Najnowsze postępy w odkrywaniu antygenów kleszczy i opracowywaniu szczepionek przeciw kleszczom Część 1

Abstrakcyjny:

Kleszcze mogą poważnie wpływać na zdrowie ludzi i zwierząt na całym świecie, powodując każdego roku znaczne straty ekonomiczne. Chemiczne środki roztoczobójcze są szeroko stosowane do zwalczania kleszczy, które negatywnie wpływają na środowisko i skutkują pojawieniem się populacji kleszczy odpornych na roztoczobójcze. Szczepionka jest uważana za jedno z najlepszych alternatywnych podejść do zwalczania kleszczy i chorób przenoszonych przez kleszcze, ponieważ jest tańsza i bardziej skuteczna niż kontrola chemiczna. Wiele szczepionek opartych na antygenach zostało opracowanych w wyniku obecnych postępów w technikach transkryptomiki, genomiki i proteomiki.

Kilka z nich (np. Gavac® i TickGARD®) jest dostępnych na rynku i jest powszechnie stosowanych w różnych krajach. Ponadto badana jest znaczna liczba nowych antygenów z myślą o opracowaniu nowych szczepionek przeciwkleszczowych.

Jednak potrzebne są dalsze badania w celu opracowania nowych i bardziej skutecznych szczepionek opartych na antygenach, w tym ocena skuteczności różnych epitopów przeciwko różnym gatunkom kleszczy w celu potwierdzenia ich reaktywności krzyżowej i wysokiej immunogenności. W tym przeglądzie omawiamy ostatnie postępy w opracowywaniu szczepionek opartych na antygenach (tradycyjnych i opartych na RNA) oraz przedstawiamy krótki przegląd ostatnich odkryć nowych antygenów, wraz z ich źródłami, charakterystyką i metodami stosowanymi do testowania ich efektywność.

Antygeny to substancje, które mogą wywoływać odpowiedź immunologiczną, w tym bakterie, wirusy, komórki itp. Odporność to zdolność organizmu do reagowania na zewnętrzne antygeny, w tym odporność wrodzona i nabyta. Związek między antygenami a odpornością jest ścisły, a odporność może rozpoznawać i atakować antygeny, chroniąc w ten sposób organizm przed chorobami. Na przykład, kiedy organizm ludzki jest wystawiony na działanie określonego patogenu, układ odpornościowy rozpoznaje antygen i wytwarza przeciwciała, które atakują go, aby uniknąć choroby. Dlatego wzajemne oddziaływanie między antygenami a odpornością jest ważnym mechanizmem utrzymania dobrego stanu zdrowia. Więc z tego punktu widzenia musimy zwracać uwagę na poprawę naszej odporności w naszym codziennym życiu. Cistanche ma znaczący wpływ na poprawę odporności. Cistanche jest bogaty w różne substancje przeciwutleniające, takie jak witamina C, witamina C, karotenoidy itp. Składniki te mogą wychwytywać wolne rodniki, zmniejszać stres oksydacyjny i poprawiać odporność układu odpornościowego.

Kliknij dodatek cistanche deserticola

Słowa kluczowe:

szczepionki; kandydaci na antygen; szczepionka przeciw kleszczom; kontrola kleszczy.

1. Wstęp

Kleszcze to ektopasożyty, które atakują ludzi i zwierzęta i są odpowiedzialne za znaczne straty ekonomiczne. Są drugimi najważniejszymi wektorami przenoszenia chorób u ludzi po komarach [1,2]. Są również jednym z najważniejszych wektorów przenoszenia chorób, które mają wpływ na światowy przemysł bydła i zwierzęta domowe [3-5]. Kleszcze mają niewielu naturalnych wrogów, co utrudnia kontrolowanie infekcji kleszczowych. Chemiczne środki roztoczobójcze były tylko częściowo skuteczne, z kilkoma wadami niedocelowymi, w tym selekcją kleszczy odpornych na roztoczobójcze oraz skażeniem środowiska i produktów zwierzęcych pozostałościami chemicznymi [6].

Ponadto, w celu zwalczania chorób przenoszonych przez kleszcze, w różnych krajach stosuje się niektóre szczepionki oparte na antygenach; potrzebne są jednak nowe i skuteczniejsze podejścia, w tym opracowanie nowych szczepionek ukierunkowanych na inwazje kleszczy i infekcje patogenami [7,8].

Tradycyjnie zasada „izoluj – dezaktywuj – wstrzyknij” odgrywała kluczową rolę w projektowaniu i opracowywaniu szczepionki do zwalczania pasożytów/patogenów. Szczepionki pierwszej generacji składały się z żywych, atenuowanych lub zabitych patogenów. Szczepionki drugiej generacji składały się z oczyszczonych składników pasożytów/patogenów i zostały opracowane w wyniku postępu w hodowli komórkowej, chemii polisacharydów, technologii rekombinacji DNA i immunologii [9,10]. Postęp w genomice i innych „omikach” w ciągu ostatnich dwóch dekad zaowocował opracowaniem „trzeciej generacji” szczepionek, opartych na technologiach, takich jak omika funkcjonalna, odwrócona wakcynologia i podejście oparte na biologii systemów.

