Badania dotyczące działań przeciwdepresyjnych i mechanizmów glikozydów fenyloetanolu cistanche u myszy
Dec 17, 2024
Abstrakcyjny:
To badanie ma na celu zbadanie efektów terapeutycznych i mechanizmówGlikozydy fenyloetanolu Cistanche(CPHG) w sprawie zachowania podobnego do depresji wywołanego przez przewlekły nieprzewidywalny łagodny stres (CUMS) u myszy. Myszy losowo podzielono na grupę kontrolną, grupę modelową, grupę CPHGS o wysokiej dawce (700 mg/kg), grupa CPHG w środkowej dawce (350 mg/kg), grupa CPHGS o niskiej dawce (175 mg/kg) i grupa fluoksetyna (15 mg/kg). Po czterech tygodniach odpowiednich interwencji narkotykowych przeprowadzono badania neurobehawioralne; Do wykrywania poziomów neuroprzekaźników w surowicy zastosowano test immunosorbencyjny związany z enzymem w surowicy, a także zawartość czynników zapalnych i mediatorów w tkance hipokampa. Barwienie hematoksyliną-eozyną i NISSL zastosowano do obserwacji patologicznych zmian w tkance hipokampa. Do analizy gęstości astrocytów i mikrogleju w tkance hipokampa myszy zastosowano metody immunohistochemii i immunofluorescencji i mikrogleju w tkance hipokampa, a także poziomy ekspresji receptora 4/czynnika jądrowego κB/NOD-podobne białko 3 (TLR4/NF-κB/NLRP3). Wyniki pokazały, że CPHG mogą poprawić zachowanie podobne do depresji u myszy, zwiększyć preferencję dla słodkiej wody i skrócić czas bezruchu, znacznie zwiększając poziom serotoniny i dopaminy w surowicy myszy, jednocześnie hamując ekspresję mediatorów zapalnych i czynników w hipokampie. Analiza immunohistochemiczna wykazała, że CPHG mogą zwiększyć gęstość astrocytów w hipokampie, zmniejszyć aktywację mikrogleju i hamować ekspresję białek związanych z inflammasomem NLRP3. Eksperymenty immunofluorescencyjne wykazały, że mechanizm, w którym CPHG zmniejszają tworzenie się inflammasomu, jest zmniejszenie aktywacji szlaku sygnałowego TLR4/NF-κB w tkance hipokampa. Podsumowując, CPHGS wykazują znaczący wpływ przeciwdepresyjnyDepresja indukowana przez mody, podobnie jak zachowanie, potencjalnie poprzez regulację poziomów neuroprzekaźników i hamowanie odpowiedzi neuroinomalnych, dostarczając eksperymentalnych dowodów na jego zastosowanie w leczeniu depresji.
Słowa kluczowe: glikozydy fenyloetanolu cistanche; depresja; odpowiedź neuroinomalna; astrocyty; Ścieżka TLR4/NFκB/NLRP3
Depresja jest powszechnym i złożonym afektywnym zaburzeniem psychicznym charakteryzującym się objawami takimi jak niski nastrój, anhedonia, powolne myślenie i dysfunkcja fizjologiczna. W ciężkich przypadkach mogą nawet wystąpić tendencje samobójcze [1]. Zgodnie z „Raportem na temat żywienia i stanu przewlekłego choroby chińskich mieszkańców (2020)”, rozpowszechnienie depresji w moim kraju osiągnęło 2,1%i został wymieniony przez Światową Organizację Zdrowia jako jedna z chorób o najwyższym wskaźniku niepełnosprawności na świecie [2]. Ponieważ patogeneza depresji jest bardzo złożona, dotychczasowy mechanizm pozostaje niejasny, co stanowi ogromne wyzwanie dla jego leczenia. W ostatnich latach uczeni krajowi i zagraniczni stwierdzili, że depresja może być ściśle powiązana z odpornością na aktywację zapalną. W procesie aktywacji odpowiedzi zapalnej w ośrodkowym układzie nerwowym aktywacja komórek zapalnych hipokampa jest jej charakterystycznym objazdem. Ciągle aktywowane hipokampowe komórki zapalne indukują uwalnianie wielu cytokin zapalnych, tworząc „efekt kaskadowy” zapalnego cytokiny, uczestnicząc w patogenezie i patologicznym procesie chorób psychicznych, takich jak depresja [3]. Obecnie leczenie tej choroby opiera się głównie na medycynie zachodniej, takiej jak fluoksetyna, wenlafaksyna, duloksetyna itp. Jednak istnieją niedociągnięcia, takie jak niski wskaźnik wyleczenia klinicznego, widoczne objawy resztkowe, wysoki wskaźnik nawrotów i łatwy do powodowania dysfunkcji narządów, co ogranicza jej zastosowanie kliniczne [4]. Tradycyjna medycyna chińska ma zalety większych celów i mniej skutków ubocznych w leczeniu chorób emocjonalnych oraz ma szerokie perspektywy zastosowania w leczeniu depresji i jej powikłań [5].
