Wydzielona lipokalina związana z żelatynazą neutrofili wykazuje silniejszą zdolność do hamowania powiększania się cyst w komórkach ADPKD w porównaniu z postacią niewydzieloną Ⅳ

4. Dyskusja

W tym badaniu wykazaliśmy, że dodatek i/lub nadekspresja wydzielanego mNGALbiałko zmniejszało proliferację komórek 2L3Ihamował wzrost cyst in vitro poprzez regulację w górę apoptozyi autofagia iregulacja w dół szlaków sygnalizacyjnych związanych z proliferacją. Aby określić, czy komórki M-1, uzyskane z podobnych loci kanalików nerkowych myszy jak komórki 2L3, można zastosować jako komórki kontrolne typu dzikiego dla komórek 2L3, barwienie lektynami komórek M-1 i 2L3 za pomocą LTL i przeprowadzono DBA (ryc. 1D). LTL i DBA wykorzystano odpowiednio do identyfikacji zróżnicowanych kanalików proksymalnych i przewodów zbiorczych nerek myszy [45,46]. Odkrycia wskazują, że komórki M-1 mają podobną morfologię (ryc. 1C) i pochodzenie kanalików nerkowych (ryc. 1D) do komórek 2L3; dlatego też linię komórkową M-1 wybrano jako kontrolę typu dzikiego dla komórek 2L3.

NOWE ZIOŁA DLAADPKD(WIELOTORBIELOWATOŚĆ NEREK)

W większości przypadków klinicznych pacjenci z ADPKD wykazują wyższy poziom NGAL w moczu niż osoby zdrowe [19,47–49]. Wykorzystany w tym badaniu mysi model ADPKD charakteryzuje się również wyższymi poziomami ekspresji NGAL i NGAL-R [31]. Zarówno wyniki RT-qPCR, jak i Western blot wykazały, że komórki 2L3 wyrażały wyższy poziom NGAL niż linia komórkowa M-1 typu dzikiego (Figura 1F, H), podczas gdy nie zidentyfikowano istotnej różnicy w poziomie ekspresji NGAL-R pomiędzy dwie linie komórkowe (ryc. 1G, H), co jest niezgodne z wynikami in vivo [31]. Różnica ta może wynikać ze złożonej interakcji w tkankach myszy, która nie występuje w znacznie prostszym układzie komórkowym.

Wyniki analizy Western blot wykazały, że bezpośrednie podanie i/lub genetyczna nadekspresja mNGAL w 2L3 hamuje szlak ERK. Jak pokazano na rysunkach 4A i 8A, sygnał p-ERK1 (44 kDa) był słabszy niż p-ERK2 (42 kDa), podczas gdy ERK1 (44 kDa) był intensywniejszy niż ERK2 (42 kDa), powodując wyraźny wzrost p-ERK2/ERK2 w porównaniu z p-ERK1/ERK1 we wszystkich grupach doświadczalnych. ERK1 i ERK2 to dwie izoformy ERK, co do których sugeruje się, że mają różny wpływ na proliferację komórek [50]. Stwierdzono, że ERK1 indukuje przeżycie i wzrost komórek; jednakże ERK2 sprzyja różnicowaniu komórek i blokuje wzrost komórek [51]. W naszym badaniu stosunek p-ERK2/ERK2 był znacznie wyższy niż p-ERK1/ERK1 we wszystkich grupach, co wskazywało, że komórki miały tendencję do różnicowania się i ograniczania wzrostu. Jednakże zarówno dodatek, jak i nadekspresja mNGAL radykalnie obniżyły stosunek zarówno p-ERK1/ERK1, jak i p-ERK2/ERK2 w porównaniu z grupą kontrolną i doprowadziły do ​​znacznie niższego stosunku p-ERK/ERK, co wskazywało na efekt mNGAL w hamowaniu proliferacji komórek.