Aby przezwyciężyć ograniczenia konwencjonalnych podejść do opracowywania szczepionek, opracowywanie szczepionek stało się bardziej dostosowane, z naciskiem na ugrupowania antygenowe, które są celem ochronnych odpowiedzi immunologicznych [11,12], z szeroką perspektywą patogenu i jego interakcji z układ odpornościowy gospodarza [13]. Dlatego współczesna wakcynologia w coraz większym stopniu opiera się na nowatorskich podejściach omicznych wykorzystujących najnowocześniejsze technologie o wysokiej przepustowości, takie jak genomika, transkryptomika i proteomika, wraz z postępem w podstawowej immunologii, biologii gospodarz-patogen, immunomice, zaawansowanej bioinformatyce, modelowaniu obliczeniowym i ulepszonym zrozumienia i innowacji technologicznych.

W porównaniu ze stosowaniem chemikaliów, szczepienie jest rozsądną opcją, ponieważ jest bezpieczne dla środowiska i opłacalne w zwalczaniu inwazji kleszczy [12,14]. Chociaż szczepienie jest racjonalną strategią zwalczania inwazji kleszczy, do tej pory skomercjalizowano tylko kilka szczepionek, przy minimalnym zainteresowaniu wywołaniem odporności krzyżowej przeciwko gatunkom kleszczy [15].

Aby opracować nowe szczepionki, kluczowe znaczenie ma identyfikacja i scharakteryzowanie nowych kandydatów na antygeny, które byłyby bardziej konserwatywne i miałyby zdolność indukowania odporności krzyżowej u gatunku gospodarza. Celem tego przeglądu jest przedstawienie przeglądu tradycyjnych i opartych na RNA szczepionek oraz możliwości ich zastosowania, a także nowych antygenów, które mają potencjał do wykorzystania jako obiecujący kandydaci na antygeny do opracowywania szczepionek.

2. Identyfikacja antygenów: mapa drogowa opracowania szczepionki przeciw kleszczom

Identyfikacja antygenów ma kluczowe znaczenie dla opracowania szczepionki przeciw kleszczom. Kluczowe znaczenie ma zrozumienie mechanizmów molekularnych związanych z interakcjami żywiciel-pasożyt-patogen, aby zidentyfikować kandydatów na antygeny, które mogą służyć jako kandydaci/cele do opracowania szczepionki. Idealny kandydat na antygen indukuje długotrwałą i skuteczną odpowiedź immunologiczną gospodarza [16,17]. Odkąd Allen i Humphreys opublikowali swoje odkrycia w 1979 r., przeprowadzono wiele badań, wykorzystując szereg antygenów, w tym całe homogenaty kleszczy i narządy wewnętrzne, w celu wywołania różnych poziomów odporności przeciwko kleszczom [16].

Pojawiło się kilka nowych możliwości przewidywania, badań przesiewowych i identyfikacji antygenów chroniących przed inwazją kleszczy od czasów Ixodes scapularis, pierwszego gatunku kleszczy poddanego sekwencjonowaniu [18]. Obecnie dostępnych jest wiele baz danych nukleotydów i białek z różnych tkanek kleszczy i stadiów rozwojowych, a także znanych jest wiele różnych bodźców, które wpływają na kleszcze, takich jak karmienie kleszczy lub infekcja patogenami [17,19].

Prawdopodobieństwo selekcji kandydatów na antygeny ochronne pochodzące od kleszczy do zwalczania inwazji kleszczy i zakażenia patogenami również wzrosło w wyniku ostatnich postępów w technologiach omicznych (tj. transkryptomika, proteomika i metabolomika) [20]. Ponadto zastosowanie odwrotnej wakcynologii (RV) lub wakcynomiki umożliwiło odkrycie nowych kandydatów na antygeny szczepionkowe [20].

W rezultacie oceniono syntetyczne i rekombinowane białka i wykazano, że są w stanie wywołać pewien poziom odporności ochronnej. Celem tej części jest omówienie kandydatów na antygeny pochodzących z różnych tkanek, które zostały zidentyfikowane, ocenione pod kątem ich skuteczności i są rozważane jako potencjalni kandydaci do opracowania szczepionki przeciw kleszczom, w oparciu o dostępną literaturę (Tabela 1 i Rysunek 1).

Rycina 1. Przegląd rozmieszczenia i schematu oceny skuteczności docelowych antygenów szczepionki przeciw kleszczom w zapobieganiu inwazji kleszczy i chorobom przenoszonym przez kleszcze.

2.1. Kandydaci na antygen związany z jajkiem

Żółtko jaja jest niezbędnym składnikiem rozwoju kleszczy, ponieważ służy jako rezerwuar różnych białek, które odgrywają kluczową rolę podczas rozwoju embrionalnego tych stawonogów [21,22]. Podobnie jak u owadów, białka żółtka syntetyzowane są w ciele tłuszczowym kleszczy [21,23]. Rozkład żółtka jest przeprowadzany przez różne rodzaje enzymów, które znajdują się w jajach. Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) jest przykładem proteinazy żółtka, która została wyizolowana z jaj R. microplus i według doniesień bierze udział w procesie embriogenezy kleszcza.

