Sidt2 jest kluczowym białkiem na szlaku degradacji autofagii-lizosomalnej i jest niezbędne do utrzymania struktury nerek i funkcji filtracji
Nov 07, 2023
Regulacja i homeostaza autofagii są niezbędne do utrzymania morfologii i funkcji narządów. Jako białko błony lizosomalnej, efektSidt2NAstruktura nerekIautofagia nerekjest nadal nieznany. W tym badaniu odkryliśmy, że nerkiSidt2−/−myszy wykazały zmiany w pogrubieniu błony podstawnej, fuzji wyrostków stóp i obrzęku mitochondriów, co sugeruje, żestruktura nerek została uszkodzona. Zwiększone stężenie białka w moczu po 24 godzinach wskazuje, że:funkcja nerkirównież został uszkodzony. Jednocześnie brakSidt2spowodował zmniejszenie liczby kwaśnych lizosomów, zmniejszenie aktywności i ekspresji kwaśnej hydrolazy w lizosomie oraz wzrost pH w lizosomie, co sugeruje, że funkcja lizosomu została upośledzona poSidt2usunięcie. Nagromadzenie autofagolizosomów, zwiększone poziomy białek LC3-II i P62 oraz obniżone poziomy mRNA P62 wskazują, że brakSidt2gen spowodował nieprawidłowy szlak autofagiifloch. Eksperyment z chlorochiną, odpornośćflautofagosom fluorescencji, test fuzji lizosomów i Ad-mcherry-GFP-LC3B ponadto wykazały, że poSidt2delecji, produkcja autofagosomów nie wzrosła, ale upośledzona została fuzja autofagosomów i lizosomów oraz degradacja autofagolizosomów. Podczas inkubacjiSidt2−/−komórkach za pomocą rapamycyny, aktywatora autofagii, odkryliśmy, że może ona aktywować autofagię, co objawia się wzrostem liczby autofagosomów, ale nie może poprawić degradacji autofagolizosomów. Tymczasem dodatkowo pokazało, żeSidt2gen odgrywa ważną rolę w prawidłowym przebiegu procesów autofagolizosomalnych. Reasumując, brakSidt2Gen spowodował upośledzenie funkcji lizosomów i zmniejszenie liczby lizosomów kwaśnych, co doprowadziło do zaburzeń tworzenia i degradacji autofagolizosomów, co ostatecznie objawiało się jakonieprawidłowa budowa i czynność nerek. Sidt2jest niezbędny do utrzymania prawidłowego funkcjonowania lizosomów i fizjologicznej stabilności nerek.
WSTĘP
Tradycyjny pogląd jest taki, że lizosomy to komórki służące do usuwania odpadów wytwarzanych przez komórki [1–3]. Jednak wiele badań wykazało, że rola lizosomów jest znacznie bardziej złożona i może obejmować przekazywanie sygnału komórkowego, powstawanie nowotworów, rozwój i inne aspekty wpływające na aktywność życiową organizmu [4–10]. Lizosomy są zwykle wzbogacone w tkanki takie jak wątroba i nerki [11]. Dlatego też dysfunkcja lizosomów jest ściśle powiązana z chorobami tkanek wątroby i nerek, takimi jak choroba Gauchera [12], mukopolisacharydoza [13], choroba Niemanna-Picka [14], opóźnione stwardnienie kłębuszków nerkowych [15], idiopatyczna nefropatia błoniasta [16] itp. Białka błony lizosomalnej (LMP) to składniki błony, których funkcją jest nie tylko utrzymanie integralności lizosomu, ale które są również zaangażowane w różne aspekty, takie jak wewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnału i regulacja, które są niezbędne do utrzymania funkcji lizosomu i czynności związane z życiem komórkowym [17–19].
Do chwili obecnej odkryto ponad 100 LMP, jednak funkcje większości z nich są wciąż nieznane [20]. Transbłonowy członek nadrodziny 7 1 (TM7SF1) jest niezbędny do utrzymania funkcji podocytów nerek [21] i odgrywa ważną rolę w procesie rozwoju nerek [22]. Kanał 5 bramkowany napięciem chlorkowym (ClC-5) to kanał jonów chlorkowych (Cl(-)) występujący w kanalikach nerkowych, który jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania kanalików nerkowych [23]; gdy jest zmutowany, może powodować chorobę Denta [24]. Nadekspresja kanału 7 bramkowanego napięciem chlorku (ClC-7) zapobiega apoptozie komórek nabłonka kanalików nerkowych spowodowanej zaburzeniami stanu redoks [25]. Badania te pokazują, że jako składniki tkanki nerkowej wzbogaconej w lizosomy, LMP są niezbędne do utrzymania prawidłowego funkcjonowania, ale specyficzny mechanizm ich patogeniczności jest nadal niejasny.
