w tym raka. Ostra białaczka szpikowa (AML) to rakowy wzrost komórek krwi w szpiku kostnym. Zdarzenia komórkowe i molekularne leżące u podstaw AML obejmują uszkodzenie DNA, propagację klonalną, zwiększoną śmierć komórek i dalszą niestabilność genetyczną, które są wynikiem stresu oksydacyjnego indukowanego przez ROS [4]. Fizjologia człowieka została obdarzona licznymi mechanizmami, które mogą generować przeciwutleniacze w celu ochrony przed stresem oksydacyjnym, co prowadzi do ochrony komórek przed skutkami toksycznymi i służy zapobieganiu chorobom [5]. Jednak komórki rozwijają endogenne mechanizmy przeciwdziałania stresowi oksydacyjnemu i zachowania wymaganych ROS [6].
NAD(P)H: oksydoreduktaza chinonowa 1 (NQO1) jest flawoenzymem [7], który może katalizować redukcję dwu- lub czteroelektronową i wykorzystuje tę właściwość do detoksykacji chinin [8]. Może chronić komórki przed uszkodzeniem oksydacyjnym, utrzymując na boku cykl redoks i zmniejszając produkcję wolnych rodników [8]. Oprócz detoksykacji ksenobiotyków, NQO1 bierze również udział w neutralizacji ponadtlenków, modulacji degradacji proteasomów p53 [9], inhibicji Bcl-2 [10] oraz zwiększonej podatności na uszkodzenie komórek [11].
Cisplatyna jest pierwszym lekiem przeciwnowotworowym na bazie platyny, zatwierdzonym przez FDA (Food and Drug Administration) [12]. Cisplatyna wywiera apoptozę poprzez indukcję stresu oksydacyjnego i nadekspresję genu supresorowego nowotworu p53 [12]. Kilka działań niepożądanych, w tym nefrotoksyczność, hepatotoksyczność, gastrotoksyczność, ototoksyczność, mielosupresja i neurotoksyczność, jest wynikiem stresu oksydacyjnego wywołanego cisplatyną [12]. Te działania niepożądane znacząco ograniczyły stosowanie cisplatyny, chociaż ma ona wybitne działanie przeciwnowotworowe. Wiadomo, że cisplatyna indukuje stres oksydacyjny i tłumi gen NQO1 w nerkach myszy [13]. Dlatego poszukiwanie i walidacja skutecznych naturalnych źródeł antyoksydantów staje się obszarem świadomości. Spożycie antyoksydantów pochodzenia roślinnego, takich jak flawonoidy, karotenoidy i związki fenolowe, może prowadzić do ochrony przed chorobami sercowo-naczyniowymi, zaćmą i rakiem [14].
R. vicarious (Polygonaceae) jest znany jako „Takpalong/Chukapalong/Amlabetom” w języku bengalskim [15]. Rośnie na terenach pustynnych i półpustynnych Azji, Australii i Afryki Północnej [16]. Jest to mało zbadana zagrożona roślina w Bangladeszu. W Bangladeszu ludzie spożywają całą roślinę jako warzywo po ugotowaniu z solą, różnymi przyprawami i olejem. Czasami ludzie używają tylko świeżych liści w mieszanej sałatce jako alternatywy dla sałaty. Surowe liście są lekko kwaśne, ale po ugotowaniu stają się bardzo kwaśne. Co więcej, podczas gotowania do potraw rybnych dodaje się zwykle niewielką ilość liści, aby uzyskać lekko kwaśny smak.
Roślina ta jest używana jako zioło warzywne i lecznicze na całym świecie [17]. Liście i nasiona są stosowane jako antidotum odpowiednio na jad węża i skorpiona [17]. W leczeniu ludowym R. vicarious był od dawna stosowany w leczeniu chorób wątroby, złego trawienia, zaparć, pali, wymiotów, wzdęć, dolegliwości serca, bólów, schorzeń śledziony, niestrawności, bólu zębów, zapalenia oskrzeli, astmy, świerzbu, leukodermy i jako środek przeczyszczający, żołądkowy, przystawkowy, tonizujący, moczopędny i przeciwbólowy [18]. Roślina ta zawiera wiele ważnych biologicznie związków, w tym flawonoidy, antrachinony, karotenoidy, witaminy, lipidy i kwasy organiczne, które są dobrze znane jako środki przeciwutleniające, przeciwbakteryjne i przeciwnowotworowe [19]. Każda część tej rośliny zawiera podwyższoną ilość kwercetyny (flawonoidów) [15]. Roślina ta zawiera 0,25 mg witaminy A, 1,33 mg witaminy C, 2,37 mg witaminy E [15], 3,38 mg flawonoidów i 5,66 mg polifenoli [20] na 100 g suchej masy.