W szczególności enzymy te odgrywają kluczową rolę w degradacji witeliny, głównego białkowego składnika żółtka jaja [21]. BYC został po raz pierwszy wyizolowany przez da Silva Vaz Jr et al. [24] z jaj R. microplus, a następnie zaszczepiono bydło w celu określenia jego roli w indukcji odporności gospodarza. Stwierdzono, że enzym ten zapewnia częściową ochronę przed kleszczami i wyzwala ochronną odpowiedź immunologiczną u bydła, ale jego skuteczność wynosiła od 14 do 36 procent. Kolejne badanie wykazało ekspresję rekombinowanego białka BYC w prokariotycznym systemie ekspresyjnym (E. coli).

Co ciekawe, rekombinowane białko wykazało ogólną wyższą skuteczność (25,24%) w porównaniu z enzymem bezpośrednio wyizolowanym z żółtka jaja [25,26]. Okazało się, że na skuteczność tego białka mogą wpływać różne czynniki, np. sposób przygotowania białka BYC może wpływać na strukturę białka, a ostatecznie na jego funkcje. Co więcej, ta zmienność może być również związana ze szczepem kleszcza lub innymi warunkami doświadczalnymi [24].

Witelina, lipoglikoproteina występująca również w żółtku jaja, podobnie jak inne białka żółtka, jest syntetyzowana w ciałach tłuszczowych stawonogów [27,28]. U kleszczy witellina lub witellogeniny mają kluczowe znaczenie dla rozwoju jaj i składania jaj, co wykazano poprzez wyciszenie trzech genów witellogeniny u H. longicornis [29]. Białko witeliny oczyszczono z jaj kleszczy jako niekowalencyjny kompleks sześciu polipeptydów o dużej masie cząsteczkowej (44-107 kDa). Równolegle z tym badaniem wyizolowano i oczyszczono glikoproteinę 80 kDa (GP80) z larw R. microplus.

Oba białka następnie zaszczepiono w celu zbadania ich skuteczności. Szczepionki Vitellin i GP80 wykazały ogólną skuteczność 68%, co sugeruje, że szczepionka zawierająca oba antygeny może indukować odpowiedź immunologiczną, a także zapewniać częściową ochronę przed R. microplus u żywicieli owiec [28].

Co ciekawe, gdy rekombinowany hexahis-GP80 (HH-GP80), który był nieprawidłowo sfałdowany i nie glikozylowany, został wstrzyknięty gospodarzowi w tych samych warunkach eksperymentalnych, nie wykazywał skuteczności [28]. Na podstawie wyników powyższego badania wydaje się, że szczepienie witeliną i GP80 może wywołać odpowiedź immunologiczną u owiec i może częściowo chronić owce przed kleszczem B. micro plus. Prawidłowe zwijanie HH-GP80 ma kluczowe znaczenie dla jego aktywności, ponieważ ochronne epitopy są związane z fałdowaniem białka i/lub przyłączonych do niego oligosacharydów, a te epitopy są niezbędne dla jego aktywności.

Endopeptydaza cysteinowa rozkładająca witelinę (VTDCE) to kolejny enzym związany z jajkiem, który został zidentyfikowany i wyizolowany przez Seixasa i in. [30]. Podobnie jak BYC, to białko enzymatyczne nie jest syntetyzowane w jajniku R. microplus i bierze udział w hydrolizie witeliny, dostarczając w ten sposób składników odżywczych rozwijającym się zarodkom.

Stwierdzono jednak, że oba enzymy regulują hydrolizę witeliny w różny sposób [30]. Ta sama grupa badawcza później przeanalizowała oczyszczone białko VTDCE jako antygen i stwierdziła, że ​​białko to zapewnia również częściową ochronę przed kleszczami, ponieważ immunizacja zwierząt gospodarskich skutkowała 21-procentową skutecznością i 17,6-procentową redukcją masy zapłodnionych jaj [31]. Białka związane z jajem BYC i VTDCE zapewniają ograniczoną ochronę gospodarza przed inwazją kleszczy i dlatego wydają się nieodpowiednimi kandydatami na antygeny, gdy są stosowane samodzielnie w szczepionce.

2.2. Kandydaci na antygeny związane z gruczołami ślinowymi

Kleszcze zawierają białko podobne do enzymu konwertującego angiotensynę, które może kontrolować ciśnienie krwi poprzez regulację objętości płynu, podobnie jak enzym konwertujący angiotensynę u ssaków [32,33]. Ta kontrola pozwala kleszczowi na ciągłe odżywianie się krwią żywiciela. Gruczoły ślinowe i jelito środkowe kleszcza B. micro plus zawierają glikoproteinę występującą w małej ilości, nazwaną Bm91 [32]. Obecnie Bm91 nie jest zawarty w komercyjnych szczepionkach przeciw kleszczom, ale jest uważany za kandydata do zwalczania kleszczy [34]. Kiedy oceniano samo rekombinowane białko Bm91 w warunkach terenowych z naturalną inwazją kleszczy, wyniki były rozczarowujące, ponieważ białko to wykazywało tylko 6-procentową skuteczność, co wydaje się nieodpowiednie do opracowania szczepionki do zwalczania kleszczy [35].

