Apoptoza za pośrednictwem reaktywnych gatunków tlenu pierwotnych i przerzutowych ludzkich komórek raka okrężnicy

WSTĘP

Rak jelita grubego jest jednym z najczęściej występujących nowotworów na świecie (Brenneri in., 2014), a częstość jej występowania stale rośnie i szacuje się, że w 2035 r. wyniesie 2,4 miliona przypadków, co wynika z nowoczesnej diety i stylu życia, a także zmniejszonej aktywności fizycznej. Obecne wysiłki nie są wystarczające, aby zwalczyć obecną epidemię raka jelita grubego i dlatego potrzebne są nowe podejścia do skutecznej profilaktyki i leczenia, w tym zmiany stylu życia w połączeniu z bezpieczniejszymi alternatywnymi interwencjami, takimi jak fitoterapeutyki (Weidneri in., 2015). Fitoterapia, czyli stosowanie roślin leczniczych w leczeniu chorób, była nieuniknioną częścią starożytnej historii ludzkości. Rośliny lecznicze od dawna wykorzystywane są jako alternatywne źródła leczenia nowotworów i stanowią ponad sześćdziesiąt procent środków przeciwnowotworowych stosowanych w medycynie konwencjonalnej (Balunas i Kinghorn, 2005; Saibui in., 2015). Niektóre z najbardziej znanych przykładów obejmują ekstrakty zCatharantus różanyG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) i Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg i Newman, 2005; da Rochai in., 2001). Wykazano, że kilka ekstraktów ziołowych i substancji fitochemicznych wywiera działanie przeciwnowotworowe w przypadku raka jelita grubego, co przypisuje się indukcji wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) i związanej z tym apoptozy komórek nowotworowych, tak jak w przypadku ekstraktów zMelisa officinalis(Weidnerai in., 2015)

Wśród kandydatów fitoterapeutycznychCistanche tubulosaWykazano, że pasożytnicza roślina pustynna Orobanchaceae (Jiang i in., 2009), szeroko rozpowszechniona w suchych i półsuchych regionach Afryki, Azji i regionu Morza Śródziemnego, ma cenne właściwości lecznicze. Cistanche tubulosa jest szeroko stosowana w medycynie tradycyjnej i sugeruje się, że ma działanie lecznicze w przypadku niewydolności nerek, chorobliwego upławy, krwotoku macicznego, niepłodności u kobiet i zaparć starczych (Jiang i in., 2009). Oprócz tradycyjnych zastosowań leczniczych, ważne leki Właściwości Cistanche Tubulosa były intensywnie badane w ciągu ostatniej dekady, włączając w to działanie wazorelaksacyjne (Yoshikawa i in., 2006), działanie hepatoprotekcyjne (Morikawa i in., 2010), działanie przeciwhiperglikemiczne i hipolipidemiczne (Xiong i in., 2013). Sugerowano również, że Cistanche Tubulosa jest silnym środkiem wzmacniającym układ odpornościowy, promotorem tworzenia kości oraz środkiem przeciwstarzeniowym i przeciw zmęczeniu (Xu i in., 2014). Ponadto wykazano, że ekstrakt Cistanche tubulosa blokuje odkładanie się amyloidu w modelu choroby Alzheimera (Wu i in., 2015). Pomimo różnorodnych zastosowań terapeutycznych, nie badano jeszcze wpływu Cistanche Tubulosa jako potencjalnego środka przeciwnowotworowego.

W niniejszej pracy zbadaliśmy przeciwnowotworowe działanie Cistanche Tubulosa na dwie linie komórkowe pierwotnego i dwie przerzutowe raka okrężnicy oraz potencjalne mechanizmy leżące u podstaw tego działania.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIAŁY I METODY