Shahat i wsp. [21] wykazali antyangiogenne i antyproliferacyjne działanie metanolowego (80%) ekstraktu z zastępczej części nadziemnej R. przeciwko rakowi wątrobowokomórkowemu w modelu szczurzym. Inne badanie wykazało potencjał antyangiogenny in vitro ekstraktu R. vicarious [22]. Ekstrakt metanolowy z całego R. zastępczego zapewnia ochronę przed hepatotoksycznością indukowaną przez czterochlorek węgla in vivo [23]. Działanie przeciwzapalne u królików zostało wykazane przez metanolowy ekstrakt z liści R. vicarious [24]. Niedawne badanie [25] wykazało działanie nefroprotekcyjne in vivo frakcjonowanego etanolowego ekstraktu R. zastępczego przeciwko toksyczności gentamycyny i dichromianu potasu.
Biorąc pod uwagę powyższe informacje, postanowiliśmy zbadać wpływ ekstraktów R. vicarious (RVE) na odzyskiwanie z nefrotoksyczności indukowanej cisplatyną poprzez utrzymywanie ekspresji genu NQO1 w modelu zwierzęcym.
korzyści zdrowotne cistanche: leczenie chorób nerek
Materiały i metody
Chemikalia i odczynniki
Cisplatynę i 2, 2-difenyl-1-pikrylohydrazyl (DPPH) zakupiono w firmie SIGMA-ALDRICH (USA).
Zestaw do testu kolorymetrycznego kreatyniny (ID produktu – 700 460) zakupiono w Cayman Chemical (USA). Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), płodową surowicę bydlęcą (FBS) i antybiotyk (10,000 U/ml penicyliny i 10,000 ug/ml streptomycyny) zakupiono od Gibco (Gibco Laboratories, USA). Zestaw ROS-Glo™ H2O2 Assay i GoTaq® qPCR Master Mix otrzymano z firmy Promega (USA). Zestaw do odwrotnej transkrypcji TIAN-Script M-MLV zakupiono w TIANGEN (Chiny), a startery od IDT (Integrated DNA Technologies, Malezja). Wszystkie inne chemikalia i odczynniki użyte w tym eksperymencie miały czystość analityczną.
Pobieranie próbek roślin i przygotowywanie ekstraktów
Świeże rośliny zastępcze R. zostały zakupione na lokalnym targu w Sonadighi, Rajshahi, Bangladesz. Okaz rośliny został zidentyfikowany i uwierzytelniony przez dr Ahmada Humayana Kabira z Wydziału Botaniki Uniwersytetu Rajshahi w Bangladeszu. Wzór na bon nr. 00095 był przechowywany w zielniku Wydziału Botaniki Uniwersytetu Rajshahi. Nadziemne części rośliny zostały oczyszczone, wysuszone w temperaturze 37 stopni, zmielone na gruboziarnisty proszek za pomocą suszarki elektronicznej i przechowywane w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze 4 stopni. Drobny proszek (10 g) rozpuszczono w metanolu (500 ml). Zawartość była sonikowana (Soniprep 150, Chiny) przy 20 kHz przez 10 min. Filtrację ekstraktu przeprowadzono przy użyciu papieru filtracyjnego z włókna szklanego (Macherey NAGEL, GmBH, Niemcy) z DURAN Filtering Apparatus (niemiecki). Na koniec przesącz zatężono przy użyciu liofilizatora (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, USA). Ekstrakt został ostatecznie nazwany RVE.
Test aktywności antyoksydacyjnej in vitro
Zdolność antyoksydacyjną RVE in vitro obliczono na podstawie zmiatania DPPH, jak opisano wcześniej [26] z niewielką modyfikacją. Zdolność RVE do wychwytywania rodników DPPH oceniano na podstawie zamiany fioletowej barwy DPPH na żółtą. Mieszanina reakcyjna w każdej probówce mikrowirówkowej (2 mL) składała się z 950 μL metanolowego roztworu rodników DPPH (0,1 mM) i 50 μL RVE z pięciu różnych stężeń (200, 500, 1000, 2000 i 4000 ug /ml metanolu), aby uzyskać końcowe stężenia 10, 25, 50, 100 i 200 µg/ml. Inną probówkę zawierającą 50 µl metanolu i 950 µl metanolowego roztworu DPPH trzymano jako kontrolę. Probówki pozostawiono na 30 min w ciemnym miejscu. Absorbancję mieszanin mierzono przy 517 nm za pomocą spektrofotometru GENESYS 10S UV-VIS (Thermo SCIENTIFIC, USA). Wreszcie procent aktywności wymiatania rodników (RSA) obliczono na podstawie odbarwienia DPPH, stosując następujący wzór: procent RSA=[(ADPPH - ARVE)/ADPPH] × 100, gdzie ADPPH jest absorbancją roztworu DPPH (kontrola), a ARVE to absorbancja roztworu RVE. Stężenie, przy którym RVE skutkowało 50 procentowym RSA, określono jako wartość IC50 i obliczono za pomocą wykresu, umieszczając procent RSA w stosunku do różnych zastosowanych stężeń RVE.