Kiedy jednak rekombinowane białko Bm91, które zostało wyprodukowane w E. coli, połączono z Bm86 (kandydatem na antygen stosowany w komercyjnych szczepionkach), a następnie tę kombinację białek zastosowano jako szczepionkę, wyniki były znacznie bardziej obiecujące , ponieważ dodatek Bm91 zwiększył skuteczność antygenu Bm{3}} [33], co sugeruje, że połączenie tych dwóch białek (Bm91 i Bm{6}}) wydaje się być skuteczną strategią opracowania nowego antygenu -szczepionka na kleszcze.

Transkryptomiczne i różnicowe analizy ekspresji genów gruczołów ślinowych wykazały, że genom gatunków kleszczy (np. R. microplus i Dermacentor andersoni) zawiera sekwencję białkową zwaną białkiem jedwabiu wiciowatego [36,37]. Charakterystyka zróżnicowanej ekspresji genów w gruczołach ślinowych R. microplus w odpowiedzi na infekcję A. marginale uwidoczniła molekularne mechanizmy interakcji kleszcza z patogenem. Późniejsze badania funkcjonalne wykazały, że białko jedwabiu wiciowatego (SILK) może odgrywać kluczową rolę w infekcji i namnażaniu A. marginale u kleszczy. Interakcja między cząsteczkami pochodzącymi od kleszczy i patogenów bierze udział w namnażaniu A. marginale w komórkach gruczołów ślinowych [36,38].

Po tych badaniach zaproponowano, że białko jedwabiu wiciowatego może być odpowiednim kandydatem na antygen do opracowania szczepionki. W tym celu Merino i in. [14] wyprodukowali rekombinowane białko jedwabiu wiciowatego i przeanalizowali jego aktywność antygenową przez wstrzyknięcie go żywicielowi bydłu. Stwierdzono, że rekombinowane białko jest doskonałym kandydatem na antygen, ponieważ zapewnia 62% ochronę bydła przed inwazją kleszczy i infekcjami przenoszonymi przez kleszcze (np. babeszjozą). Szczepienie białkiem jedwabiu wiciowatego ograniczało namnażanie się A. marginale u bydła. Miana przeciwciał specyficznych dla antygenu korelowały ze zmniejszoną inwazją kleszczy i zakażeniem patogenem, co wskazuje, że działanie szczepionki jest wynikiem odpowiedzi przeciwciał.

Ponadto na ekspresję antygenów szczepionkowych kodujących geny u kleszczy żywiących się bydłem miały również wpływ szczepienie i koinfekcja A. marginale i B. bigemina. Wydaje się zatem, że szczepionki wykorzystujące białka kleszczy, które biorą udział w interakcjach wektor-patogen, mogą być skuteczne zarówno w zwalczaniu inwazji kleszczy, jak i jednocześnie zapobieganiu zakażeniu patogenem [14].

Salp15 jest immunosupresyjnym białkiem śliny I. scapularis o masie cząsteczkowej 15 kDa, które hamuje aktywację limfocytów T CD4 plus, aktywność dopełniacza, produkcję cytokin i funkcję komórek dendrytycznych u gospodarza [39–41]. W kolejnych badaniach zbadano mechanizm molekularny Salp15. Białko powierzchni zewnętrznej, OspC, jest wytwarzane przez B. burgdorferi na zewnętrznej powierzchni komórki. Produkcja krętków (krętki B. burgdorferi) w jelicie środkowym zakażonych kleszczy rozpoczyna się, gdy żywi się on krwią żywiciela, która jest następnie transportowana do żywiciela.

Podczas wyjścia z gruczołów ślinowych i przeniesienia krętków B. burgdorferi do żywiciela, Salp15 fizycznie oddziałuje z OspC na powierzchni krętków B. burgdorferi, co ułatwia przeżycie krętków, transmisję patogenu i infekcję żywiciela [38,42 ]. Interakcja Salp15-OspC może zatem potencjalnie zasłonić OspC przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza, tak że krętek jest chroniony przed odpowiedzią immunologiczną [38]. Ostatnio system ekspresyjny Escherichia coli został użyty do syntezy rekombinowanego białka Salp15 i stwierdzono, że system ten jest skuteczny w produkcji tego białka ze znaczną wydajnością i dobrą rozpuszczalnością. Te cechy rekombinowanego białka Salp15 wskazują, że ma to praktyczne zastosowanie i może być wykorzystane do wytwarzania szczepionek przeciw kleszczom [41,43,44].

Metaloproteazy (MPs) to wielofunkcyjne białka, które uczestniczą w wielu złożonych procesach fizjologicznych i patologicznych w organizmach żywych [45]. U różnych gatunków kleszczy zidentyfikowano kilka MP, które uważa się za kluczowe dla utrzymania funkcji związanych z mączką z krwi u kleszczy [46-49]. Na przykład gruczoły ślinowe kleszczy ixodid zawierają MP, które są uznawane za kluczowe składniki bioaktywne w życiowych funkcjach fizjologicznych i dlatego są uważane za potencjalne cele w strategiach zwalczania tych ektopasożytów [49]. Aby ocenić potencjał antygenowy MPs, Ali i in. (2015) [50] zamplifikowali fragment sekwencji kodującej R. micro plus MP, dokonali jego ekspresji jako rekombinowanego białka i wykorzystali oczyszczoną postać tego białka jako antygen szczepionkowy przeciwko R. microplus u bydła [50]. Rekombinowane białko R. micro plus MP wykazało ogólną skuteczność na poziomie 60 procent .