Pobieranie i przygotowanie ekstraktu roślinnego

Próbki Cistanche tubulosa pobrano z terenów pustynnych Kataru w 2014 roku, a autentyczność rośliny potwierdziła herbatolog. Próbki voucherów są archiwizowane w Dziale Toksykologii i Wielozadaniowości ADLQ. Wysuszone na słońcu próbki roślin zmielono za pomocą młyna Retsch Knife Mill Grindomix GM300 na drobny proszek. Dwadzieścia gramów proszku ekstrahowano za pomocą 200 ml ultraczystej wody przez noc w temperaturze 37 stopni na wytrząsarce obrotowej przy 200 obr./min. SurowyEkstrakty z Cistanche tubulosa (CTE)wirowano przez 30 min przy 8000 obr./min. w celu uzyskania osadu nierozpuszczalnych związków, zebrano supernatant i liofilizowano przy użyciu suszarki Labconco Freezone 6 plus Freeze. Wysuszony ekstrakt rekonstytuowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle'a firmy Dulbecco (DMEM, SIGMA, Niemcy) do stężenia 20 mg/ml i sterylnie filtrowano przez filtr membranowy o średnicy porów 0,2- mikrona.

Linie komórkowe i utrzymanie komórek

Linie komórkowe ludzkiego raka okrężnicy CaCo2, SW620 i LoVo uzyskano z Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Niemcy), natomiast linię komórkową HCT 116 stanowił miły prezent od Wydziału Nauk Biologicznych i Środowiskowych Uniwersytetu Katarskiego. CaCo2 i HCT11 pochodziły z pierwotnego miejsca raka okrężnicy, natomiast SW620 i LoVo pochodziły z miejsca przerzutowego. Komórki SW620, HCT116 i LoVo hodowano i utrzymywano w pożywce DME, podczas gdy komórki CaCo2 utrzymywano w minimalnej pożywce Eagle's (EMEM, SIGMA, Niemcy). Komórki hodowano jednowarstwowo w temperaturze 37 stopni w odpowiedniej pożywce uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS, SIGMA, Niemcy) i 1% penicyliną/streptomycyną (SIGMA, Niemcy) w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla.

Test żywotności komórek

Do oceny aktywności cytotoksycznej zastosowano test {{0}}[4,5-dimetylotiazol-2-ilo]-2,5-difenylotetrazoliowy (MTT) CTE podobnie jak opisano wcześniej (Jaganjac i in., 2010). Gęstość zaszczepiania komórek CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo hodowanych na płytkach 96-dołkowych wynosiła 104 komórki na dołek. Komórki wysiano w odpowiedniej pożywce uzupełnionej 10% FBS na 24 godziny przed leczeniem. Po 24 godzinach pożywkę usunięto, a komórki traktowano CTE o stężeniu 0, 0,25, 0,5, 1 i 2 mg/ml przez 24, 48 i 72 godziny w temperaturze 37 stopni w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Po traktowaniu CTE pożywkę usunięto i do każdej studzienki dodano 40 µl roztworu MTT (0,5 mg/ml).

Po 3 h inkubacji usunięto roztwór MTT, produkt formazan rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO, SIGMA, Niemcy) i zmierzono absorbancję przy 590 nm czytnikiem mikropłytek (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Szwajcaria). .

Test apoptozy

Apoptozę w komórkach CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo wykryto przy użyciu zestawu I do wykrywania apoptozy aneksyny PE z 7-amino-aktynomycyną D (7-AAD) jako barwnikiem niezbędnym do życia (Becton Dickinson International, Belgia) zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, komórki wysiano na płytki z 24-studzienkami przy gęstości 5×104 komórek/studzienkę w odpowiedniej pożywce uzupełnionej 10% FBS przez 24 godziny przed dodaniem CTE (0, 0,5 lub 1 mg/ml). Po inkubacji przez 24 CTE komórki zebrano, przemyto dwukrotnie zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i wybarwiono fikoerytryną (PE) aneksyną V i 7-AAD przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Wybarwione komórki analizowano w ciągu 1 godziny metodą cytometrii przepływowej przy użyciu FACS. Cytometr przepływowy Aria III i oprogramowanie FACSDiva (Becton Dickinson) przy niskim przepływie i minimum 104 komórkach. Jako kontrolę pozytywną testu zastosowano traktowanie komórek przez 4 godziny 6 µM kamptotecyną (SIGMA).