Zwierzęta doświadczalne i projektowanie eksperymentalne
Samce myszy Swiss Albino w wieku 42 dni (30-32 g masy ciała) aklimatyzowano przez 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu w pomieszczeniu (temperatura około 25 ± 2 stopnie i ~ 50 procent wilgotności, 12 h cykl ciemno/światło). Woda pitna i żywność były dostarczane bez ograniczeń.
Myszy losowo podzielono na osiem grup (n {{0}}). Pierwsza (kontrolna) grupa została potraktowana 0,2 ml 0,9% NaCl. Kolejne cztery grupy leczono cisplatyną w dawce 2,5 mg/kg przez 5 dni w odstępie 24 godzin. Po podaniu cisplatyny jedna grupa (druga grupa) została pozostawiona bez dalszego leczenia i przydzielona jako zestresowana grupa kontrolna. Trzecią, czwartą i piątą grupę dalej leczono RVE odpowiednio w dawce 25, 50 i 100 mg/kg przez 5 dni. Kolejne trzy grupy leczono RVE tylko w dawkach odpowiednio 25, 50 i 100 mg/kg przez 5 dni. Cisplatynę i RVE rozpuszczono w wodzie destylowanej. Wszystkie zabiegi podawano dootrzewnowo. Po 24 godzinach ostatniego leczenia zwierzęta uśmiercono po zwichnięciu szyjki macicy [25]. Następnie otrzewna została otwarta nożyczkami, pobrano krew po nakłuciu serca, a nerki pobrano kleszczami. Krew poddano badaniu poziomu kreatyniny w surowicy. Nerki poddano ocenie poziomu dialdehydu malonowego i ekspresji genów.
Pomiar kreatyniny w surowicy
Stężenie kreatyniny w surowicy mierzono przy użyciu zestawu Creatinine Colorimetric Assay Kit-700460 (Cayman Chemical, USA) zgodnie z protokołem producenta dostarczonym z zestawem.
Pomiar peroksydacji lipidów w nerkach
Dialdehyd malonowy (MDA) jest końcowym produktem peroksydacji lipidów w tkance nerkowej i zwykle jest mierzony jako wskaźnik produkcji ROS. Jednak poziom MDA mierzono w tkance nerkowej zgodnie z wcześniejszym badaniem [27]. Najpierw tkankę nerek homogenizowano w buforze fosforanu sodu (0,1 M, pH 7,4). Roztwór reakcyjny zawierający 0,8 procent kwasu tiobarbiturowego (1,5 ml), 8,1 procent SDS (200 μl), 20 procent (pH 3,5) kwasu octowego (1,5 ml) i dH2O (600 μl) dodano do 100 µl homogenizowanej tkanki, a następnie mieszaninę inkubowano w 95 stopniach przez 1 godzinę. Po schłodzeniu, mieszaniny wirowano przy 10,000 g przez 10 min w 4 stopniach i mierzono absorbancję supernatantu przy 532 nm ze standardowym 1, 1, 3, 3- tetrametoksypropanem. Ilość białka całkowitego zmierzono za pomocą zestawu Bradford Protein Assay (BIO-RAD, USA) i porównując je ze standardową albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Intensywność nadtlenków lipidów została wyrażona jako nanomole (nM) MDA na miligram (mg) białka.
Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR w czasie rzeczywistym)
PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono jak opisano wcześniej [28, 29]. Całkowity RNA z tkanki nerki wyizolowano przy użyciu odczynnika TRIzol® (Invitrogen) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Wyizolowany RNA (1 ug) został następnie przekształcony w cDNA. Najpierw pobrano 2 μl losowego heksameru (10 μM), 2 μl dNTP (10 mM), 1 μg RNA i HO bez nukleaz do 15 μl i inkubowano przez 5 minut w temperaturze 70 stopni. Mieszaninę natychmiast umieszczono na lodzie na 2 min. Następnie do każdej probówki dodano 4 µl buforu pierwszej nici (5x) i 1 µl odwrotnej transkryptazy M-MLV i inkubowano przez 10 min i 50 min.