Ponadto zmniejszył liczbę żerujących kleszczy, liczbę wyprodukowanych jaj i liczbę wyklutych jaj, co czyni [41] idealnym kandydatem do opracowania szczepionki przeciw kleszczom [50]. W celu dalszego zbadania odpowiednich kandydatów na antygeny z R. microplus, Maruyama i in. [51] przeprowadzili badanie RNA-seq na gruczołach ślinowych na wszystkich etapach odżywiania R. microplus i wykryli fragment transkryptomu, który był podobny do MP (Rm239) wraz z trzema innymi genami, w tym Rm39, Rm76 i Rm180 . Zastosowanie tych białek jako szczepionek wykazało, że wszystkie z nich mogą hamować reakcje hemostatyczne, tłumić odpowiedzi przeciwciał żywiciela i zmniejszać zdolność kleszcza do wiązania się z żywicielem za pomocą bogatego w glicynę białka cementującego.

Dlatego autorzy opracowali wieloskładnikową szczepionkę przeciwkleszczową wykorzystującą te cztery różne rodzaje białek [51]. Uodpornienie bydła tą wieloskładnikową szczepionką spowodowało zmniejszenie porażenia R. microplus o 73,2 procent, co wskazuje, że preparat wieloantygenowej szczepionki przeciw kleszczom może być bardziej skuteczny niż szczepionki jednoskładnikowe [51].

Rybosomy, zwane także fabrykami białek, są składnikami wszystkich żywych organizmów. Wykazano, że rybosomalne białko P{{0}} odgrywa kluczową rolę w regulacji aktywności translacyjnej rybosomów i pomaga organizmowi dostosować swój metabolizm do różnych warunków środowiskowych. Należy do grupy kwaśnych białek, które tworzą strukturę łodygową w największej podjednostce rybosomu [52]. Istnieją dowody na to, że ślina kleszcza zawiera białka rybosomalne, które odgrywają rolę w unikaniu mechanizmów obronnych żywiciela [53-55]. Niedawno doniesiono, że króliki szczepione rekombinowanym rybosomalnym białkiem P0 wykazywały silne odpowiedzi humoralne, które przede wszystkim zmniejszały linienie nimf i reprodukcję samic. Białko wykazało 57,5% ochronę przed inwazją O. erraticus, ale nie zapewniało ochrony krzyżowej przed inwazją afrykańskiego kleszcza Ornithodoros moubata [56].

W innym badaniu naukowcy chemicznie zsyntetyzowali peptyd składający się z 20 aminokwasów, który pochodził z rybosomalnego białka P0 kleszczy Rhipicephalus i pomyślnie skoniugowali go z białkiem Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Megathura crenulate służyć jako antygen przeciwko R. microplus, wykazując 96% skuteczność u bydła [57]. W tym badaniu wyniki sugerowały, że P0 skoniugowana z KLH jest doskonałą szczepionką. Jednak produkcja takiej szczepionki będzie kosztowna i dlatego może nie być opłacalna dla zwierząt gospodarskich. Niezbędne jest zatem prowadzenie dalszych badań nad rekombinacyjnym wytwarzaniem szczepionki antygenowej w celu oceny jej skuteczności i uczynienia jej produkcji bardziej opłacalną ekonomicznie.

Inhibitory proteazy serynowej: Próby wyizolowania antygenów z gatunków kleszczy pozwoliły zidentyfikować pewne inhibitory proteinazy serynowej (serpiny), które wydają się mieć właściwości antygenowe. Serpiny biorą udział w różnych czynnościach fizjologicznych u zwierząt, w szczególności u bydła, gdzie wpływają na krzepnięcie krwi, zmieniając czas protrombinowy i częściowo aktywując czas tromboplastynowy [58–60]. Serpiny ingerują w układ odpornościowy kleszczy, ułatwiając tym samym początkowy proces żerowania tych pasożytów [61]. Andreotti i in. [62] wyizolowali i zidentyfikowali R. micro plus inhibitory trypsyny (BmTI) z ekstraktów z larw.

Aby ocenić jego aktywność antygenową, mieszańce bydła zaszczepiono BmTI, który, jak stwierdzono, zakłóca migrację leukocytów w miejscu utrwalenia larw [63,64]. Szczepienie cieląt antygenami BmTI znacznie zmniejszyło liczbę przekrwionych samic kleszczy i ich wagę, co dało 72,8% skuteczność przeciwko R. microplus. Dane te sugerują, że immunizacja BmTI może działać we wczesnej fazie rozwoju larw [65]. Aby zbadać, czy skrócony BmTI może również indukować immunizację, zsyntetyzowano N-końcowy fragment BmTI, który wykazał niższą skuteczność (18,4 procent) u bydła w porównaniu z białkiem pełnej długości.