Cistanche Deserticolajest suszonym mięsistym łodygą z liśćmi fosforu Cistanche Deserticola Ycma i/lub Cistanche Tubulosa (Schenk) Wight, z których oba są roślinami rodziny Orobanchaceae. To dobry produkt żywności i medycyny. Współczesne badania farmakologiczne potwierdziły, że Cistanche Deserticola ma efekt neuroprotekcyjny (może hamować chorobę Alzheimera, chorobę Parkinsona itp.). Kapsułki „Cistanche Glikozydy”, które składają się głównie z glikozydów fenyloetanolu w Cistanche Deserticola, są szeroko stosowane w leczeniu chorób neurologicznych [6]. Glikozydy fenyloetanolu (CPHG) są ważnymi składnikami aktywnymi w glikozydach Cistanche. Mają wiele funkcji biologicznych, takich jak przeciwnowotworowe, immunomodulacja i przeciwutleniacz, i wykazują dobre perspektywy zastosowania [7]. Poprzednie badania wykazały, że CPHG mogą chronić wpływ monoamin i złagodzić objawy depresyjne poprzez zwiększenie szlaku metabolicznego ceramidu w istocie czarnej i zawartości dopaminy (DA) w prążkowiu [8]; Może również dostosowywać zachowanie myszy podobne do depresji za pomocą zespołu okołomenopauzalnego poprzez poprawę poziomu neuroprzekaźników monoaminowych w mózgu [9]. Jednak nie było raportów na temat jego zastosowania w leczeniu modelu depresji indukowanego przez przewlekły nieprzewidywalny łagodny stres (CUMS), a jego mechanizm działania pozostaje do wyjaśnienia. W oparciu o wcześniejsze badania i w połączeniu z obecnym potencjałem CPHG w stresie przeciwutleniającym, regulując zapalanie neurologiczne i hamując apoptozę neuronalną, w tym badaniu wykorzystano indukowany myszy model depresji indukowanego przez CUMS w celu ulepszania fali CPHG i mechanizmu działania TLR4/NF-κB/NLRPPPR w zakresie remontu neuroinfalacji, dostarczania dodatkowego bazu TLR4/NF-κB/NLRP3 działanie przeciwdepresyjne CPHG, rozszerzanie zastosowania klinicznego oraz rozwijanie i wykorzystanie go jako zdrowej żywności.
1 Materiały i metody
1.1 Materiały i instrumenty
Ekstrakt CPHGS (glikozydy fenyloetanolu w ekstrakcie większym lub równym 85%, w tym echinakozyd większy lub równy 40%, Verbascozyd większy lub równy 16%; liczba partii: 20231221, Xinjiang Hotan Dichen Pharmaceutyczne biological Co., Ltd.); Kapsułki chlorowodorku fluoksetyny (fluoksetyna, FLX) (numer partii: 8533C, Patheon France Pharmaceutical Company, Francja); 5- hydroksytryptamine (5- ht), zestaw detekcji da (numer partii: 20240305, 20240305, Shanghai Future Industrial Co., Ltd.); indukowalna syntaza tlenku azotu (iNOS), cyklooksygenaza -2 (cyklooksygenaza -2, Cox -2), prostaglandyna E2 (Prostaglandyna E2, PGE2), czynnik nowotworowy Alpha (współczynnik nurki nowotworowej, Tnf-), interlukin 1. (Interleukin -1, il -1), il -18 (interleukin -18, il -18), il -6 (interleukin 6, il {{24}), interferon-, ifn-) Zestawy testu immunosorbent enzymatycznych (nr partii: ER050A332132, ER035PD09812, ER048H753146, ER10X6398452, ER051H648219, ER09X2865471, ER049H746823, ER07X1729784, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); zjonizowana cząsteczka adaptera wiązania wapnia 1 (zjonizowana cząsteczka adaptera wiązania wapnia 1, IBA -1) przeciwciało monoklonalne, białko monoklonalne batowe (GFAP), białko monoklonalne (53}, kodowce NOD-podobne białko receptora Nodownika. Gr 3379124-30, Gr 3285067-28, abcam, uk); TOLL-podobny receptor 4 (TLR4) przeciwciało monoklonalne, fosforylowane czynnik jądrowy κB p65 (czynnik fosfo-nuklearny κB p65, p-nf-κB p65) przeciwciało monoklonalne (partia nr 10032512, 00128965, Wuhan Sanying Biotechnology Co., LTD.); 4% paraformaldehydu, zestaw do barwienia immunofluorescencji (partia nr 20240106, 20240315, Shanghai Bio-Technology Co., Ltd.); Hematoksylina i eozyna (hexa) eozyna, He) Zestaw do barwienia, zestaw do barwienia NISSL (numer partii: 20240401, 20240402, Liaoning Meilun Biology); Zestaw uniwersalny immunohistochemii (numer partii: 43731a, Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.).