min przy 25 stopniach i 42 stopniach, odpowiednio. Na koniec enzym odwrotnej transkryptazy M-MLV inaktywowano przez inkubację mieszaniny w 95 stopniach przez 5 minut. Zsyntetyzowane produkty cDNA poddano reakcji PCR w czasie rzeczywistym w celu oznaczenia ilościowego ekspresji genów NQO1, p53 i Bcl-2 przy użyciu specyficznych starterów (Tabela 1). Każdą reakcję (10 μl) przeprowadzono w trzech powtórzeniach, składających się z 5 μl GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, USA), 0,5 μl (10 mM) każdego startera, 3 μl wody wolnej od nukleaz i 1 μl cDNA w 48-dołkowych płytkach reakcyjnych. Cykle termiczne przeprowadzono przy użyciu maszyny do real-time PCR (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, USA) w następujących warunkach cykli: 95 stopni przez 10 min, a następnie 40 cykli 95 stopni przez 30 s, 50 stopni przez 30 s i 72 stopnie przez 25 s. Swoistość reakcji PCR potwierdzono analizując krzywą topnienia przy 95 stopniach przez 15 s, 45 stopniach przez 15 s i 95 stopniach przez 15 s. Swoistość reakcji PCR potwierdzono analizując krzywą topnienia przy 95 stopniach przez 15 s, 45 stopniach przez 15 s i 95 stopniach przez 15 s. Względną ocenę ilościową ekspresji genu przeprowadzono stosując endogenny gen GAPDH jako kontrolę w oparciu o metodę ΔΔCq.
Hodowla komórkowa i leczenie
Ludzką linię komórek nabłonkowych kanalików nerkowych, komórki HK-2, utrzymywano w DMEM uzupełnionej 10% FBS i antybiotykami (50 U/ml penicyliny i 50 ug/ml streptomycyny) w inkubatorze z 5% CO2 i 95 procent wilgotności przy 37 stopniach.
Test pomiaru H2O2
Poziom H2O2 w komórkach HK-2 oszacowano przy użyciu zestawu ROS-Glo™ H2O2 Assay (Promega, USA) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta zestawu. Komórki HK-2 (1000 komórek) w 70 μl DMEM umieszczono w dołkach 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Po umożliwieniu przyczepienia komórek do powierzchni ściany, 10 µl DMEM ze studzienek płytki do mikromiareczkowania zastąpiono 10 µl cisplatyny (25 µM w DMEM) i trzymano w inkubatorze przez 12 godzin. Następnie dodano 10 µl RVE w celu uzyskania końcowych stężeń 125, 250 i 500 µg/ml w DMEM i inkubowano przez kolejne 12 godzin. Następnie do każdego dołka dodano 20 µl roztworu substratu H2O2 i 100 µl roztworu do wykrywania ROS-Glo™. Reakcję inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 min. Na koniec zmierzono luminescencję za pomocą luminometru GloMax (Promega, USA).
Analiza GC-MS
Analizę GC-MS RVE (rozpuszczonego w metanolu) przeprowadzono jak opisano wcześniej [30] przy użyciu GCMS-QP2020 (SHIMADZU) zawierającego autosampler (AOC{ {5}}s), automatyczny wstrzykiwacz (AOC-20i) i chromatograf gazowy (GC-2010 Plus) połączony ze spektrometrem mas wyposażonym w SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Kolumna kapilarna Sil MS (30 m × 0,25 μm ID × 0,25 μm DF). Gaz nośny Hel utrzymywano przy stałym natężeniu przepływu 1,72 ml/min, a objętość wtrysku 5 µl poddano działaniu podziału 10:1. Temperatura wtryskiwacza była utrzymywana na poziomie 220 stopni, temperatura źródła jonów wynosiła 280 stopni, temperatura pieca była zaprogramowana od 80 stopni (przytrzymanie przez 2 min), ze wzrostem z 5 stopni/min do 150 stopni (czas trzymania 5,0 min), następnie 5 stopni/min do 280 stopni, kończąc na 8 minutach izotermy przy 280 stopniach. Widma masowe rejestrowano przy 1,5 kV z interwałem skanowania wynoszącym 0,5 s, a próbka przebiegała w zakresie 45–350 m/z. Opóźnienie rozpuszczalnika wynosiło od 0 do 3 min, a całkowity czas przebiegu GC-MS wynosił 55 min. Względne stężenie wykrytych związków zmierzono porównując jego średnią powierzchnię piku z całkowitą powierzchnią. Interpretację widma mas w GC-MS przeprowadzono przy użyciu baz danych National Institute Standard and Technology (NIST), w tym NIST08, NIST08s i NIST14.
Analiza statystyczna
Analizy statystyczne przeprowadzono metodą ANOVA zgodnie z testem Dunnetta T3 przy użyciu oprogramowania IBM SPPS (wersja 20). Dane są wyrażone jako średnie ± odchylenie standardowe (SD). Istotne porównanie wzięto pod uwagę przy p<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
Wyniki
Test aktywności antyoksydacyjnej in vitro
Chociaż wcześniej donoszono, że RVE ma aktywność przeciwutleniającą, ponownie sprawdziliśmy aktywność przeciwutleniającą naszego ekstraktu, wykorzystując zdolność wymiatania wolnych rodników DPPH. RVE neutralizował DPPH w zależności od dawki (ryc. 1). RVE wykazywał znaczną aktywność przeciwutleniającą in vitro, a obliczona wartość IC50 RVE wynosiła 37,39 ± 1,89 ug/ml.