Zatem immunizacja domeną N-końcową nie jest wystarczająca do poprawy wpływu BmTI na interakcje żywiciel-pasożyt [64]. Podobnie, gdy rekombinowane inhibitory trypsyny larw R. microplus (rRmLTI) zastosowano jako próbę szczepionki, skuteczność (32 procent) była ponownie niska, co sugeruje, że zarówno skrócone, jak i całe rekombinowane białko jest mniej skuteczne, prawdopodobnie z powodu braku precyzyjne fałdowanie białka in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują, że inhibitory trypsyny wydają się odpowiednimi kandydatami do wytworzenia skutecznej szczepionki; jednak sposób ich wytwarzania na dużą skalę wymaga udoskonalenia, aby zwiększyć ich skuteczność [66]. Różne inne serpiny zostały ocenione jako potencjalni kandydaci na szczepionki przeciw kleszczom z różnych gatunków kleszczy, w tym Amblyomma americanum (AAS19), Haemaphysalis longicornis (HLS2), Rhipicephalus (Boophilus) microplus i tak dalej. Wszystkie te serpiny wykazywały częściową ochronę żywiciela; jednak poziom ochrony może się różnić w zależności od gatunku kleszcza i rodzaju serpiny [67–69].

Łączenie białek jednego lub większej liczby kleszczy w jeden łańcuch polipeptydowy stanowi atrakcyjną strategię szczepienia przeciwko kleszczom. Zatem inhibitory/lub serpiny trypsyny w połączeniu z immunogennymi fragmentami innych białek kleszczy mogą być stosowane jako konstrukty wieloantygenowe. Na przykład zsyntetyzowano białko chimeryczne zawierające rekombinowany antygen Bm{2}}Campo Grande (BmCG), rRmLTI i termolabilną podjednostkę enterotoksyny B z Escherichia coli (LTB) jako adiuwant molekularny. Ten chimeryczny antygen RmLTI – BmCG – LTB miał 55,6 procentową skuteczność przeciwko R. microplus u bydła.

2.3. Kandydaci na antygen związany z jelitem środkowym

Białka ferrytyny są ważne dla fizjologicznego przechowywania żelaza w nietoksycznej, ale dostępnej biologicznie postaci. Są kluczowe dla metabolizmu żelaza z krwi spożywanej podczas karmienia kleszczy [70,71]. Do tej pory zidentyfikowano i scharakteryzowano dwie cząsteczki ferrytyny (Ferritin 1 i Ferritin 2). Ferrytyna 1 (FER1) znajduje się w komórkach, gdzie bierze udział w fizjologicznym magazynowaniu żelaza.

W przypadku ferrytyny 2 (FER2) u kręgowców nie ma funkcjonalnych ortologów. Występuje głównie w jelicie i odgrywa kluczową rolę biologiczną w transporcie żelaza do gruczołów ślinowych i jajników [71]. Białko FER2 opisano u różnych gatunków kleszczy, w tym D. variabilis, R. microplus, I. ricinus, Haemaphysalis longicornis i I. scapularis [71,72]. W oparciu o badania utraty funkcji FER2, jest to obiecujący kandydat na szczepionkę, ponieważ supresja tego genu upośledza zdolność żerowania kleszczy, obniża składanie jaj i zmniejsza wylęganie się larw [71].

Oprócz FER2 wykazano, że FER1 jest odpowiednim kandydatem na antygen do zwalczania różnych gatunków kleszczy. Hajdusek i in. przetestowali rekombinowane białko FER2 z R. microplus (RmFER2) w celu uodpornienia bydła i stwierdzili, że szczepionka oparta na FER{4}} wykazała ogólną skuteczność na poziomie 64 procent [73]. Podobnie rekombinowane białka FER1 i FER2 z H. longicornis zastosowano do immunizacji królików. Oba białka są wysoce immunogenne i indukują produkcję przeciwciał gospodarza. Immunizacja żywiciela znacznie zmniejszyła nabrzmiałą masę zarażonych kleszczy i zmniejszyła liczbę jaj oraz liczbę kleszczy z całkowicie wyklutymi jajami. Jednak rekombinowany FER2 powodował większą redukcję przy wyższej skuteczności (49 procent) niż rekombinowany FER1 (34 procent) [72].

Niedawno Manjunathachar i wsp. [74] donieśli, że cielę zaszczepione H. anatolicum FER2, wektorem krymsko-kongijskiej gorączki krwotocznej, było silnie chronione przed inwazją larw (51,7 procent) i dorosłych (51,2 procent) kleszczy, ponieważ jak również przeciwko kleszczom z FER2 znokautowanym przez RNAi. Wiele innych niedawnych badań również potwierdziło, że FER2 zapewnia gospodarzowi znaczącą ochronę przed inwazją kleszczy dzięki zastosowaniu rekombinowanego białka FER2 [75-77]. Molekularny mechanizm ochrony obejmuje głównie wytwarzanie przeciwciał anty-FER2 w organizmie żywiciela, które są przenoszone do gatunków kleszczy podczas procesu żerowania, a przeciwciała anty-FER2 wiążą się z FER2 wewnątrz komórek jelita kleszcza lub hemolimfy, zapobiegając w ten sposób FER2 montaż i/lub funkcję.