Wewnątrzkomórkowa produkcja ROS

Wewnątrzkomórkową produkcję ROS badano przy użyciu dioctanu 2,7- dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA, SIGMA, Niemcy). DCFH-DA jest niefluorescencyjną sondą, która jest utleniana za pomocą wewnątrzkomórkowych ROS do związku fluorescencyjnego 2,7-dichlorofluoresceiny (DCF) (Poljak-Blazi i in., 2011). Test DCFH DA przeprowadzono podobnie jak opisaliśmy wcześniej (Cindric i in., 2013; Poljak-Blazi i in., 2011). W skrócie, gęstość zaszczepienia komórek CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo hodowanych na czarnych płytkach 96-wyniosła 104 komórki na dołek. Komórki wysiano w odpowiedniej pożywce uzupełnionej 10% FBS na 24 godziny. Przed leczeniem komórki inkubowano z 10 µM DCFH-DA w temperaturze 37 stopni przez 30 minut w 5% CO2 / 95% powietrza. Komórki następnie przemywano i traktowano CTE w stężeniu 0, 0,5 i 1 mg/ml w pożywce bez czerwieni fenolowej. Wewnątrzkomórkowe tworzenie ROS monitorowano w sposób ciągły przez 25 godzin w temperaturze 37 stopni i 5% CO2 przy użyciu czytnika mikropłytek z górnym modułem kontroli fluorescencji i gazu (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Szwajcaria). Intensywność fluorescencji mierzono przy długości fali wzbudzenia 500 nm i detekcji emisji przy 529 nm. Jednostki arbitralne, względne jednostki fluorescencji (RFU), opierały się bezpośrednio na intensywności fluorescencji.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI NEREK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Generacja mitochondrialnego nadtlenku

Zdolność CTE do indukowania wytwarzania ponadtlenku przez mitochondria oszacowano przy użyciu przepuszczalnej dla komórek, ukierunkowanej na mitochondria sondy MitoSOX Red (Life Technologies) i Hoechst 33342 do barwienia jądrowego (Life Technologies). Komórki CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo wysiano na płytki z 96-studzienkami przy gęstości 104 komórek na studzienkę w odpowiedniej pożywce uzupełnionej 10% FBS przez 24 godziny . Komórki następnie załadowano 4 µM MitoSOX i 2 µM Hoechst 33342 przez 20 minut, przemyto nadmiar barwnika i dołki potraktowano 0, 0,5 i 1 mg/ml CTE przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni i 5% CO2. Intensywność fluorescencji mierzono przy długości fali wzbudzenia 510 nm i detekcji emisji przy 580 nm dla MitoSOX oraz przy długości fali wzbudzenia 350 nm i detekcji emisji przy 461 nm dla Hoechst 33342 przy użyciu czytnika mikropłytek z górną fluorescencją (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Szwajcaria)

Analiza statystyczna

Statystyki opisowe przedstawiono jako średnią +/− SD. Istotność różnic między grupami oceniano za pomocą testu t-Studenta i testu Chi-kwadrat. Kiedy porównano więcej niż dwie grupy, zastosowaliśmy jednostronną analizę ANOVA z odpowiednimi testami post hoc. Zastosowano SPSS 11.01 dla Mircosoft Windows. Za istotne statystycznie uznano różnice, w których P było mniejsze niż 0,05.