Pomiar kreatyniny w surowicy
Poziom kreatyniny w surowicy myszy był istotnie (p < {0}}.05)="" zwiększony="" po="" podaniu="" cisplatyny="" (tabela="" 2).="" leczenie="" rve="" znacząco="" (p="">< 0,05)="" poprawiło="" poziom="" kreatyniny="" w="" sposób="" zależny="" od="" dawki="" (tabela="">
Pomiar peroksydacji lipidów w nerkach
W porównaniu z kontrolą, cisplatyna znacząco (p < {{0}}.05)="" zwiększyła="" zawartość="" mda="" w="" tkance="" nerek="" myszy="" (tabela="" 3).="" w="" przeciwieństwie="" do="" tego,="" leczenie="" rve="" znacząco="" (p="">< 0,05)="" przywróciło="" mda="" prawie="" do="" normy="" w="" sposób="" zależny="" od="" dawki="" (tabela="">
PCR w czasie rzeczywistym
Cisplatyna znacząco (p < {{0}}.05)="" zmniejszyła="" ekspresję="" mrna="" nqo1="" o="" 0.15-krotnie="" i="" zwiększyła="" mrna="" p53="" i="" bcl-2="" ekspresja="" odpowiednio="" 24="" i="" 4.2-krotnie="" (ryc.="" 2).="" rve="" istotnie="" (p="">< 0.05)="" łagodziło="" ekspresję="" mrna="" nqo1,="" p53="" i="" bcl-2="" w="" sposób="" zależny="" od="" dawki="" (ryc.="" 2).="" w="" porównaniu="" z="" jedyną="" grupą="" leczoną="" cisplatyną,="" ekspresja="" mrna="" nqo1="" była="" zwiększona="" 3,57,="" 6,36="" i="" 9,28-krotnie="" przy="" 25,="" 50="" i="" 100="" mg/kg="" rve,="" odpowiednio="" (ryc.="" 2a).="" ponownie,="" ekspresja="" mrna="" p53="" została="" zmniejszona="" o="" 0,63,="" 0,46="" i="" 0,21-krotnie="" przy="" odpowiednio="" 25,="" 50="" i="" 100="" mg/kg="" rve="" (ryc.="" 2b).="" ekspresja="" mrna="" bcl{-2="" była="" również="" zmniejszona="" o="" 0,71,="" 0,40="" i="" 0,32-krotnie="" przy="" odpowiednio="" 25,="" 50="" i="" 100="" mg/kg="" rve="" (ryc.="" 2c).="" nie="" stwierdzono="" jednak="" istotnych="" (p=""> 0,05) zmian w poziomie ekspresji genów NQO1, p53 i Bcl-2 z powodu leczenia RVE (ryc. 3).
H2O2test pomiarowy
W teście pomiaru H2O2 H2O2poziom został uznany za proporcjonalny do luminescencji. Podawanie cisplatyny istotnie (p < {0}.05)="" zwiększyło="" poziom="" h2o2="" 2,2-krotnie="" (ryc.="" 4).="" leczenie="" rve="" znacznie="" zmniejszyło="" (p="">< 0.05)="" poziom="" h2o2="" o="" 0,25,="" 0,38="" i="" 0.49-krotnie="" przy="" odpowiednio="" 125,="" 250="" i="" 500="">
Analiza GC-MS
W sumie 10 związków (tabela 4 i rys. 5), w tym „izoborneol, eter pentametylodisilanylowy (alkohol seskwiterpenowy)”, „tymina (nukleozasada pirymidynowa)”, „4H-Piran-4-jeden, 2,{{ 8}}dihydro-3,5-dihydroksy-6-metylo- (saponina)", "Ester metylowy kwasu heksadekanowego (ester metylowy kwasu tłuszczowego)", "9, 12- Kwas oktadekadienowy, ester metylowy (ester metylowy kwasu tłuszczowego)”, „9-kwas oktadecenowy (Z)-, ester metylowy (ester metylowy kwasu tłuszczowego)”, „stearynian metylu (ester metylowy kwasu tłuszczowego)”, „ftalan diizooktylu (ester)”, „13-Dokosenamid, (Z)- (alkaloid)” i „Skwalen (triterpen)” wykryto w RVE.
