Zmiana okablowania metabolizmu glukozy i lipidów indukowana przez wyciszenie receptora 17 sprzężonego z białkiem G umożliwia przejście progenitorów oligodendrocytów do komórek mielinujących

Abstrakcyjny:W dojrzałym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) oligodendrocyty (OL) zapewniają wsparcie i izolację aksonów dzięki wytwarzaniu osłonki mielinowej. Podczas ich dojrzewania do komórek mielinujących, OLswymagają energii i budulca dla lipidów, co oznacza wielką inwestycję wpaliwa energetyczneImolekularne źródła węgla. Receptor 17 sprzężony z białkiem G oligodendrogleju (GPR17) okazał się kluczowym graczem w dojrzewaniu OL; osiąga maksymalną ekspresję w pre-OL, ale potem musi zostać zinternalizowany, aby umożliwić końcowe dojrzewanie. W tym badaniu naszym celem jest wyjaśnienie roli fizjologicznego GPR17regulacja w dół metabolizmu OLpoprzez zastosowanie transkryptomiki, metabolomiki i lipidomiki do różnicowania OL. Po wyciszeniu GPR17 stwierdziliśmy znaczny wzrost dojrzałych markerów OL i zmianę kilku genów zaangażowanych wmetabolizm glukozyIbiosynteza lipidów. Zaobserwowaliśmy również wzrostuwalnianie mleczanu, który jest częściowo odpowiedzialny zaprzyspieszenie dojrzewaniawywołane przezRegulacja w dół GPR17. Jednocześnie wyczerpanie GPR17 zmieniło również kinetykę określonej mielinyklasy lipidów. Na całym świecie badanie to ujawnia funkcjonalne powiązanie międzyekspresja GPR17, wydzielanie mleczanuIskład mielinyi sugeruje, że innowacyjne interwencje ukierunkowane na GPR17 mogą pomóc we wspieraniu endogennej mielinizacji w chorobach demielinizacyjnych.

KLIKNIJ TUTAJ, ABY POBRAĆ CISTANCHE ZWIĄZANE ZWSPIERAJ ENDOGENNĄ MYELINACJĘ

Słowa kluczowe:komórka progenitorowa oligodendrocytu; oligodendrocyt;metabolizm energetyczny; glikoliza; mleczan; lipidy mielinowe; transkryptomika;metabolomika; lipidomika; mielinizacja

1. Wstęp

W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) oligodendrocyty (OLs) są komórkami odpowiedzialnymi za produkcję mieliny, struktury izolacyjnej charakteryzującej się wyjątkowo wysoką zawartością lipidów, która zachowuje funkcję aksonów i umożliwia szybkie przewodnictwo neuronalne [1]. Te wyspecjalizowane funkcje wymagają, aby komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC) przeszły ściśle zorganizowany program różnicowania, podczas którego stopniowo zmieniają swój metabolizm i modyfikują skład błony komórkowej poprzez syntezę typowych lipidów mielinowych [2]. Jeden OL może mielinizować do 50 aksonów, z aż 150 warstwami zwartej błony mielinowej na segment, co wymaga znacznego zapotrzebowania energetycznego [3]. Badania in vitro wykazały, że tempo glikolizy w porównaniu z fosforylacją oksydacyjną zależy od etapu różnicowania OL [4,5] i sugerowało, że nowo utworzone OL/późne OPC są najbardziej podatne na inhibicję kompleksu I [6]. W optymalnych warunkach hodowane postnatalne OPC i OL polegają na fosforylacji oksydacyjnej do syntezy ATP, podczas gdy dorosłe OL preferencyjnie wykorzystują glikolizę [7]. Co ciekawe, w środowisku o niskiej zawartości glukozy rozwój OL i mielinizację mogą wspierać monokarboksylany, takie jak ciała ketonowe i mleczan, których transport do i z komórki wymaga transporterów monokarboksylanów (MCT). Warto zauważyć, że Ichihara i współpracownicy wykazali, że mleczan był w stanie uratować cykl OPC i różnicowanie w warunkach niskiego poziomu glukozy i że efekt ten został zahamowany przez inhibitor transportera mleczanu, co sugeruje, że dostępność mleczanu pozwala OL na podtrzymanie fosforylacji oksydacyjnej i syntezy mieliny lipidowej [4] . W OL i błonach mielinowych obecne są różne klasy lipidów, w tym cholesterol, fosfolipidy i glikosfingolipidy. Chociaż nie ma unikatowych rodzajów lipidów występujących w mielinie, w błonie OL opisano stałe zmiany proporcji kilku rodzajów lipidów podczas różnicowania [8].