Aby stworzyć platformę hodowli 3D do charakteryzowania i oceny leczenia tworzenia się cyst w komórkach 2L3, próbowano spełnić kilka warunków. Wykazano, że stężenie Matrigelu do hodowli 3D wpływa na odsetek cyst i kanalików strukturalnych powstałych in vitro [25,52,53]. W naszym badaniu odkryliśmy, że 40% Matrigel był najlepszą formułą wykazującą optymalne tworzenie struktury cysty przez komórki 2L3. Było kilka warunków, w tym wzory osadzone i wzory na wierzchu dla kultur 3D [54]. Wybraliśmy metodę on-top (wzór przypominający kanapkę), aby uzyskać lepszy i łatwiejszy sposób analizy cyst (ryc. 6). Jednakże nasze doświadczenie wykazało, że cysty komórek 2L3 nie były wystarczająco duże, gdy były hodowane bez żadnego induktora w hodowli 3D do 14 dnia. Forskolinę powszechnie stosuje się w celu wywołania tworzenia cyst poprzez aktywację cyklazy adenylanowej (AC) w celu zwiększenia cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP). [11,55]. Dlatego w naszym badaniu zastosowaliśmy forskolinę (20 µM) do wywołania tworzenia cyst w komórkach 2L3 przed leczeniem psychicznym.

Nasze poprzednie badanie wykazało, że nadekspresja specyficznej dla nerek NGAL u myszy 2L3 może spowolnić progresję ADPKD poprzez zmniejszenie rozmiaru cysty, ale nie liczby cyst u myszy 2L3 [31]. W niniejszym badaniu dodanie mentalnego znacząco hamowało powiększanie się cyst w komórkach 2L3 poprzez zmniejszenie średnicy torbieli, obszaru i odsetka dużych cyst (ryc. 6F, G, I), podczas gdy nie było znaczącej różnicy we wzrastającym wskaźniku całkowitego liczba cyst (ryc. 6H). Wyniki progresji cysty 2L3 w hodowli 3D były zgodne z wynikami in vivo. Jednakże traktowanie mNGAL hamowało wzrost cyst komórek 2L3 w hodowli 3D, podczas gdy w teście MTT zastosowaliśmy wyższe stężenie mNGAL (2 mg/ml) (ryc. 6) niż w poprzednich eksperymentach 2D (600 µg/ml). wpływ mNGAL na żywotność komórek (ryc. 3). Spekulowaliśmy, że rekombinowany mNGAL oczyszczony z E. coli nie podlegał modyfikacjom potranslacyjnym [56,57] i skutkował niską bioaktywnością rekombinowanego mNGAL. Nadekspresja NGAL w komórkach 2L3 przez transfekcję konstruktami pN + LS i pN - LS może pomóc w wyjaśnieniu tego pytania.

Aby ustalić, czy wyższe stężenie mNGAL (2 mg/ml) stosowane w hodowli 3D w celu zahamowania powiększenia cyst w komórkach 2L3 (ryc. 6) wynikało z braku potranslacyjnej modyfikacji mNGAL oraz sprawdzić, czy NGAL musi być wydzielany i oddziaływać z NGAL-R w celu indukowania apoptozy i dalszego hamowania progresji cyst, konstrukty pN + LS i pN - LS transfekowano do komórek 2L3 w celu nadekspresji wydzielanych i niewydzielanych białek NGAL (Figura 7). Połączone transfekowane komórki zebrano tydzień po selekcji blastycydyną i zarówno transfekcja pN + LS, jak i pN – LS znacznie zwiększyła poziom ekspresji mRNA Lcn2 (całkowitego, w tym zarówno endogennego, jak i egzogennego NGAL) i Lcn2-c-myc (egzogennego NGAL) w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 7F, G) i nie było istotnej różnicy w Lcn2 i Lcn2-c-myc pomiędzy grupami pN + LS i pN – LS (Rysunek 7F, G). Ekspresja Lcn{{20}}myc w grupach pN + LS i pN - LS była w przybliżeniu 8500-krotnie większa niż w komórkach 2L3 (Rysunek 7G); jednakże ekspresja Lcn2 w pN + LS i pN – LS była w przybliżeniu 1,5-krotnie większa niż w komórkach 2L3 (Rysunek 7F). Teoretycznie Lcn2-myc nie był obecny w komórkach 2L3, co prowadziło do niskich poziomów ekspresji (tło) w teście RT–QPCR. W efekcie względny stosunek Lcn2-myc w komórkach pN + LS i pN − LS był znacząco wyższy (około 8500 razy) niż w grupie kontrolnej 2L3, co skutkuje dużą różnicą między względnym stosunkiem Lcn2 i Lcn2-myc. Ponadto współczynnik ekspresji Lcn2 w komórkach pN + LS i pN – LS (pN + LS był 0,91-krotny większy niż pN – LS) był podobny do tego dla Lcn2-c-myc (pN + LS było 1,01-krotnością pN − LS) (Rysunek 7F, G). Wewnątrzkomórkowa ekspresja białka NGAL w komórkach pN + LS i pN - LS była zwiększona w porównaniu z grupą kontrolną (ryc. 7I) i nie było istotnej różnicy między grupami pN + LS i pN - LS. Wyniki analizy Western blot dla całkowitej ekspresji białka NGAL w grupach pN + LS i pN - LS (pN + LS było 0,92-krotności większej niż pN - LS) (Rysunek 7I) były zgodne z wynikami RT–qPCR (pN + LS było 0,91-krotności wartości pN - LS) (Rysunek 7F). Wyniki te wykazały, że poziomy białek NGAL (zarówno całkowitych, jak i egzogennych) w komórkach pN + LS i pN – LS były zbliżone, co wskazywało na konieczność porównania obu grup w dalszych eksperymentach.