korzyści cistanche tubolosa: obniżenie poziomu lipidów we krwi
Dyskusja
Naturalne i syntetyczne przeciwutleniacze zostały wszechstronnie zbadane i okazały się funkcjonalne zarówno w zapobieganiu, jak i łagodzeniu toksyczności w fizjologii zwierząt [31]. Suplementy przeciwutleniające są składnikiem powstałym na drodze syntezy chemicznej lub ekstrakcji z naturalnej żywności, ale nie są one identyczne pod względem składu z przeciwutleniaczami dostępnymi w żywności [5]. Dlatego z czasem opinie są rozdzielone, czy syntetyczne antyoksydanty dają podobne korzyści zdrowotne jak naturalne antyoksydanty [32]. Pojawia się potrzeba zmniejszenia stosowania syntetycznych suplementów przeciwutleniających i poszukiwania alternatywnych, tanich, odnawialnych, naturalnych i prawdopodobnie bezpieczniejszych źródeł skutecznych naturalnych przeciwutleniaczy.
Jednym z najważniejszych mechanizmów jest szlak czynnika erytroidalnego-2 związanego z czynnikiem jądrowym-2 (Nrf2), który ogólnie chroni komórki przed stresem oksydacyjnym indukowanym przez stresory egzogenne lub endogenne [27]. Skuteczne antyoksydanty indukują ekspresję Nrf2, który dalej przemieszcza się do jądra komórkowego i wiąże się z elementem odpowiedzi antyoksydacyjnej (ARE), który wywołuje ekspresję genu detoksykacji II fazy i genu antyoksydacyjnego NQO1 [33, 34]. NQO1 ulega szerokiej i zróżnicowanej ekspresji w sposób specyficzny dla tkanki. NQO1 jest cytozolową przeciwutleniającą flawoproteiną, która katalizuje 2-elektronową redukcję chinonów do hydrochinonów, co prowadzi do detoksykacji elektrofilów i przewidywania cyklu redoks [35]. Zgodnie z wcześniejszym badaniem [36], -lapachone aktywuje NQO1, co dodatkowo zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom NAD plus i chroni nerkę przed ostrym uszkodzeniem wywołanym cisplatyną.
Wiadomo, że cisplatyna indukuje uszkodzenie błony filtracyjnej kłębuszków poprzez stres oksydacyjny, stan zapalny i apoptozę, co łącznie prowadzi do zmniejszenia szybkości filtracji kłębuszkowej i utraty prawidłowej przepuszczalności błony [37]. W związku z tym wzrósł poziom kreatyniny w surowicy. Kreatynina w surowicy jest jednym z potencjalnych markerów czynności nerek. Leczenie cisplatyną zwiększyło zawartość MDA w tkance nerkowej, która jest wtórnym produktem peroksydacji lipidów i doniesienie to jest zgodne z poprzednimi badaniami [27, 35, 37, 38]. Leczenie RVE znacząco obniżyło zawartość MDA w tkance nerek. Jednocześnie obniżył się również poziom kreatyniny, co wskazuje na łagodzący wpływ RVE.
Poza tym ekspresja NQO1 była znacząco obniżona, a ekspresja p53 i Bcl-2 była znacząco zwiększona po ekspozycji na cisplatynę. Pod względem ekspresji NQO1 i p53 in vivo nasz wynik jest zgodny z wcześniejszym badaniem [13]. Niedawne badanie [39] wykazało, że cisplatyna znacząco obniżyła ekspresję Bcl-2 w nerkach myszy, ale niespodziewanie stwierdziliśmy podwyższoną ekspresję. Ta różnica może wynikać z różnicy dawek [40], ponieważ Mohamed i współpracownicy [39] stosowali 8 mg/kg przez 12 dni, podczas gdy my używaliśmy 2,5 mg/kg tylko przez 5 dni. W innym badaniu [41] stwierdzono, że cisplatyna może zwiększać ekspresję Bcl-2 w dawce, gdy nie jest cytotoksyczna. Ponownie, zwiększona ekspresja Bcl-2 uwrażliwia komórki na stres oksydacyjny [40].