Niedawno odkryto, że przewidywane regiony antygenowe białka FER2 są konserwowane u różnych gatunków kleszczy. Białko to można więc wykorzystać do wytworzenia szczepionki do ochrony międzygatunkowej [77]. W niedawnym badaniu scharakteryzowano ortologi FER2 u O. moubata (OMFER2) i O. erraticus (OEFer2), a naukowcy odkryli, że mają one wysokie podobieństwo sekwencji (85,3 proc.). Rekombinowana forma O. moubata Fer2 (tOMFER2) może wywoływać silne odpowiedzi humoralne u królików. Jednak u O. erraticus białko to nie wykazuje żadnego działania ochronnego, pomimo wysokiego podobieństwa sekwencji, co sugeruje, że niewielka różnica w ich sekwencjach może decydować o ich działaniu ochronnym. Mimo to wyniki tego badania potwierdzają, że OMFER2 może potencjalnie służyć jako kandydat na antygen do szczepionek [78].

TROSPA to receptor kleszczy, który jest niezbędny do kolonizacji krętków przez I. scapularis. Białko A (OspA) zewnętrznej powierzchni B. burgdorferi jest obficie wytwarzane na tych krętkach i ma kluczowe znaczenie dla adhezji do wektora poprzez specyficzne wiązanie z TROSPA [79,80]. U różnych gatunków kleszczy, w tym R. microplus, I. scapulars i R. annulatus, TROSPA może odgrywać rolę w mechanizmach infekcji i namnażaniu patogenów Babesia. Ponadto białka powierzchni zewnętrznej OspA i OspB ulegają ekspresji, gdy krętki wchodzą i przebywają w kleszczach [81]. Jednak ich ekspresja jest tłumiona podczas transmisji do gospodarza, podczas gdy ekspresja OspC i bba52 jest regulowana w górę. BBA52 wraz z białkiem OspC borrelium pełni uzupełniające, ale nieistotne role w procesie transmisji, ponieważ wszystkie te antygeny są zlokalizowane w błonie zewnętrznej i ulegają koekspresji u żerujących kleszczy [82-84].

Biologiczna funkcja receptora jest nieznana, ale związanie OspA z TROSPA jest niezbędne dla kleszczy, aby bakteria B. burgdorferi skolonizowała jelito kleszcza, co sprzyja zakażeniu bakteryjnemu wektora [79]. Zakażenie B. burgdorferi indukuje produkcję określonych genów kleszczy (TROSPA i salp15), które mogą być ukierunkowane na hamowanie przenoszenia krętków Borrelia i innych drobnoustrojów przenoszonych przez kleszcze [80,85]. Blokowanie TROSPA antysurowicami TROSPA lub RNAi zmniejsza przyleganie B. burgdorferi do jelita I. scapulars, a tym samym zmniejsza kolonizację wektora przez bakterie i potencjalną transmisję patogenu do gospodarza [79]. W wyniku tej interakcji rekombinowana TROSPA była analizowana u bydła jako szczepionka antygenowa do zwalczania inwazji kleszczy i przenoszenia patogenów, ale nie wpływała ona na żerowanie kleszczy ani na płodność [14].

Akwaporyny (AQP) lub transbłonowe kanały wodne odgrywają główną rolę w homeostazie wody i krioprotekcji [86,87]. Są ewolucyjnie wysoce konserwatywnymi członkami większej rodziny głównych białek wewnętrznych. Tworzą pory w błonie komórkowej, które transportują wodę lub inne substancje rozpuszczone [86,88,89]. Oprócz transportu wody i małych obojętnych substancji rozpuszczonych, AQP biorą udział w wielu procesach fizjologicznych [90].

U kleszczy opisano AQP w przewodzie pokarmowym, kanalikach Malpighiego, a także w gruczołach ślinowych [91]. AQP zmniejszają objętość krwi żywiciela w jelitach kleszcza, co jest ważną funkcją fizjologiczną, ponieważ kleszcze połykają duże ilości krwi w stosunku do ich wielkości i wagi [62]. Fragment akwaporyny z nabrzmiałych samic R. micro plus został wyizolowany, a następnie wyprodukowany rekombinacyjnie i oznaczony jako szczepionka RmAQP1 [62]. Szczepionka ta została przetestowana w dwóch badaniach zagrodowych dla bydła pod kątem skuteczności przeciwko R. microplus, wykazując skuteczność 68 procent i 75 procent. Sugeruje to, że RmAQP1 może być potencjalnym antygenem szczepionkowym [62] i że akwaporyny mogą być stosowane w szczepionkach przeciwkleszczowych [62]. W niedawnym badaniu nad RmAQP2 tego samego gatunku wykazano, że bydło zaszczepione syntetycznym peptydem zewnątrzkomórkowych domen RmAQP2 było w stanie zredukować liczbę kleszczy żerujących do wyczerpania o 25% ogółem, co sugeruje, że ten cel (RmAQP2) może być użytecznym składnikiem koktajlu szczepionkowego przeciw ukąszeniom kleszczy [92].