Me2 0 4e 1/10, 000 Bilans elektroniczny (Mettler Toledo, USA); Milli-Q Laboratory Pure Water System (Merck, Niemcy); Wielofunkcyjny czytnik mikropłytek SpectraMax ID3 (Molecular Devices, USA); Fluorescencja Leicadm 2000 Fluorescencja pionowa (Leica, Niemcy); 63008 Otwarte pole, 63010 podwyższone plus labirynt, 63022 wymuszone pływanie, DB001 Morris Water Maze, System analizy wideo Smart 3.0 Animal Behavior (Shenzhen Ruiwode Life Science Technology Co., Ltd.).
60 myszy SPF C57BL/6, ważenie 18-22 g, zakupiono od Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd. (nr licencji produkcyjnej Scxk (Beijing) 2020-0033, eksperymentalne użytkowanie nr licencji Syxk (beijing) 2021-0011).
Myszy przechowywano w środowisku SPF, z kontrolą temperatury otoczenia w (21 ± 2) stopnia, wilgotność utrzymywała się na poziomie 60% ± 10%, a 12-godzinny cykl światła. Myszy miały bezpłatny dostęp do żywności i wody, a eksperyment rozpoczął się po 1 tygodniu karmienia adaptacyjnego. Zwierzęta eksperymentalne przechowywano w eksperymentalnym centrum zwierząt Shaanxi University of Chinese Medicine. Wszystkie mysie procedury eksperymentalne w tym badaniu zostały zatwierdzone przez komitet ds. Etyki eksperymentów na zwierzętach Shaanxi University of Chinese Medicine (SuckMDL20231015003).
1.2 Metody eksperymentalne
1.2.1 Grupowanie, modelowanie i podawanie leków
Po 1 tygodniu adaptacyjnego karmienia myszy 7- SPF C57BL/6, nieelastycznych myszy, które spełniały wymagania kolejnych eksperymentów, przesiewano za pomocą testu preferencji wody cukrowej i losowo podzielone na grupę kontrolną (Con), grupę modelową (mod), wysoką dawkę CPHGS (CPHGS-H; 700 MG/KG), Midia DOSE CPHS Grupa Grupa Grupa (MOD), grupa Model CPHS. (CPHGS-M; 350 mg/kg), grupa CPHGS o niskiej dawce (CPHGSL; 175 mg/kg) i grupa fluoksetyny (FLX; 15 mg/kg), z 10 myszami w każdej grupie. Z wyjątkiem CON, myszy w innych grupach zaczęły być poddawane stresowi przez 4 tygodnie [10]. Zastosowano w sumie 10 stresorów, w tym powściągliwość (1 h), wstrząsanie (1 h), zawieszenie ogona (1 h), 45- klatka stopniowa przechylenie (24 godziny), mokra ściółka (24 godziny), pusta klatka (24 godziny), nocne oświetlenie (12 godzin), 41 stopni gorącej wody pływając przez 5 minut, 4 stopni lodowcowej wody na 5 min i tylnym przyczepce przez 2 min. Dwa bodźce były losowo wybierane każdego dnia, a ten sam bodziec nie pojawił się w dwa kolejne dni. Po 4 tygodniach modelowania myszy CPHGS-H, CPHGS-M i CPHGS-L podano odpowiednie dawki CPHGS przez interfejs według masy ciała, a myszy FLX podawano fluoksetynę przez zgłębnik (10 mg/kg). Dawkowanie CPHGS-M i FLX u myszy przekształcono zgodnie z równoważnym współczynnikiem powierzchni ciała między dorosłymi i myszami, a fluktuacja 2 razy była niskie i wysokie dawki CPHG. Myszy Con i mod otrzymały równą objętość wody dejonizowanej przez żnienie. Myszy zgłaszano raz dziennie przez 4 tygodnie. Testy neurobehawioralne przeprowadzono w 8. tygodniu.