Jednak ekspresja p53 jest niska w normalnych warunkach fizjologicznych, ale oczekuje się, że zostanie zwiększona po leczeniu cisplatyną, ponieważ ten środek chemioterapeutyczny na bazie platyny aktywuje zależny od p53 szlak apoptotyczny. Gdy leczyliśmy myszy cisplatyną, p53 było znacznie zwiększone w nerkach myszy w porównaniu z kontrolą. Inny protoonkogen Bcl-2 jest również skorelowany z poziomem ekspresji NQO1. Naśladując ekspresję p53, odkryliśmy również, że poziomy Bcl- 2 wzrosły po leczeniu cisplatyną, ale powróciły znacząco po leczeniu RVE. Jest to możliwe, w odpowiedzi na stres oksydacyjny dochodzi do aktywacji genu p53, co skutkuje zatrzymaniem cyklu komórkowego, starzeniem się lub apoptozą [6]. W przypadku detoksykacji nadekspresję NQO1 często uważa się za skorelowaną z apoptozą w komórkach nowotworowych [10], chociaż mechanizm leżący u podstaw apoptozy i nadekspresji NQO1 jest nadal kontrowersyjny. Ponadto w raku wątrobowokomórkowym nadekspresja NQO1 zmniejsza ekspresję Bcl-2 [10]. Protoonkogen Bcl- 2 ma również p53, podobnie jak korelacja z ekspresją NQO1. p53 jest specyficznym dla sekwencji czynnikiem transkrypcyjnym, który jest aktywowany przez wiele rodzajów stresu komórkowego [42], podczas gdy nadekspresja Bcl-2 działała jako stabilizator porów mitochondrialnych, ułatwiając uwalnianie cytochromu c pod wpływem stresu oksydacyjnego [12]. W naszym przypadku sprawdziliśmy obie odpowiedzi genów za pomocą leczenia cisplatyną w prawidłowej tkance nerki i stwierdziliśmy ich zwiększoną ekspresję. Leczenie RVE przywróciło ekspresję p53 i Bcl-2 do prawie normalnej w sposób zależny od dawki. Ten typ zniesienia ekspresji Bcl-2 został również pokazany przy użyciu zmiatacza ROS Trolox [43]. Ponadto poziom H2O2 był również znacznie zwiększony w komórkach HK-2 w wyniku traktowania cisplatyną in vitro. Po leczeniu RVE poziom H2O2 został znacząco przywrócony do około normy. Być może wynika to z efektu leczenia RVE, które zwiększa ekspresję NQO1 [44], co ma wpływ na ochronę przed stresem oksydacyjnym [6].
Chromatogram GC-MS potwierdził istnienie dziesięciu związków w RVE. Wśród nich "4H-Piran- 4-jeden, 2, 3-dihydro-3, 5-dihydroksy-6-metylo-", "kwas heksadekanowy" i " Skwalen” są dobrze znanymi przeciwutleniaczami [45–47]. Te trzy związki łącznie prawdopodobnie wywierały synergistyczny efekt nefroprotekcyjny. Wcześniejsze badania donosiły również o indukcji ekspresji NQO1 przez witaminę A [48], witaminę C [49], witaminę E [50], flawonoidy [51] i polifenole [50]. Dlatego ten raport sugeruje wyjaśnienie, czy ten konkretny ekstrakt zawiera cokolwiek spośród witaminy A, witaminy C, witaminy E, flawonoidów i polifenoli, czy nie.
Wniosek
Ogólne odkrycie sugeruje, że RVE jest fizjologicznie skuteczny w ochronie nerek przed uszkodzeniem wywołanym cisplatyną. Dlatego kluczowe jest wyjaśnienie dokładnych związków odpowiedzialnych za łagodzenie nefrotoksyczności wywołanej cisplatyną, które mogą stać się korzystne w zastosowaniu u ludzi.
Podziękowanie
Autorzy są wdzięczni Bangladeszskiej Radzie Badań Naukowych i Przemysłowych (BCSIR) oddziału Rajshahi za zapewnienie wsparcia laboratoryjnego w ilościowej ocenie RNA.
Wkład autorów
MMH wykonało projektowanie eksperymentów, eksperymenty, analizę i przygotowanie danych, pisanie i redagowanie rękopisów, poprawianie i redagowanie rękopisów; MST i MME przeprowadziły eksperymenty i analizę danych; AME i MAR uczestniczyli w nadzorze i zasobach; AH był odpowiedzialny za konceptualizację, nadzór, zasoby i redakcję rękopisów. Wszyscy autorzy
recenzował rękopis. Autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczny rękopis.
Finansowanie
Obecne prace zostały sfinansowane przez Taif University Researchers Supporting Project number (TURSP - 2020/75), Taif University, Taif, Arabia Saudyjska.
Dostępność danych i materiałów.
Wszystkie istotne dane są dostępne i mogą być dostarczone na żądanie odpowiedniego autora.
Deklaracje
Zatwierdzenie etyki i zgoda na udział
Zasady etyczne przeprowadzania tego eksperymentu zostały zatwierdzone przez Institutional Animal, Medical Ethics, Biosafety and Biosecurity Committee (IAMEBBC), Institute of Biological Sciences (IBSc), University of Rajshahi i zostały przedstawione pod numerem notatki 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. Wszystkie metody zostały wykonane zgodnie z wytycznymi i przepisami przedstawionymi przez ww. komisję etyczną. To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). „Zgoda na udział” nie dotyczy tego badania.