Inne badanie na I. ricinus potwierdziło skuteczność antygenów AQP kleszczy w zwalczaniu inwazji kleszczy, wykazując wpływ szczepienia IrAQP i CoAQP na larwy kleszczy I. ricinus u królików. Skuteczność szczepionki zawierającej konserwatywny region AQP obecny w antygenie CoAQP była wyższa niż szczepionki IrAQP [93]. Ponadto szczepienie syntetycznymi immunogennymi peptydami pochodzącymi z AQP Ornithodoros erraticus (OeAQP i OeAQP1) zapewniało znaczną ochronę bydła przed homologicznym gatunkiem O. erraticus, ale ochrona międzygatunkowa przed Ornithodoros moubata była niższa [94]. Poza tym w niektórych innych badaniach zidentyfikowano również AQP z różnych gatunków, w tym kleszczy O. moubata i Ixodid, a analizy bioinformatyczne sugerują, że te AQP mają duży potencjał do wykorzystania jako szczepionka. Dlatego potrzebne są dalsze dowody eksperymentalne, aby potwierdzić potencjał antygenowy tych AQP [95,96].

I. ricinus jest jednym z gatunków kleszczy odpowiedzialnych za rosnącą częstość występowania chorób przenoszonych przez kleszcze u zwierząt towarzyszących w Europie [4]. Wpływ szczepionek opartych na AQP na inwazję i linienie larw I. ricinus może skutkować zmniejszeniem inwazji kleszczy u zaszczepionych zwierząt i potwierdza, że ​​CoAQP może być potencjalnym antygenem ochronnym do zwalczania różnych gatunków kleszczy żerujących na tym samym żywicielu.

Badanie wykorzystujące immunizację biblioteki ekspresyjnej przeciwko mysiemu modelowi inwazji kleszczy wykazało, że białko 4D8, nazwane później subleasingiem (SUB), jest potencjalnym antygenem, który może być użyty jako szczepionka przeciwko I. scapularis [97]. Stwierdzono, że sekwencje genu i białka SUB są konserwowane u bezkręgowców i kręgowców. Ponadto gen ten został zidentyfikowany i scharakteryzowany u różnych gatunków kleszczy i stwierdzono jego ekspresję na różnych etapach rozwoju oraz w różnych tkankach dorosłych kleszczy [98]. Ze względu na szeroką dystrybucję SUB zaproponowano, aby był dobrym kandydatem na szczepionkę antygenową. Potencjał antygenowy SUB był wcześniej badany u bydła przy użyciu rekombinowanych białek i stwierdzono, że SUB może chronić (skuteczność 51 procent) przed kleszczami.

Co więcej, połączenie szczepienia SUB i zwalczania autocydów kleszczy po nokaucie genu SUB u kleszczy żywiących się bydłem w celu zwalczania R. microplus osiągnęło 75% skuteczności po leczeniu [99,100]. Co więcej, Shakya i współpracownicy wyprodukowali rekombinowany SUB R. microplus i wykorzystali to rekombinowane białko do immunizacji bydła. Te przeżuwacze poddano następnie prowokacji larwami R. microplus. Ponadto oceniono skuteczność tego białka przeciwko innemu geograficznie odmiennemu szczepowi kleszcza. Skuteczność rekombinowanego SUB wahała się od 32,7% do 44,1% i wskazywała na wysoką homologię sekwencji między szczepami kleszczy z Meksyku i Indii [101]. W innym badaniu rekombinowany SUB zsyntetyzowano jako białko chimeryczne z MSP1a, a następnie zastosowano u bydła w celu zwalczania R. microplus.

Co zaskakujące, to białko chimeryczne wykazało 81-procentową skuteczność [102]. W wyniku udanych i obiecujących wyników aplikacji SUB przetestowano połączenie tego antygenu z Bm{2}} i uznano, że daje lepsze wyniki, ale ogólna skuteczność nie uzasadniała zastosowania tej kombinacji jako szczepionki. Chociaż wykazano, że wysokie poziomy specyficznych przeciwciał są aktywowane dla każdego antygenu, gdy dwa antygeny są podawane jednocześnie, są one rozdzielane na różne preparaty i stosowane w różnych miejscach inokulacji u zwierzęcia [103,104].

Dawniej znane jako ligandyny, S-transferazy glutationowe (GST) tworzą rodzinę wielofunkcyjnych białek szeroko rozpowszechnionych w królestwie zwierząt. Te białka enzymatyczne odgrywają rolę w transporcie wewnątrzkomórkowym, trawieniu, produkcji prostaglandyn, detoksykacji zarówno substancji endogennych, jak i egzogennych oraz obronie przed stresem oksydacyjnym. Poziomy ekspresji GST są zwiększone w organizmach narażonych na działanie insektycydów i akarycydów [105]. Surowica królicza zawierająca przeciwciała poliklonalne przeciwko GST z R. microplus reagowała z rekombinowanym GST z H. longicornis i R. appendiculatus, co sugeruje, że kleszczowe GST mogą być składnikiem uniwersalnej szczepionki chroniącej przed więcej niż jednym gatunkiem kleszcza [106] .

Na podstawie tych wstępnych badań Parizi i współpracownicy (2011) wyizolowali GST z H. longicornis i wytworzyli rekombinowany GST, który wykorzystali do szczepienia bydła przeciwko R. microplus [107]. Chroniło to bydło przed R. micro plus ze skutecznością 57%. Rekombinowane białko GST zapewniło gospodarzowi częściową krzyżową odporność, co sugeruje, że zdolność GST do ochrony białek nie jest wystarczająca, a zatem zastosowanie tego białka w szczepionce z pojedynczym antygenem wydaje się nieskuteczne w zapobieganiu inwazji kleszczy. 107].

For more information:1950477648nn@gmail.com