Rodzina transbłonowa SID1, członek 2 (Sidt2) to nowo odkryta LMP, która ulega silnej ekspresji w tkankach wątroby i nerek [26]. Wcześniejsze badania wykazały, że delecja Sidt2 może powodować choroby wątroby objawiające się stłuszczeniem wątroby i zaburzeniami metabolizmu lipidów w wątrobie [11, 18]. W niedawnym badaniu odkryliśmy, że nerki myszy Sidt2−/− również uległy uszkodzeniu, ale konkretny mechanizm jest niejasny. Lizosomy są ważnymi organami wykonawczymi autofagii [10]. Czy w grę wchodzi regulacja autofagii? W tym badaniu zbadaliśmy korelację między funkcją lizosomów (autofagią) a chorobą i zbadaliśmy podstawowy mechanizm obejmujący Sidt2, który powoduje uszkodzenie nerek, co będzie bardzo pomocne w badaniu korelacji między LMP a chorobą.
WYNIKI
Pokazuje to model Sidt2−/−uszkodzenie nerekwiąże się z akumulacją autofagolizosomów
Metodę konstruowania myszy Sidt2-/- pokazano na ryc. 1A. Otrzymany homozygotyczny DNA z ogona myszy poddano sekwencjonowaniu, a wynik sekwencjonowania był jednomodalny (ryc. 1B), a w drugim eksonie nastąpiła utrata fragmentu o długości 199 bp. Dzięki identyfikacji genotypu PCR odkryliśmy, że myszy Sidt2+/+(Wild Type, WT) miały segmenty DNA o długości 685 bp, podczas gdy myszy Sidt2−/− miały segmenty DNA o długości 486 bp (ryc. 1C). Jak pokazano na ryc. 1D, białko Sidt2 było prawie niemożliwe do wykrycia u myszy Sidt2-/- niż w WT, co sugerowało, że model został pomyślnie skonstruowany. W badaniu moczu stwierdzono, że stężenie białka w moczu w ciągu 24 godzin było znacząco zwiększone u myszy Sidt2-/- w porównaniu z WT (ryc. 1E), co sugeruje, że bariera filtracyjna nerek została upośledzona po usunięciu Sidt2. Obserwacje transmisyjnej mikroskopii elektronowej (ryc. 1F) wykazały, że w porównaniu z myszami WT (a – f), nerki myszy Sidt2-/- wykazywały rozproszone połączenie wyrostków stopy, pogrubienie błony podstawnej kłębuszków (g, h), nabłonek kanalików nerkowych obrzęk komórek, uszkodzenie mikrokosmków (i, j), obrzęk mitochondriów, zmiany wakuolowe i zanik kolców (k, l). Co ciekawe, myszy Sidt2-/- wykazywały również dużą liczbę nagromadzeń autofagolizosomów (pokazanych czerwonymi strzałkami, m, n), a liczba ta była znacznie wyższa niż w grupie kontrolnej (ryc. 1G). Na poziomie komórkowym odkryliśmy, że Sidt2 jest również niezbędny do przeżycia komórek nerek. Delecja genu Sidt2 powoduje zmniejszoną proliferację i zwiększoną apoptozę komórek MPC5 i SV40 MES 13 (rysunek uzupełniający 1).