Przewidywaliśmy, że nadekspresja NGAL bez peptydu sygnałowego nie zwiększy wydzielania NGAL pomimo wysokiego poziomu wewnątrzkomórkowej ekspresji NGAL. Jednakże wyniki testu ELISA z użyciem supernatantu z hodowli wykazały, że zarówno komórki pN + LS, jak i pN - LS miały znacząco wyższy poziom wydzielanego NGAL niż komórki kontrolne 2L3 (Figura 7J), podczas gdy ilość NGAL wydzielanego przez komórki pN - LS była znacznie niższa niż w przypadku komórek pN + LS (Figura 7J). Wyniki te ujawniły, że nadekspresja NGAL bez peptydu sygnałowego (pN - LS) faktycznie ograniczała wydzielanie NGAL, chociaż w komórkach zidentyfikowano wysoki poziom wewnątrzkomórkowego mRNA i białka NGAL (Figura 7F, I). Wyniki inkorporacji BrdU wykazały znacznie wyższą proliferację komórek pN - LS niż komórek pN + LS (Figura 7K).

Wewnątrzkomórkowe i wydzielnicze ilości NGAL były około 1,6- i 2,2- razy wyższe, odpowiednio w pN + LS niż w komórkach 2L3 (Rysunek 7I, J), co mogło prowadzić do hamowania pN + LS w porównaniu z proliferacją komórek 2L3 (Figura 7K). Jednakże wewnątrzkomórkowe i wydzielane ilości NGAL w komórkach 2L3 były w przybliżeniu 4-krotnie i 5.3-krotnie wyższe niż odpowiednio w komórkach M-1 (Rysunek 1H, I), podczas gdy były wyższe proliferację komórek zaobserwowano w komórkach 2L3 niż w komórkach M-1 (Figura 2C). Podejrzewamy, że zwiększona ekspresja i wydzielanie NGAL, które odgrywają rolę ochronną w komórkach 2L3, jest niewystarczająca, aby zahamować proliferację komórek wynikającą z nokautu Pkd1, ale zwiększona ekspresja i wydzielanie NGAL w pN + LS zapewnia dodatkową NGAL w celu osiągnięcia supresji proliferacji. W naszym poprzednim badaniu myszy Pkd1L3/L3 miały znacznie wyższy poziom białka NGAL i antygenu jądrowego komórek proliferujących (PCNA) w nerkach niż myszy Pkd1+/+ [31]. Niemniej jednak poziom białka NGAL w nerkach u myszy Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg był w przybliżeniu 2-krotnie wyższy niż u myszy Pkd1L3/L3 × NGAL+/+, a nadekspresja NGAL prowadziła do znacznie niższych poziomów PCNA u Pkd1L3 /L3 × NGALTg/Tg niż u myszy Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ i dodatkowo hamował wzrost cyst i wydłużał dni przeżycia [31]. Wydaje się, że NGAL odgrywa rolę ochronną w hamowaniu zwiększonej proliferacji w modelach ADPKD, podczas gdy endogenna ekspresja NGAL jest niewystarczająca i pomocna może być dodatkowa egzogenna NGAL.

Zgodnie z wynikami hodowli 3D (ryc. 10) zarówno grupy pN + LS, jak i pN – LS hamowały wzrost cyst poprzez zmniejszenie średnicy (ryc. 10C), powierzchni (ryc. 10D) i odsetka dużych cyst (średnica > 100 µm). (Rysunek 10F), ale nie liczby (Rysunek 10E). To odkrycie jest niezgodne z naszym podejrzeniem, że tylko pN + LS, ale nie pN - LS hamuje powiększanie torbieli, ponieważ wydzielanie mNGAL z komórek 2L3 jest wymagane do hamowania proliferacji komórek. Jednakże hamowanie powiększenia torbieli przez pN - LS było słabsze niż pN + LS (ryc. 10B – D), co ujawniło, że nadekspresja wydzielanego mNGAL ma lepszą zdolność do hamowania powiększenia cysty komórek 2L3 w hodowli 3D niż niewydzielonego mNGAL . Chociaż w grupie pN + LS obserwujemy silniejsze tłumienie powiększenia torbieli w porównaniu z grupą pN - LS w hodowli 3D, trudno dostrzec lepszy efekt pN + LS niż pN - LS w p-AKT/AKT (ryc. 8B ), p-CREB/CREB (ryc. 8C) i p62 (ryc. 9D). Wykazano, że sprzężenie NGAL i NGAL-R może sekwestrować wewnątrzkomórkowe żelazo i dalej indukować apoptozę [29], co jest związane ze strategią wyczerpywania żelaza wrodzonego układu odpornościowego przed infekcją bakteryjną [30]. Zaproponowaliśmy, że wydzielany mNGAL indukował apoptozę w komórkach 2L3 poprzez interakcję z NGAL-R, podczas gdy niewydzielany mNGAL nie mógł oddziaływać z NGAL-R w celu indukowania apoptozy (Figura 9A, B). Wykazano, że szlaki Ras/B-Raf/MEK/ERK [10,11] i AKT/mTOR [38] ulegają zwiększonej ekspresji w komórkach ADPKD, co prowadzi do zwiększonej proliferacji komórek i powiększenia cyst. Nasze wyniki pokazały, że wydzielany mNGAL hamował szlaki ERK (ryc. 8A) i AKT (ryc. 8B), a niewydzielany mNGAL inaktywował szlak ERK (ryc. 8A). Sugeruje to, że mentalna inaktywacja szlaku ERK może nie być konieczna poprzez NGAL-R. W celu zbadania tej kwestii zostanie przeprowadzony nokaut NGAL-R w komórkach 2L3

Ponadto nadekspresja mNGAL w komórkach 2L3 hamowała powiększenie cyst komórkowych (ryc. 10) i występowała przy stosunkowo niższym wydzielaniu NGAL (2,27 ng/ml) (ryc. 7J) w porównaniu z efektem przy wysokim stężeniu mNGAL (2 mg/ml) mL) zastosowanego w poprzednich eksperymentach z hodowlą 3D (Rysunek 6). Wynik ten może wynikać z braku potranslacyjnej modyfikacji mNGAL z E. coli, którą stosowano w poprzednich eksperymentach, które wymagały dużej dawki mNGAL w celu zahamowania powiększania się cyst (ryc. 6). W celu dalszego zbadania, czy potranslacyjna modyfikacja mNGAL jest czynnikiem odpowiedzialnym za zapotrzebowanie na więcej rekombinowanego mNGAL z E. coli, w dalszych badaniach zostanie zastosowana kondycjonowana pożywka zawierająca mNGAL wydzielany z mysiej linii komórkowej.

W niniejszym badaniu komórki pN + LS i pN - LS użyte do RT – qPCR, Western blot, ELISA, inkorporacji BrdU i hodowli 3D uzyskano z mieszanej puli poliklonalnej, która miała zróżnicowane poziomy ekspresji transgenu w mieszanej populacji. Identyfikacja mechanizmu mNGAL w komórkach ADPKD 2L3 opisanymi powyżej metodami z wykorzystaniem komórek klonalnych powinna pomóc w znalezieniu strategii przyszłego leczenia klinicznego ADPKD.

5. Wnioski

W tym badaniu zbadaliśmy podstawowy mechanizm zmniejszonej progresji torbieli w obecności NGAL, stosując unieśmiertelnioną linię komórkową ADPKD. Dodatek rekombinowanego mNGAL hamował proliferację komórek w komórkach ADPKD. Analiza patologiczna wykazała, że ​​mNGAL zmniejsza proliferację i indukuje szlaki apoptozy i autofagii w komórkach ADPKD. Ponadto stworzono platformę do hodowli komórek 3D w celu identyfikacji progresji cyst i wykazano, że dodatek rekombinowanego mNGAL hamuje powiększanie cyst. Co więcej, nadekspresja wydzielanego mNGAL (pN + LS) miała silniejszy wpływ na hamowanie powiększania się cyst w komórkach ADPKD niż niewydzielonego mNGAL (pN - LS), chociaż obie formy zmniejszały średnicę cysty, powierzchnię i odsetek cyst o dużych rozmiarach, jak również ich wpływ na proliferację, apoptozę i autofagię. Wnioskujemy, że wydzielany mNGAL ma bardziej wyraźną i stałą zdolność do hamowania powiększania torbieli niż niewydzielany mNGAL w komórkach ADPKD. Nasza praca może pomóc w określeniu strategii przyszłego leczenia klinicznego ADPKD.

Materiały dodatkowe: Filmy uzupełniające do tego artykułu można znaleźć w Internecie (1) Film S1: Budowa cysty w kulturze 3D: https://reurl.cc/Kjy8rq (dostęp: 26 listopada 2021 r.); (2) Film S2: Przekroje cysty w kształcie litery Z w hodowli 3D: https://reurl.cc/VXGY5y (dostęp: 26 listopada 2021 r.). Wykres uzupełniający: kontrole negatywne dla ryc. 1D (pomijając barwienie LTL i DBA) można znaleźć w Internecie pod adresem https://reurl.cc/LpMmje (dostęp: 26 listopada 2021 r.). Wkład autora: Konceptualizacja, W.-YJ, HMH-L. i Y.-YC; weryfikacja danych, H.-YC; analiza formalna, H.-YC; pozyskanie finansowania, HMH-L. i Y.-YC; metodologia, H.-YC, W.-YJ, EW, C.-MH, HMH-L. i Y.-YC; administracja projektami, H.-YC i HMH-L.; zasoby, W.-YJ, S.-TJ i Y.-YC; nadzór, HMH-L.; wizualizacja, H.-YC; pisanie-oryginalny projekt, H.-YC i HMH-L.; pisanie-recenzja i redakcja, H.-YC i HMH-L. Wszyscy autorzy przeczytali i zgodzili się na opublikowaną wersję manuskryptu. Finansowanie: Badanie zostało sfinansowane z grantów 107-2622-B-006-005-CC2 i 108-2622-B-006-002- CC2 z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST) oraz Centrali University Advancement z Narodowego Uniwersytetu Cheng Kung w Tainan, Tajwan (Yuan-Yow Chiou). Oświadczenie Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej: Nie dotyczy. Oświadczenie o świadomej zgodzie: Nie dotyczy. Oświadczenie o dostępności danych: Dane wygenerowane podczas badania są dostępne na żądanie u odpowiedniego autora. Podziękowania: Autorzy są wdzięczni za pomoc Centrum Obrazowania Molekularnego Narodowego Tajwańskiego Uniwersytetu Normalnego pod auspicjami MOST. Dziękujemy Narodowemu Centrum RNAi Core Facility w Academia Sinica na Tajwanie za dostarczenie cząstek wirusa, plazmidów i powiązanych usług. Dziękujemy Shu-Wen Lo za pomoc przy edycji grafiki. Konflikt interesów: Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Referencje

1. Bergmann, C.; Guay-Woodford, LM; Harrisa, PC; Horie, S.; Peters, DJ; Torres, VE Wielotorbielowatość nerek. Nat. Wielebny Dis. Elementarze 2018, 4, 50. [CrossRef] [PubMed]

2. Grantham, JJ Praktyka kliniczna. Autosomalna dominująca wielotorbielowatość nerek. N.angl. J. Med. 2008, 359, 1477–1485. [CrossRef] [PubMed]