1.2.2 Eksperyment neurobehawioralny
1.2.2.1 Eksperferencja preferencji wody cukrowej
Przed testem preferencji sacharozy (SPT) myszy powinny być umieszczone w jednej klatce, a następnie dostosowywać do wody cukrowej przez 3 dni. Pierwszego dnia podawano dwie butelki 1% wody sacharozy, a drugiego dnia podawano jedną butelkę wody cukrowej i jedną butelkę wody dejonizowanej przez 24 godziny. Trzeciego dnia pozycje wody cukrowej i czystej wody wymieniono na 24 godziny, a eksperyment zakończył się 24 godziny później. Czwartego dnia myszy pościły i pozbawiono wody przez 24 godziny. Piątego dnia po ważeniu podano jedną butelkę wody cukrowej i jedną butelkę czystej wody, a pozycje wymieniono po 12 godzinach. Po 24 godzinach dwie butelki zostały usunięte i zważono ponownie, a wskaźnik zużycia wody cukrowej obliczono (szybkość zużycia wody cukrowej=zużycie wody cukrowej/(zużycie wody cukrowej + zużycie wody) × 100%).
1.2.2.2 Test otwartego pola
Test pola otwartego (OFT) przeprowadzono w otwartej skrzynce sześcianowej o wymiarach 50 cm × 50 cm × 50 cm. Środek pudełka zdefiniowano jako kwadrat o długości bocznej 25 cm. Myszy umieszczono na środku pudełka i pozostawiono do adaptacji przez 5 minut. Trajektorię ruchu myszy analizowano w ciągu ostatnich 5 minut. Wskaźniki oceny obejmowały całkowitą odległość ruchu myszy na otwartym polu, czas aktywności w środku otwartego pola i liczbę wchodzili do środka. 1.2.2.3 Test zawieszenia ogona Test zawiesiny ogona (TST) jest zawieszenie myszy za ogon, aby jej głowa była trzymana w pewnej odległości od ziemi. Walka myszy w ciągu 6 minut została zarejestrowana, a czas bezruchu myszy w ciągu ostatnich 4 minut.
1.2.2.4 Wymuszone test pływania
Wymuszonym testem pływackim (FST) jest umieszczenie myszy w przezroczystej cylindrycznej lufy (średnica 15 cm × 50 cm wysokości) wypełnioną wodą (25 ± 2) stopni, a poziom wody osiągnął 20 cm. Zmagano zmaganie myszy w wodzie w ciągu 6 minut, a czas bezruchu myszy w ciągu ostatnich 4 minut.
1.2.3 Zbiór próbek
Pod koniec 8 tygodnia myszy głęboko znieczulono przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (3%, 10 ml/kg). Po znieczuleniu stan znieczulenia potwierdzono poprzez obserwowanie powolnego oddychania, rozluźnienia mięśni i braku reakcji na operację chirurgiczną. Następnie krew myszy zebrano przez usuwanie oczu, a myszy zabito przez zwichnięcie szyjki macicy. Serce perfundowano solą fizjologiczną, a następnie mózg szybko otworzył i nienaruszono mózg. Spłukano go wstępnie chłodzonym solą fizjologiczną, a połowa z nich została ustalona 4% paraformaldehydu przez 72 godziny; Tkanka hipokampa drugiej połowy została oddzielona na lodzie i przechowywana w ciekłym azocie do późniejszego zastosowania. Weź 10 mg mysiej próbki tkanki hipokampa, dodaj wstępnie chłodzoną solę fizjologiczną w stosunku do objętości masowej 1: 9 i mechanicznie homogenizuj w kąpieli lodowej. Po homogenizacji, wirowanie przy 4 000 r/min przez 15 minut (promień odśrodkowy 4,5 cm), zebraj supernatant do wykrycia.
1.2.4 Określenie wskaźnika neuroprzekaźnika
Weź odpowiednią ilość mysiej surowicy i tkanki hipokampa homogenatu i wykryj zawartość zawartości 5-} HT i DA zgodnie z metodą obsługi zestawu.