Delecja genu Sidt2 prowadzi do zmian w liczbie i funkcji kwaśnych lizosomów w komórkach nerki myszy
Do wybicia genu Sidt2 w komórkach MPC5 i SV40 MES 13 w celu uzyskania modeli komórkowych wykorzystano technologię Crispr-Cas9. Weryfikację poziomu mRNA i białka (ryc. 2A – C) przeprowadzono odpowiednio za pomocą qRT PCR i Western blot, co pokazuje, że modele zostały pomyślnie skonstruowane. System degradacji za pośrednictwem lizosomów jest kluczowym etapem degradacji autofagii. Czy jako niezbędny LMP, nokaut Sidt2 wpłynie na ekspresję białek związanych z lizosomami? Zmierzyliśmy główne białko błonowe 1 związane z lizosomami LMP (LAMP1). Wyniki pokazały, że ekspresja LAMP1 spadła po delecji Sidt2 w komórkach MPC5 i SV40 MES 13 (ryc. 2D, E). Następnie wykorzystaliśmy LysoTracker do oznakowania kwaśnych lizosomów i odkryliśmy, że liczba kwaśnych lizosomów spadła po delecji Sidt2 w obu typach komórek (ryc. 2F, G). Następnie zmierzyliśmy lizosomalną katepsynę B (CTSB) i odkryliśmy, że w tkance nerek myszy (ryc. 2H, I), komórkach MPC5 (ryc. 2J, K) i komórkach SV40 MES 13 (ryc. 2L, M) wyrażenia wszystkie CTSB w modelach Sidt2-/- uległy zmniejszeniu, co wskazuje, że aktywność enzymu proteolitycznego w lizosomach spadła po usunięciu genu Sidt2. Podobnie ekspresja prekursora CTSB w dwóch typach komórek grupy Sidt2-/- została znacznie zmniejszona, co wskazuje, że delecja Sidt2 miała również wpływ na CTSB. Następnie wykorzystaliśmy LysoSensor do wykrycia kwaśnego środowiska lizosomów. Im niższy stosunek intensywności fluorescencji, tym wyższa wartość pH w lizosomie. Wyniki wykazały, że po delecji Sidt2 wartość pH wzrosła (ryc. 2N, O), a zakwaszenie było nieprawidłowe. Aby dokładniej zbadać, czy powyższe nieprawidłowości lizosomalne wynikały z nieprawidłowej liczby lizosomów lub nieprawidłowych funkcji lizosomów, zbadaliśmy komórki za pomocą mikroskopii elektronowej (ryc. 2P). Odkryliśmy, że nie ma oczywistych zmian w liczbie pierwotnych lizosomów i całkowitej liczbie lizosomów (w tym pierwotnych i wtórnych lizosomów) po delecji Sidt2 (ryc. 2Q).
Szlak autofagii nerek jest nieprawidłowy po usunięciu Sidt2
Jak wspomniano powyżej, w komórkach nerek myszy Sidt2-/- zaobserwowano dużą liczbę nagromadzeń autofagolizosomów, co sugeruje, że szlak autofagii jest nieprawidłowy. Za pomocą analizy Western blot wykazano znaczny wzrost poziomu białka koniugatu LC3-fosfatydyloetanoloaminy (LC3-II) i sekwestosomu 1(P62) w nerce Sidt2−/− myszy oraz wzrost ekspresji białek związanych z autofagią 5 (Atg5), związanych z autofagią 7 (Atg7) i 12 związanych z autofagią (Atg12) (ryc. 3A, B). Jednakże poziom mRNA P62 był znacznie obniżony (ryc. 3C), co sugeruje, że szlak autofagii był nieprawidłowy po eliminacji Sidt2 in vivo. Następnie odkryliśmy, że ekspresja białek autofagii LC3-II, P62, Atg5, Atg7 i Atg12 również wzrosła (ryc. 3D – G) w dwóch typach komórek nerek po delecji Sidt2, co było spójne z in vivo. Wzrost LC3-II wskazuje na wzrost liczby autofagosomów w komórkach nerek po delecji Sidt2, co może być spowodowane aktywacją autofagii lub zablokowaną degradacją autofagosomów. Immunofluorescencja P62 (ryc. 3H) wyraźnie wykazała wzrost zawartości P62 w komórkach Sidt2−/− (ryc. 3I). W przeciwieństwie do poziomu białka, qRT-PCR wykazało, że P62 znacząco spadło na poziomie mRNA (ryc. 3J), co wskazuje, że wzrost P62 był związany z niewystarczającą degradacją. Wzrosty Atg5, Atg7 i Atg12 wskazywały, że autofagia rozpoczęła się i uformowała normalnie, ale akumulacja P62 sugerowała również przeszkody w procesie autofagii, a ta sprzeczność wymagała od nas dalszego badania prawdziwej sytuacji przepływu autofagii.
In vitro zastosowanie chlorochiny wskazuje na zmniejszony strumień autofagii po utracie Sidt2. Eksperyment z chlorochiną jest jednym z klasycznych eksperymentów służących do obserwacji strumienia autofagii. Aby zrozumieć przyczyny wzrostu LC3-II i P62 po delecji Sidt2, zastosowaliśmy chlorochinę (CQ), dalszy inhibitor autofagii, aby oddziaływać na komórki i obserwować przepływ autofagii. Najpierw zastosowaliśmy różne gradienty stężeń, aby potwierdzić, że stężenie nasycenia hamowane przez CQ wynosiło 50 µM (ryc. 4A – F) w komórkach MPC5 i SV40 MES 13. Oprócz tego stężenia, gdy stężenie CQ w dalszym ciągu rosło, LC3-II i P62 nie rosły dalej, aby osiągnąć nasycenie. Dlatego zastosowaliśmy stymulację 50 μM CQ przez 16 godzin, aby całkowicie zahamować przepływ autofagii i w tym czasie różnice LC3-II między grupą Sidt2+/+ a grupą Sidt2−/− zniknęły w ogniwa MPC5 i SV40 MES 13. Podobnie, po przetworzeniu 50 μM CQ, różnice P62 spowodowane delecją Sidt2 również zniknęły (ryc. 4G, H, J, K). Statystyki dotyczące przepływu autofagii pokazały, że zmniejszył się on, gdy brakowało Sidt2 (ryc. 4I, L), co dodatkowo potwierdziło, że wzrost ekspresji LC3-II i P62 po delecji Sidt2 był spowodowany niepowodzeniem usuwania autofagii a nie wzrost poziomu autofagii (aktywacja autofagii).