OL odgrywają również aktywną i dynamiczną rolę w metabolizmie neuronów [9]. Pobierają glukozę pochodzącą z krwioobiegu i przeprowadzają glikolizę w celu wytworzenia pirogronianu i mleczanu, które są następnie dostarczane do przedziału aksonalnego przez MCT, umożliwiając w ten sposób oddychanie mitochondrialne i wytwarzanie ATP [10].

Podczas różnicowania OPC podlegają wpływowi czynników zewnętrznych, które dynamicznie modulują ich funkcje poprzez interakcje z określonymi receptorami [11]. Spośród nich receptor 17 sprzężony z białkiem G (GPR17) okazał się obiecującym celem remielinizacji w stwardnieniu rozsianym (MS). GPR17 jest receptorem przejściowo wyrażanym w OPC, osiągając maksymalne poziomy w pre-OL na pośrednich etapach różnicowania wyrażających niedojrzały marker O4. Jego przejściowa ekspresja jest niezbędna do terminowego i fizjologicznego dojrzewania OPC; rzeczywiście, po etapie O 4-dodatnim, receptor ten musi być stopniowo regulowany w dół, aby umożliwić końcowe dojrzewanie i mielinizację [12,13]. Jakakolwiek ingerencja w tę terminową i fizjologiczną ekspresję skutkuje dysfunkcją i ostatecznie niepowodzeniem mielinizacji. Nadekspresję GPR17 opisano w kilku modelach chorób, takich jak niedokrwienie mózgu [14], demielinizacja wywołana kuprizonem i lizolecytyną [15,16], stany podobne do choroby Alzheimera [17], stwardnienie zanikowe boczne [18] i eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) [15,19]. Wyraźną regulację w górę GPR17 i/lub akumulację komórek wykazujących ekspresję GPR{22}}na granicy zmian demielinizacyjnych obserwowano także u pacjentów dotkniętych SM [19,20], urazowym uszkodzeniem mózgu [21] i wrodzoną leukoencefalopatią [22]. W obecności silnych stanów prozapalnych komórki wykazujące ekspresję GPR17-gromadzą się w miejscach uszkodzeń, pozostając w stadiach pośrednich i niezdolne do udziału w remielinizacji, co sugeruje, że rozregulowanie regulacji w dół receptora przyczynia się do niepowodzenia remielinizacji i choroby postęp. Pomimo tych danych zdarzenia molekularne wynikające z obniżenia poziomu GPR17 nie zostały w pełni wyjaśnione. Warto zauważyć, że uważa się, że dysfunkcje metaboliczne odgrywają ważną rolę w mechanizmie progresji różnych chorób neurodegeneracyjnych [23], w tym SM [24–26]. Obecność dysfunkcji metabolicznych w SM wymaga lepszego zrozumienia roli metabolitów bioenergetycznych i związanych z nimi mechanizmów w regulacji funkcji OL. Opierając się na tych rozważaniach, w niniejszym badaniu staramy się zrozumieć, czy i jak modulacja GPR17 bezpośrednio wpływa na bioenergetykę OL podczas różnicowania za pomocą profilowania transkryptu, metabolitu i lipidów. Analiza transkryptomiczna wykazała, że ​​wyciszenie GPR17 w różnicujących się OPC zwiększa ekspresję dojrzałych markerów i indukuje zmiany w kilku genach zaangażowanych w transkrypcyjną regulację homeostazy lipidów i glukozy. Co więcej, nasza analiza metabolomiczna wykazała, że ​​po obniżeniu poziomu GPR17, OL zmieniają swój metabolizm i zwiększają uwalnianie mleczanu, co może bezpośrednio wpływać na program różnicowania OL. Ponadto za pomocą analizy lipidomicznej wykazaliśmy również, że wyciszenie GPR17 zmienia obfitość lipidów specyficznych dla mieliny. Łącznie odkrycia te sugerują, że obniżenie poziomu GPR17 w różnicujących OL indukuje zmiany zarówno metabolizmu energetycznego, jak i lipidów błonowych wymaganych do ich różnicowania w dojrzałe komórki mielinizujące i że celowanie w GPR17 można wykorzystać do ratowania dysfunkcji metabolicznych typowych dla chorób demielinizacyjnych.