1.2.5 Określenie indeksu biochemicznego tkanki hipokampa
Weź supernatant homogenatu tkanki hipokampa i użyj zestawu BCA do określenia stężenia białka. Zgodnie z instrukcjami zestawu, absorbancja A zapalnych mediatorów (iNOS, Cox -2 i pGe2) i czynniki zapalne (tnf, il -1, il -18, il -6, ifn-) w supernatantie hippocampal jest określony przez enzyme. Marker i zawartość każdej substancji jest obliczana, a dane są rejestrowane i analizowane statystycznie.
1.2.6 Barwienie tkanki hipokampa
Próbki tkanek całego mózgu utrwalono przez ponad 72 godziny i wykonano skrawki parafinowe o grubości 4 μm. Po dewaxie z ksylenem próbki nawilżono gradientem etanolem (zanurzono w 100% etanolu I i II przez 5 minut, a w 95%, 90%, 80% i 70% etanolu odpowiednio przez 2 min) i przemyto trzykrotnie z PBS, zabarwiono eozyną przez 5 minut, płukano w wodach prądowych przez 5 minut, kontrastę z hematoksylą przez 1%, różniącego się SHIDRORIC, Chloronem. Kwasowy etanol przez 2 s i przepłukany w wodzie z kranu przez 10 minut. Odwodniono gradientem etanolem (80% etanolu przez 2 min, 95% etanolu przez 2 min, etanol I i 100% etanolu II przez 5 minut każdy), przezroczysty ksylenem, uszczelniony neutralną gumą i suszony na powietrzu. Zmiany morfologiczne komórek tkanek hipokampa w każdej grupie myszy zaobserwowano pod mikroskopem.
1.2.7 Barwienie NISSL tkanki hipokampa
Skrawki parafinowe przygotowane pod „1.2.5” dewaxowano i nawilżono, a następnie wybarwiono roztworem barwienia NISSL przez 10 minut, przemyto dwukrotnie wodą destylowaną przez 3 minuty za każdym razem, odwodniono gradientem etanolem (80% etanolem przez 2 minuty, 95% etanolu przez 2 min, etanol I i 100% etanolu II przez 5 minut), przegrany, uszczelniono z neutyralistą i gumą i 15 minurem i 100 -letnim etanolem i etanolem i 100% etanolem) suszone powietrze. Zmiany morfologiczne komórek tkanek hipokampa w każdej grupie myszy zaobserwowano pod mikroskopem.
1.2.8 Immunohistochemia tkanki hipokampa
Próbki tkanek hipokampa osadzonych w parafinie przetworzono przez barwienie immunohistochemii (IHC) zgodnie z instrukcjami uniwersalnego zestawu immunohistochemii. Po dewaxingu, nawodnieniu, naprawie antygenu, blokowaniu peroksydazy i blokowaniu, IBA -1 (1: 400), GFAP (1: 400), LRP31: 300) i kaspse1 (1: 400) pierwotne przeciwciała i inkubowano przez noc w wieku 4 stopni. Po opracowaniu kolorów DAB, barwienia jądrowym, odwodnieniem i uszczelnianiem, pozytywnej ekspresji IBA1, GFAP, NLRP3 i kaspse -1 zaobserwowano pod mikroskopem świetlnym, a obrazy analizowano za pomocą Image J.
1.2.9 Wykrywanie immunofluorescencji tkanki hipokampa
Próbki tkanki hipokampa osadzonych w parafinie przetwarzano przez barwienie immunofluorescencyjne zgodnie z instrukcjami zestawu immunofluorescencyjnego. Skrawki parafinowe przygotowane w ramach „1.2.5” zostały zhwakowane, nawilżone, antygenowe naprawione i zablokowane, a następnie TLR4 (1: 400) i P-NF-κB P65 (1: 200) dodano do skrawków i inkubowano przez noc. Pierwotne przeciwciało usunięto następnego dnia, przemyto trzy razy PBS, a wtórne przeciwciało (1: 500) dodano i inkubowano w ciemności przez 1 godzinę. Po trzykrotnym przemyciu skrawki zapieczętowano utrwalającą DAPI. Sygnał fluorescencyjny obszaru tkanki hipokampa zaobserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a obrazy analizowano za pomocą Image J.
1.3 Przetwarzanie danych
Dane eksperymentalne analizowano statystycznie przy użyciu oprogramowania statystycznego SPSS 26. 0 i GraphPad Prism 9. 0. Dane wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (x ± S), a analizę przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowej ANOVA. Porównanie dwóch grup przeprowadzono za pomocą testu Dunnett. P<0.05 indicated that the difference was statistically significant.