WYNIKI

Wpływ CTE na proliferację linii komórkowych ludzkiego raka okrężnicy przedstawiono na rycinie 1. Wszystkie badane stężenia CTE wykazały silny wpływ hamujący na linię komórkową CaCo2 w sposób zależny od stężenia i czasu (ryc. 1A). Siedemdziesiąt dwie godziny leczenia CTE zahamowało wzrost komórek CaCo2 o ponad 60% w porównaniu z kontrolą (p < 0.05 dla wszystkich stężeń). Znaczący wpływ leczenia CTE na wzrost komórek HCT116 wykryto także w punktach wszechczasów przy dwóch najwyższych stężeniach (1 mg/ml i 2 mg/ml), osiągając ponad 70% redukcji przy drugim stężeniu (Rysunek 1B, p < 0,05). Chociaż dwa niższe stężenia CTE (0,25 i 0,5 mg/ml) znacząco zmniejszyły wzrost komórek HCT116 po 24 godzinach (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). Zależne od czasu i stężenia hamowanie proliferacji za pomocą CTE zostało dodatkowo potwierdzone w komórkach LoVo o ponad 60% przy najwyższym stężeniu (p < 0.05) (Rysunek 1C), a wszystkie cztery badane stężenia CTE zmniejszały wzrost komórek SW620 po 48 godzinach (ryc. 1D, p < 0,05 dla wszystkich). Po 72 godzinach leczenia ten sam efekt zaobserwowano tylko dla dwóch najwyższych stężeń (p < 0,05), podczas gdy stężenia 0,25 i 0,5 mg/ml nie wykazały istotnego efektu w porównaniu z kontrolą (p > 0,05). Wpływ leczenia CTE w stężeniu 0,5 i 1 mg/ml na indukcję apoptozy badano dalej we wszystkich czterech liniach komórkowych (Figura 2). Zwiększoną liczbę komórek we wczesnej apoptozie wykryto w HCT116 i LoVo po 24-godzinnym leczeniu 0,5 mg/ml (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Ryc. 1:EfektCistanche tubulosana żywotność linii komórkowych raka jelita grubego. Żywotność komórek mierzona w teście MTT komórek (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 jest przedstawiona jako odsetek kontrolnej nieleczonej linii komórkowej raka okrężnicy. Podano wartości średnie (±SD) dla 5 powtórzeń reprezentatywnego doświadczenia: (*) istotność p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Ryc. 2: Ekstrakt wodny Cistanche tubulosa indukuje apoptozę w ludzkich komórkach raka okrężnicy. Analizy cytometrii przepływowej aneksyny-V-FITC komórek (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 przedstawiono jako procent kontrolnej nieleczonej linii komórkowej raka okrężnicy. Podano wartości średnie (±SD) dla 3 powtórzeń reprezentatywnego doświadczenia: (*) istotność p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Ryc. 3: Ekstrakt wodny z Cistanche tubulosa indukuje wewnątrzkomórkową produkcję ROS w sposób zależny od czasu i dawki. Wytwarzanie ROS mierzone za pomocą testu DCFH-DA w komórkach (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 przedstawiono jako średnie wartości RFU (±SD) dla odpowiednich 5-replikatów reprezentatywny eksperyment. (*) Znaczenie str. 1<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Ryc. 4: Ekstrakt wodny z Cistanche tubulosa indukuje mitochondrialną produkcję ponadtlenku w ludzkich komórkach raka okrężnicy. Intensywność fluorescencji ukierunkowanej na mitochondria sondy MitoSOX Red w komórkach A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 przedstawiono jako procent kontrolnej nieleczonej linii komórkowej raka okrężnicy. Podano wartości średnie (±SD) dla 5 powtórzeń reprezentatywnego doświadczenia: (*) istotność p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DYSKUSJA

Chociaż wcześniejsze badania donosiły o licznych właściwościach leczniczych Cistanche tubulosa, jest to pierwsze doniesienie o jego działaniu antyproliferacyjnym w komórkach złośliwych. Bioaktywne związki Cistanche tubulosa wyekstrahowane wodą, wysoce polarnym rozpuszczalnikiem, wykazały silną bioaktywność przeciwnowotworową. Wcześniej porównaliśmy skuteczność Cistanche tubulosa rozpuszczonego w wodzie z innymi rozpuszczalnikami, takimi jak metanol i octan etylu, ale ekstrakty wodne wykazywały najbardziej obiecujące działanie przeciwnowotworowe (dane nie pokazane).

Wykazaliśmy zdolność CTE w stężeniu 1 mg/ml i 2 mg/ml do hamowania 60% wzrostu linii komórkowych zarówno pierwotnego, jak i przerzutowego raka okrężnicy, ujawniając potencjalnie ważną rolęCistanche tubulosajako leczenie raka jelita grubego. W porównaniu do normalnych komórek, komórki nowotworowe ogólnie charakteryzują się zaburzeniami homeostazy redoks, a powszechną strategią obecnych terapii przeciwnowotworowych jest zwiększenie komórkowego stresu oksydacyjnego (Yang i in., 2013). Chociaż fizjologicznie niski poziom ROS odgrywa ważną rolę jako cząsteczki sygnalizacyjne, nadmierna produkcja ROS może przyczyniać się do niestabilności i złośliwości nowotworu (Liou i Storz, 2010). Paradoksalnie ten brak równowagi w komórkowej homeostazie redoks sprawia, że ​​komórki nowotworowe są bardziej podatne na śmierć komórkową indukowaną przez ROS (Jaganjac i in., 2008; Nogueira i Hay, 2013). Na działanie antyproliferacyjne CTE opisane w tym badaniu mogą wpływać różne zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe mechanizmy znanych i nieznanych związków w ekstrakcie, ukierunkowane na wiele szlaków odgrywających zasadniczą rolę w apoptozie. Aby rozróżnić różne tryby śmierci komórek, zbadaliśmy potencjalny mechanizm odpowiedzialny za obserwowaną cytotoksyczność indukowaną CTE.