2. Materiały i metody

2.1. Postępowano zgodnie z międzynarodowymi (dyrektywa prawa europejskiego 2010/63/UE) i krajowymi (prawo włoskie DL nr 26, 4 marca 2014 r.) dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (5247B.N.L2Y do MPA). Ciężarne szczury zakupiono od Charles River Italia i trzymano w cyklu 12-h światła/12-h ciemności w temperaturze 21°C, z dietą i wodą ad libitum oraz wzbogacaniem środowiska.

2.2. Izolacja OPC szczura

Pierwotne OPC szczurów uzyskano z kory mózgowej szczurów Sprague-Dawley drugiego dnia po urodzeniu (P2), połączonych razem, jak opisano wcześniej [27,28]. OPC wysiano na płytki poli-D, powlekane L-ornityną (końcowe stężenie 50 µg / ml; Sigma-Aldrich, Mediolan, Włochy) 10 cm (2–4 × 105 komórek / szkiełko nakrywkowe) do analizy metabolomicznej na poli-D , szklane szkiełka nakrywkowe 13-}mm pokryte L-ornityną do immunocytochemii (1–2 × 104 komórek/szkiełko nakrywkowe) i na płytkach 6-pokrytych poli-D 6-}dołkami (7 × 104 komórek/ szkiełka nakrywkowego) do analizy lipidomicznej i qRT-PCR. Komórki wysiano w pożywce Neurobasal uzupełnionej 2% B27 (Life Technologies, Monza, Włochy), 2 mM L-glutaminy, 10 ng/ml ludzkiego płytkopochodnego czynnika wzrostu-BB (Sigma-Aldrich, Mediolan, Włochy) i 10 ng/ml ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (Life Technologies, Monza, Włochy) w celu pobudzenia proliferacji przez 3 dni.

2.3. Transfekcja siRNA

OPC transfekowano natychmiast po zmianie z proliferującej na różnicującą pożywkę (pożywka Neurobasal uzupełniona 2 procentami B27 (Life Technologies, Monza, Włochy), 2 mM L-glutaminy i 15 nM hormonu T3). Docelowy plus siRNA SMARTpool specyficzny dla szczurzego transkryptu GPR17 (Dharmacon, Lafayette, CO, USA) transfekowano w końcowym stężeniu 50 nM odczynnikiem Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies, Monza, Włochy), zgodnie z protokołem producenta. Transfekcję puli RNA niedocelowej zastosowano jako kontrolę negatywną.