Dane autora
1 Laboratorium Biologii Molekularnej i Nauk o Białku, Wydział Inżynierii Genetycznej i Biotechnologii, Wydział Nauk o Życiu i Ziemi, Uniwersytet Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesz. 2 Laboratorium Patologii Molekularnej, Instytut Nauk Biologicznych, Uniwersytet Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesz. 3 Department of Biotechnology, College of Science, Taif University, PO Box 11099, Taif 21944, Arabia Saudyjska. 4 Katedra Genetyki, Wydział Rolnictwa, Uniwersytet Aleksandryjski, Aleksandria 21545, Egipt.
Bibliografia
1. Bagchi K, Puri S. Wolne rodniki i przeciwutleniacze w zdrowiu i chorobie: przegląd. East Mediterr Zdrowie J. 1998; 4:350-60.
2. Koh EM, Lee EK, Song CH, Song J, Chung HY, Chae CH i in. Ferulat, aktywny składnik kiełków pszenicy, łagodzi zaburzenia równowagi PTK/PTP wywołane stresem oksydacyjnym i inaktywację PP2A. Toksykolu Res. 2018;34(4):333–41.
3. Hassan AI, Ibrahim RY. Niektóre profile genetyczne w wątrobie myszy Ehrlicha powodują wodobrzusze z nowotworem pod wpływem napromieniowania. J Radiat Res Appl Sci. 2014;7(2):188–97.
4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY i in. Udział stresu oksydacyjnego w nawrocie ostrej białaczki szpikowej. J Biol Chem. 2010;285(20):15010-5.
5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Wolne rodniki, antyoksydanty w chorobie i zdrowiu. Int J Biomed Sci. 2008;4:89–96.
6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. Role oksydoreduktazy NAD (P) H-chinonu 1 (NQO1) w progresji raka i chemooporności. J Clin Exp Oncol. 2017;6:1-6.
7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: oksydoreduktaza chinonowa 1 (NQO1) pod względem wrażliwości i odporności na chinony przeciwnowotworowe. Biochem Pharmacol. 2012;83(8):1033-40.
8. Dinkova-Kostova AT, Talalay P. NAD (P) H: oksydoreduktaza akceptora chinonu 1 (NQO1), wielofunkcyjny enzym antyoksydacyjny i wyjątkowo wszechstronna cytoprotekcja. Arch Biochem Biofizy. 2010;501(1):116–23.
9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP i in. Hamowanie NADPH dikumarolem: oksydoreduktaza chinonowa indukuje hamowanie wzrostu raka trzustki poprzez mechanizm, w którym pośredniczy ponadtlenek. Cancer Res. 2003;63(17):5513–20.
10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. Nadekspresja NAD(P)H: oksydoreduktaza chinonowa 1 hamuje proliferację komórek raka wątrobowokomórkowego i indukowaną apoptozę poprzez aktywację szlaku AMPK/PGC-1. Biol komórki DNA. 2017;36(4):256–63.
11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. Tłumienie oksydoreduktazy NAD(P)H-chinonowej 1 zwiększa podatność komórek raka dróg żółciowych na środki chemioterapeutyczne. J Exp Clin Cancer Res. 2014;33(1):1–13.
12. Dasari S, Tchounwou PB. Cisplatyna w terapii nowotworów: molekularne mechanizmy działania. Eur J Pharmacol. 2014;740:364-78.
13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. S-allilomerkaptocysteina łagodzi nefrotoksyczność wywołaną cisplatyną poprzez tłumienie apoptozy, stresu oksydacyjnego i stanu zapalnego. Składniki odżywcze. 2017;9(2):166.
14. Matkowski A. Roślinna kultura in vitro do produkcji przeciwutleniaczy – przegląd. Biotechnol Zas. 2008;26(6):548–60.
15. El-Bakry AA, Mostafa HAM, Alam EA. Aktywność przeciwutleniająca Rumex vicarious L. w fazie wzrostu wegetatywnego. Azjatycka J Pharm Clin Res. 2012;5:111–7.
16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) w Australii: ponowne rozpatrzenie. Nuycia. 1984; 5:75– 122.
17. Shahat AA, Alsaid MS, Alyahya MA, Higgins M, Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: Aktywność induktora oksydoreduktazy chinonowej 1 niektórych roślin leczniczych Arabii Saudyjskiej. Planta Med. 2013;79(06):459–64.
18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. Profil bioaktywnych związków Rumex vicarious L.J Food Sci. 2011;76(8): C1195-202.
19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde-Filho PF i in. Źródła alfa-, beta-, gamma-, delta- i epsilon-karotenów: przegląd XX wieku. Rev Biustonosze. 2008;18(1):135–54.
20. Laouini SE, Ouahrani MR. Badanie fitochemiczne, działanie przeciwutleniające i przeciwbakteryjne in vitro ekstraktu Rumex vicarious L. Science Study Res: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017;18:367–76.