EKSTRAKT Z CISTANCHE TUBULOSA Przeciw Alzhermerowi PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Nasze dane wskazują, że CTE zwiększa wewnątrzkomórkową produkcję ROS, a w konsekwencji śmierć komórek indukowaną przez ROS. Stan redoks komórki odgrywa również kluczową rolę w regulacji apoptozy, a mitochondrialny łańcuch transportu elektronów jest jednym z głównych miejsc wytwarzania komórkowych ROS (Trachootham i in., 2008). Co więcej, wewnątrzkomórkowe ROS mogą powodować apoptozę komórkową zarówno poprzez szlaki zależne od mitochondriów, jak i niezależne (Sinha i in., 2013). Rzeczywiście, nasze dane wskazują również, że eksternalizacja fosfatydyloseryny indukowana przez CTE jest częstym efektem apoptozy, zarówno w liniach komórkowych raka pierwotnego, jak i przerzutowego, co sugeruje, że w mechanizmie śmierci wywołanej CTE pośredniczy raczej apoptoza niż martwica. Aktywacja apoptozy w komórkach nowotworowych jest strategią naprawczą i wiele leków przeciwnowotworowych może wywierać działanie apoptotyczne w komórkach nowotworowych.

Związki lub ekstrakty o działaniu proapoptotycznym w komórkach nowotworowych są zatem potencjalnie przydatne w badaniach nad lekami przeciwnowotworowymi (Wong, 2011). Aby ustalić, czy indukowany przez CTE efekt proapoptotyczny jest pośredniczony przez mechanizm ROS indukowany przez mitochondria, zmierzyliśmy wytwarzanie ponadtlenku za pomocą sondy fluorescencyjnej ukierunkowanej na mitochondria w komórkach traktowanych CTE. Nasze dane wyraźnie pokazują, że CTE stymuluje mitochondrialną produkcję ponadtlenku, co sugeruje, że działanie przeciwnowotworowe Cistanche tubulosa przynajmniej częściowo zależy od mechanizmu ROS indukowanego przez mitochondria.

WNIOSKI

Podsumowując, nasze dane sugerują, że wodny ekstrakt z rośliny pustynnej Cistanche tubulosa może stanowić obiecującego kandydata na podejście przeciwnowotworowe w połączeniu z innymi konwencjonalnymi terapiami w profilaktyce i leczeniu raka okrężnicy. Wykazujemy również, że toksyczność ekstraktu roślinnego wobec komórek nowotworowych wynika ze zwiększonej wewnątrzkomórkowej produkcji ROS i, przynajmniej częściowo, z apoptozy zależnej od mitochondriów. Trwają dalsze badania mające na celu wyizolowanie i scharakteryzowanie poszczególnych biologicznie aktywnych składników odpowiedzialnych za działanie przeciwnowotworowe.

Konieczne są dalsze badania, aby ocenić potencjalne zastosowanie tego ekstraktu jako skutecznego środka chemoprewencyjnego i zrozumieć mechanizmy działania na komórki raka okrężnicy na poziomie molekularnym. Konieczne są również dalsze badania przedkliniczne i kliniczne, aby potwierdzić zaobserwowane korzystne skutki zdrowotneCistanche tubulosa w profilaktyce raka.

 CISTANCHE TUBULOSA KAWA CISTANCHE POPRAWIA PAMIĘĆ PRZECIW ZMĘCZENIU PHGS75% ECH 30% ACT 12%