2.4. Profilowanie transkryptomu i analiza mikromacierzy

Ekstrakcję RNA i analizę transkryptomu przeprowadzono zgodnie z opublikowanymi protokołami [27]. W skrócie, OPC poddano lizie buforem RLT (Qiagen, Mediolan, Włochy) 2 dni po transfekcji siRNA i ekstrahowano całkowity RNA za pomocą zestawu RNeasy Micro (Qiagen, Mediolan, Włochy), zgodnie z protokołem producenta. Jakość RNA oceniono za pomocą Agilent 21{23}}0 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Mediolan, Włochy). Do analiz mikromacierzy użyto RNA o liczbie integralności RNA (RIN) > 7. Znakowany cRNA zsyntetyzowano ze 100 ng całkowitego RNA przy użyciu zestawu Low Input Quick-Amp Labeling Kit, jeden kolor (Agilent Technologies, Mediolan, Włochy) w obecności cyjaniny 3-CTP. Całkowity RNA hybrydyzowano na mikromacierzach SurePrint G3 Rat Gene Expression Microarrays (#G4858A-074036, Agilent Technologies, Mediolan, Włochy). Ta mikromacierz składa się z 60-merycznych sond DNA syntetyzowanych in situ, które reprezentują 30 584 szczurze transkrypty. Hybrydyzację prowadzono w temperaturze 65°C przez 17 godzin w obrotowym piecu (Microarray Facility, Laboratorio per le Tecnologie delle Terapie Avanzate, LTTA, Ferrara, Włochy). Jednokolorową analizę ekspresji genów przeprowadzono zgodnie z procedurą producenta. Oprogramowanie Feature Extraction 10.7.3 (Agilent Technologies, Mediolan, Włochy) zostało użyte do uzyskania surowych danych z mikromacierzy. Rozważono krotność zmiany ± 1, 5 i skorygowaną o FDR wartość p <0, 07, aby uzyskać listę genów ulegających różnej ekspresji między dwoma warunkami eksperymentalnymi.

2.5. Analiza bioinformatyczna

Oprogramowanie Metacore™ (Clarivate Analytics, Londyn, Wielka Brytania) i Ingenuity® Pathway Analysis firmy QIAGEN (IPA®, QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/ingenuity, dostęp 14 maja 2017 r.) zostały użyte do przeprowadzenia klastryzacji opartej na ścieżkach na geny o różnej ekspresji po wyciszeniu GPR17 w OPC, aby zidentyfikować wspólne procesy biologiczne. Do przeprowadzenia analizy wzbogacania opartej na ontologii genów wykorzystano pakiet ToppGene [29].

2.6. Ukierunkowana Metabolomika i Lipidomika

Dane metabolomiczne uzyskano metodą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS), jak opisano wcześniej [30,31], z pewnymi modyfikacjami opisanymi poniżej. Użyliśmy potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego API -3500 (AB Sciex, Framingham, MA, USA) połączonego z systemem ExionLC™ AC (AB Sciex). Komórki OPC z różnych punktów czasowych i/lub transfekowane siRNA rozbijano w laserze tkankowym przez 1 min z maksymalną szybkością w 250 µl lodowatego metanolu/wody/acetonitrylu 55:25:2{{5{{ 66}}}}. Lizaty wirowano w 15,000× g przez 15 min w 4°C. Następnie próbki wysuszono pod osłoną N2 w temperaturze 4{68}} ◦C i ponownie zawieszono w 125 µl lodowatego MeOH/H2{72}}/ACN 55:25:2{77}} do dalszych analiz. Oznaczenie ilościowe aminokwasów przeprowadzono poprzez poprzednią derywatyzację. W skrócie, 25 µl ze 125 µl próbek zebrano i wysuszono oddzielnie w strumieniu N2 w 4 {{8{82}}}} ◦C. Wysuszone pozostałości ponownie zawieszono w 5{87}} µl izotiocyjanianu fenylu (PITC), EtOH, pirydyny i wody 5% :31,5% :31,5% :31,5%, a następnie inkubowano przez 20 min w temp. RT, suszono pod osłoną N2 w 40 ◦C przez 90 min i ostatecznie ponownie zawieszono w 1{{1{1{1{1{1{11{111}}}} 9}}6}}5}}1}}0 µl 5 mM octanu amonu w MeOH/H2O 50:50. Oznaczenie ilościowe różnych aminokwasów przeprowadzono przy użyciu kolumny C18 (Biocrates, Innsbruck, Austria) utrzymywanej w temperaturze 50 ◦C. Fazy ​​ruchome do analizy trybu jonów dodatnich to faza A: 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie i faza B: 0,2% kwasu mrówkowego w acetonitrylu. Gradient wynosił T0: 100 procent A, T5,5: 5 procent A, T7: 100 procent A przy natężeniu przepływu 500 ul/min. Oznaczenie ilościowe metabolitów energii i kofaktorów przeprowadzono przy użyciu kolumny LUNA z fazą cyjano (50 mm × 4, 6 mm, 5 µm; Phenomenex) przez 5, 5 min. w trybie jonów ujemnych z dwoma oddzielnymi przebiegami. Protokół A; fazą ruchomą A była woda, a fazą B był 2 mM octan amonu w MeOH i gradient T0: 80 procent B 0,5 ml/min; T1: 80 procent B 0,5 ml/min; T1.01: 20 procent B 0,5 ml/min; T2.0: 20 procent B 0,5 ml/min; T2.01: 80 procent B 0,5 ml/min; T5,5: 80 procent B 0,5 ml/min. Protokół B; fazą ruchomą A była woda, a fazą B był 2 mM octan amonu w MeOH i gradient T0: 50 procent B 0,5 ml/min; T1: 50 procent B 0,5 ml/min; T1.01: 0 procent B 0,5 ml/min; T2,0: 0 procent B 0,5 ml/min; T2.01: 50 procent B 0,5 ml/min; T5,5: 50 procent B 0,5 ml/min. Oznaczenie ilościowe acylokarnityny przeprowadzono na tych samych próbkach przy użyciu kolumny C18 (Biocrates, Innsbruck, Austria) utrzymywanej w temperaturze 50°C. Próbki analizowano przez 5,5 minuty w trybie jonów dodatnich. Fazy ​​ruchome to A: 0,1% kwas mrówkowy w H2O B: 0,1% kwas mrówkowy w MeOH i gradient T0:30% B, T0,8: 30% A, T2: 100% B, T3: 100% B, T3 0,01: 30 procent B, T5,5: 30 procent B przy szybkości przepływu 500 µl/min.