3. Chapman, AB; Devuyst, O.; Eckardt, K.-U.; Gansevoort, Republika Południowej Afryki; Harris, T.; Horie, S.; Kasiske, BL; Odland, D.; Pei, Y.; Perrone, Dakota; i in. Autosomalnie dominująca wielotorbielowatość nerek (ADPKD): Podsumowanie konferencji dotyczącej kontrowersji dotyczącej choroby nerek: poprawa globalnych wyników (KDIGO). Nerka Int. 2015, 88, 17–27. [CrossRef] [PubMed]

4. Grantham, JJ; Mulamalla, S.; Swenson-Fields, KI Dlaczego nerki nie działają w autosomalnej dominującej wielotorbielowatości nerek. Nat. Wielebny Nephrol. 2011, 7, 556–566. [CrossRef] [PubMed]

5. Harris, PC; Torres, VE Mechanizmy genetyczne i szlaki sygnałowe w autosomalnej dominującej policystycznej chorobie nerek. J. Clin. Badanie. 2014, 124, 2315–2324. [CrossRef] [PubMed]

6. Ong, AC; Harris, PC Policystynocentryczne spojrzenie na powstawanie cyst i choroby: ponowne spojrzenie na policystyny. Nerka Int. 2015, 88, 699–710. [Odniesienie]

7. Weimbs, T. Sygnalizacja trzeciego trafienia w tworzeniu torbieli nerek. J. Am. Towarzystwo Nefrol. 2011, 22, 793–795. [Odniesienie]

8. Hanaoka, K.; Guggino, WB cAMP reguluje proliferację komórek i tworzenie cyst w komórkach autosomalnej wielotorbielowatości nerek. J. Am. Towarzystwo Nefrol. 2000, 11, 1179–1187. [Odniesienie]

9. Starremans, P.; Li, X.; Finnerty, P.; Guo, L.; Takakura, A.; Neilson, E.; Zhou, J. Mysi model policystycznej choroby nerek poprzez somatyczną delecję w ramce na końcu 5 'Pkd1. Nerka Int. 2008, 73, 1394–1405. [Odniesienie]

10. Yamaguchi, T.; Nagao, S.; Wallace, DP; Belibi, Floryda; Cowley, BD; Pelling, JC; Grantham, JJ Cyclic AMP aktywuje B-Raf i ERK w komórkach nabłonka cyst z policystycznych nerek autosomalnie dominujących. Nerka Int. 2003, 63, 1983–1994. [Odniesienie]

11. YamaguchiJill, T.; Pelling, JC; Ramaswamy, Nowy Meksyk; Eppler, JW; Wallace, DP; Nagao, S.; Rzym, Los Angeles; Sullivan, Los Angeles; Grantham, JJ cAMP stymuluje proliferację in vitro komórek nabłonkowych torbieli nerkowych poprzez aktywację szlaku kinazy regulowanego sygnałem zewnątrzkomórkowym. Nerka Int. 2000, 57, 1460–1471. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhu, P.; Sieben, CJ; Xu, X.; Harrisa, PC; Lin, X. Aktywatory autofagii hamują cystogenezę w autosomalnym dominującym modelu policystycznej choroby nerek. Szum. Mol. Geneta. 2016, 26, 158–172. [CrossRef] [PubMed]

13. Belibi, F.; Zafar, I.; Ravichandran, K.; Segvic, AB; Jani, A.; Ljubanovic, DG; Edelstein, CL Czynnik indukowany hipoksją-1 (HIF-1 ) i autofagia w wielotorbielowatości nerek (PKD). Jestem. J. Fizjol.-Ren. Fizjol. 2011, 300, F1235 – F1243. [CrossRef] [PubMed]

14. Chun, Y.; Kim, J. Autophagy: niezbędny program degradacji homeostazy i życia komórkowego. Komórki 2018, 7, 278. [CrossRef]

15. Rubinsztein, DC; Szpilka, T.; Elazar, Z. Mechanizmy biogenezy autofagosomów. Aktualny Biol. 2012, 22, R29–R34. [Odniesienie]

16. Mukhopadhyay, S.; Panda, PK; Sinha, N.; Das, DN; Bhutia, SK Autofagia i apoptoza: gdzie się spotykają? Apoptoza 2014, 19, 555–566. [Odniesienie]