Zakłócenie fuzji autofagosom-lizosom in vitro po delecji Sidt2 Usuwanie i degradacja to środkowe i późne etapy procesu autofagii, obejmujące fuzję autofagosomu ze spadkiem po delecji Sidt2 (ryc. 5D), co wskazuje, że fuzja autofagosomy i lizosomy są upośledzone.
Ryc. 1Uszkodzenie nereki akumulacja autofagolizosomu u myszy Sidt2-/-. Schemat celowania genowego systemu Cre-LoxP; B powyżej to wyeksportowany diagram sekwencji DNA ogona myszy z nokautem genu Sidt2; poniżej znajduje się mapa sekwencjonowania, strzałka wskazuje lokalizację brakującego genu. W porównaniu z myszami WT, w eksonie 2 występuje utrata genu o długości 199 pz; C Weryfikacja poziomu DNA Sidt2 (wyekstrahowanego z tkanki ogona). Amplifikowany starter zawiera region z nokautem zasad, pokazany jako Sidt2+ /+(WT), Sidt2+/− lub Sidt2−/−; weryfikacja poziomu białka D w celu wykrycia poziomów ekspresji białka Sidt2 metodą Western blot; Białko E nerki z 24-godzinnego moczu u myszy WT i Sidt2-/-; F ultramikromorfologiczna struktura nerek myszy WT (a, f) i myszy Sidt2 -/- (g – n). W porównaniu z myszą WT, nerka myszy Sidt2-/- wykazuje fuzję wyrostków stóp, pogrubienie błony podstawnej (g, h), obrzęk komórek nabłonka kanalików nerkowych, uszkodzenie mikrokosmków (i, j), zniszczenie mitochondriów (k, l) i akumulacja autofagolizosomów (m, n); G całkowita liczba autofagolizosomów nerkowych u myszy WT i Sidt2-/-. *P < 0.05, **P < 0,01.
Ryc. 3 Delecja Sidt2 zakłóca szlak autofagii. Wykrywanie poziomów ekspresji białek związanych z autofagią komórek WT i Sidt2-/- metodą Western blot; B wykresy statystyczne wyników testu Western blot; C Poziom ekspresji mRNA P62 w tkankach nerek myszy WT i Sidt2-/-; Poziomy ekspresji D białek szlaku autofagii komórek MPC5 przed i po nokaucie Sidt2; E wykres statystyczny wykresu (D); Poziomy ekspresji F białek szlaku autofagii w komórkach SV40 MES 13 przed i po nokaucie Sidt2; G wykres statystyczny wykresu (F); Immunofluorescencja H P62 w komórkach MPC5 i SV40 MES 13 przed i po nokaucie Sidt2; I wykresy statystyczne wyników immunofluorescencji; Poziomy ekspresji mRNA J P62 w komórkach MPC5 i SV40 MES 13 przed i po nokaucie Sidt2. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
Ad-mCherry-GFP-
Podwójne znakowanie fluorescencyjne LC3B sugeruje, że tworzenie autofagolizosomu i szlak jego degradacji zostały zablokowane po delecji Sidt2. Eksperyment transfekcji Ad-mCherry-GFP-LC3B można wykorzystać do wykrycia zmian w dynamicznym strumieniu autofagii w komórkach. Podczas procesu autofagii mCherry-GFP-LC3B gromadzi się na błonie autofagosomu i objawia się w postaci żółtych plam pod mikroskopem fluorescencyjnym. Kiedy autofagosomy i lizosomy łączą się, tworząc autofagolizosomy, kwaśne środowisko w lizosomie tłumi fluorescencję GFP, co objawia się w postaci czerwonych plam. Dlatego GFP związany z LC3 można wykorzystać jedynie do wykrywania autofagosomów, podczas gdy mCherry może jednocześnie wykrywać autofagosomy i autofagolizosomy. Kiedy zielone i czerwone plamki fluorescencyjne zostaną połączone i wyświetlone jako żółte plamki fluorescencyjne, odpowiada to autofagosomom. W tym czasie czerwona fluorescencja może wskazywać na autofagolizosom, ale może również wskazywać na gładkość tworzenia autofagolizosomu [27]. Komórki MPC5 i komórki SV40 MES 13 w obu grupach Sidt2+/+ i Sidt2−/− transfekowano adenowirusem Ad-mCherry GFP-LC3B i fotografowano za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego (ryc. 6A). Stwierdzono, że po delecji Sidt2 liczba żółtych kropek fluorescencyjnych wzrosła, a liczba czerwonych kropek fluorescencyjnych spadła (ryc. 6B, C), co wykazało, że w grupie Sidt2-/- wzrosła liczba autofagosomów, a autofagolizosomów spadła. Dzieje się tak dlatego, że istniały przeszkody w tworzeniu autofagolizosomu, a szlaki degradacji autofagolizosomu zostały zablokowane, co doprowadziło do przeszkód w degradacji autofagolizosomu.
Rapamycyna nie poprawiła akumulacji P62 spowodowanej delecją Sidt2, ale raczej ją zaostrzyła. Rapamycyna (RAPA) jest inhibitorem mTOR i aktywuje autofagię. Kiedy RAPA działała na komórki MPC5 i SV40 MES 13 z grup Sidt2+/+ i Sidt2−/−, zwiększała ilość LC3-II w obu grupach. Oznaczało to, że RAPA może aktywować wcześniejszy szlak autofagii. Podobnie odkryliśmy, że wzrost poziomu LC3-II w grupie Sidt2−/− z RAPA był bardziej oczywisty niż w grupie kontrolnej (grupa Sidt2+/+), co pokazuje, że gdy RAPA zadziałała w grupie Sidt2 −/− degradacja autofagosomów nadal nie uległa poprawie. W międzyczasie zaobserwowaliśmy również zmiany w P62 i odkryliśmy, że gdy RAPA działała na grupę Sidt2+/+ komórek MPC5 i SV40 MES 13, P62 nie zmienił się znacząco, co wskazuje, że strumień autofagii był normalny. Gdy RAPA działała na grupę Sidt2-/-, poziom ekspresji P62 był jeszcze bardziej zwiększony w porównaniu z poziomem przed podaniem i był również bardziej oczywisty niż w grupie kontrolnej po leczeniu RAPA (ryc. 7A, B, D, E). Następnie, w celu zbadania przyczyn niespójnej ekspresji białka P62 po leczeniu RAPA grupy Sidt2+}/+ i Sidt2−/−, zmierzyliśmy poziomy mRNA P62 i stwierdziliśmy, że poziom ten wzrósł po leczeniu RAPA zarówno w grupie Sidt2+/+, jak i Sidt2−/−, przy czym w grupie Sidt2+/+ poziom był wyższy niż w grupie Sidt2−/− (ryc. 7C , F), co mogłoby dodatkowo świadczyć o tym, że przepływ autofagii był płynny w grupie Sidt2+/+, podczas gdy zaburzenie przepływu autofagii wystąpiło pod koniec autofagii w grupie Sidt2−/−, czyli degradacja autofagolizosomów połączyć. Zbadaliśmy również wpływ Sidt2 na proliferację i apoptozę komórek nerek w warunkach aktywowanej autofagii i odkryliśmy, że po aktywacji autofagii komórek indukowanej pożywką bez surowicy, w porównaniu z grupą kontrolną, proliferacja Sidt2-/- grupa została dodatkowo zahamowana, a apoptoza była bardziej oczywista (rysunek uzupełniający 2).
Ryc. 5 Po delecji Sidt2 zapobiega się fuzji autofagosomu i lizosomu. Kolokalizacja immunofluorescencyjna LC3B i LAMP1 w komórkach MPC5 i SV40 MES 13 przed i po nokaucie Sidt2, analiza ze współczynnikiem korelacji Pearsona; B porównanie punktów fluorescencji LC3B przed i po nokaucie Sidt2 w komórkach MPC5 i SV40 MES 13; Porównanie C współczynnika korelacji Pearsona przed i po nokaucie Sidt2 w komórkach MPC5 i SV40 MES 13; D porównanie szybkości fuzji przed i po nokaucie Sidt2 w komórkach MPC5 i SV40 MES 13 (stosunek liczby kolokalizowanych plam fluorescencyjnych LAMP1 i LC3B do liczby plam fluorescencyjnych LAMP1); *P < 0,05, **P < 0,01.
Wsparcie dla Wecistanche – największego eksportera Cistanche w Chinach:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kup więcej szczegółów specyfikacji:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