Poziomy fosfolipidów i kwasów tłuszczowych oceniono za pomocą (LC)-MS/MS zgodnie z opublikowanym protokołem [32,33] z pewnymi modyfikacjami opisanymi poniżej. Fosfolipidy analizowano zarówno pod kątem jonizacji ujemnej, jak i dodatniej na ekstraktach MeOH/H2{19}}/ACN za pomocą spektrometru mas z potrójnym kwadrupolem API{4}} (AB Sciex, Framingham, MA, USA) połączonego z systemem HPLC (Agilent ) i autosampler CTC-PAL HTS (system PAL). Do analizy jonizacji ujemnej lipidy rozdzielono na kolumnie LUNA z fazą cyjano (50 mm × 4,6 mm, 5 µm; Phenomenex) w ciągu 5 minut, a fazą ruchomą był 5 mM octan amonu w MeOH. W przypadku jonizacji dodatniej anality rozdzielono na kolumnie XTerra RP18 3,5 µm 4,6 mm × 100 mm (Waters) w ciągu 8 minut, a fazą ruchomą był 0,1% kwas mrówkowy w MeOH. Wolne kwasy tłuszczowe analizowano w trybie jonów ujemnych na kolumnie Hypersil Gold C8 (Life Technologies) z fazą ruchomą składającą się z 10 mM diizopropyloetyloaminy i 15 mM kwasu octowego w H2O/MeOH 97:3. Wszystkie metabolity analizowane w opisanych protokołach zostały wcześniej zwalidowane przy użyciu czystych standardów, z wyjątkiem fosfolipidów, gdzie zwalidowano tylko tych przedstawicieli różnych klas. Oprogramowanie MultiQuant™ (wersja 3.0.3, AB Sciex) zastosowano do analizy danych i przeglądu pików chromatogramów. Do przetwarzania danych, surowe obszary zostały znormalizowane przez medianę wszystkich obszarów metabolitów w tej samej próbce. W szczególności zdefiniowaliśmy względną obfitość metabolitów (ma N) jako:

gdzie Xn reprezentuje powierzchnię piku metabolitu n dla próbek a, b, . . . , z i Ma n =1 a reprezentują medianę powierzchni pików metabolitu n dla próbek a, b, . . . , z. Uzyskane dane zostały następnie przekształcone przez transformację logarytmiczną10-i przeskalowane w skali Pareto, aby skorygować heteroskedastyczność, zmniejszyć skośność danych i zredukować efekt maski [34]. Szczegółowo otrzymane wartości przekształcono log10, a następnie przeskalowano metodą Pareto w następujący sposób:

gdzie xi to przekształcona wartość w macierzy danych (i (metabolity), j (próbki)), a si to odchylenie standardowe wartości przekształconych metabolitów [35]. Otrzymane wartości uznano za względne poziomy metabolitów. Przetwarzanie i analizę danych przeprowadzono za pomocą narzędzia internetowego MetaboAnalyst 5.{2}} [36].

2.7. Immunocytochemia i liczenie komórek

Komórki utrwalono w 4% roztworze buforowanym fosforanem paraformaldehydu, zawierającym 4% sacharozy. Zastosowano następujące przeciwciała pierwotne: królicze anty-GPR17 (1:100; Cayman Chemical) i szczurze anty-MBP (1:200; Merck Millipore, Mediolan, Włochy). Inkubację przeciwciał pierwszorzędowych prowadzono przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C. Komórki następnie inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z drugorzędowymi przeciwciałami skoniugowanymi z AlexaFluor 488 lub AlexaFluor 555 (1:600; Life Technologies, Monza, Włochy). Wszystkie przeciwciała rozcieńczono w buforowanym fosforanem roztworze blokującym (pH 7,4) zawierającym 0,3 procent Triton X-100. Jądra znakowano barwnikiem fluorescencyjnym UV Hoechst 33258 (1:10, 000; Life Technologies, Monza, Włochy). Następnie szkiełka nakrywkowe umieszczono we fluorescencyjnym środku do zatapiania (Dako). Komórki pozytywne dla wybranych markerów zliczono z 20 losowych pól dla każdego szkiełka nakrywkowego (0,07 mm2/Fifield). Wynik wyrażono jako procent liczby jąder, a następnie znormalizowano względem kontroli ustawionych na 100 procent.

2.8. Leczenie za pomocą AR-C155858

Jeden dzień po transfekcji siRNA (dzień w różnicowaniu 1), kontrolne i wyciszone GPR17-OPC potraktowano AR-C155858 (Tocris, Wielka Brytania; stężenie końcowe: 1 µM) lub podłożem (0,04 procent DMSO). Po dwóch dniach (dzień w różnicowaniu 3) OPC poddano lizie do późniejszej analizy RNA lub potraktowano ponownie, a następnie zebrano w dniu w różnicowaniu 5.

2.9. Ekstrakcja całkowitego RNA, retrotranskrypcja i analiza qPCR

Komórki poddano lizie odczynnikiem Trizol (Life Technologies, Monza, Włochy) 1, 2, 3 lub 5 dni po transfekcji. Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu zestawu do mikropreparacji Direct-zol RNA (Zymo Research, Niemcy). Do analizy ekspresji genów przeprowadzono syntezę cDNA zaczynając od 400–800 ng całkowitego RNA przy użyciu zestawu do syntezy cDNA SensiFAST™ (Bioline, Londyn, Wielka Brytania). Ekspresję wszystkich genów analizowano za pomocą SensiFAST™ SYBR Supermix (Bioline, Londyn, Wielka Brytania) i normalizowano do ekspresji GAPDH przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym CFX96 (Bio-rad, Mediolan, Włochy) zgodnie z protokołem producenta.

2.10. Analiza statystyczna

Dane przedstawiono jako średnią ± SEM i przeanalizowano za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 8.0.1. Dla wszystkich porównań między dwiema grupami o rozkładzie normalnym przeprowadzono dwustronne niesparowane testy t-Studenta. Do analizy próbek ludzkich zastosowano dwustronne sparowane testy t-Studenta. Do wielokrotnych porównań grup o rozkładzie normalnym zastosowano jedno- lub dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) wraz z wielokrotnym testem post hoc Tukeya lub Sidaka. O ile nie określono inaczej, p < 0, 05 uznano za istotne statystycznie.

Zapytaj o więcej:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950

SKLEP:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop