Roztwór UW uzupełniony tiosiarczanem sodu chroni przeszczepy nerki przed długotrwałym urazem niedokrwienno-reperfuzyjnym w mysim modelu syngenicznej transplantacji nerki

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang i inni

Cistanche tubulosa zapobieganerkachoroby, kliknij tutaj, aby uzyskać dostęp doprodukty i Cistanche Nz

ABSTRAKCYJNY

Wstęp:Zimne uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) jest nieuniknionym zdarzeniem, które nasila powikłania po transplantacji. Wcześniej wykazaliśmy, że suplementacja roztworu University of Wisconsin (UW) cząsteczkami donorów siarkowodoru (H2S) niezatwierdzonymi przez FDA minimalizuje zimne IRI i poprawia funkcję przeszczepu nerki po przeszczepie. Niniejsze badanie sprawdza, czy zatwierdzona przez FDA cząsteczka donorowa H2S, tiosiarczan sodu (STS), będzie miała taki sam lub lepszy efekt w klinicznie istotnym szczurzym modelu syngenicznego ortotopunerkaprzeszczep.

Metoda:Trzydzieści szczurów Lewisa przeszło obustronną nefrektomię, a następnie syngeniczny ortotopowy przeszczep lewegonerkapo 24-godzinie przechowywania w roztworze UW lub UW plus STS w temperaturze 4 ◦C. Szczury monitorowano do 14 dnia po przeszczepie i uśmiercano w celu oceny czynności nerek (wydzielanie moczu, kreatynina w surowicy i azot mocznikowy we krwi).Nerkaskrawki barwiono H&E, TUNEL, CD68 i mieloperoksydazą (MPO) w celu wykrycia ostrej martwicy kanalików (ATN), apoptozy, nacieku makrofagów i nacieku neutrofili.

Wynik:Przeszczepy UW plus STS wykazały znaczną poprawę funkcji przeszczepu bezpośrednio po przeszczepie, z lepszym przeżyciem biorców w porównaniu z przeszczepami UW (p < {{0}},05).="" badanie="" histopatologiczne="" wykazało="" istotnie="" zmniejszoną="" atn,="" apoptozę,="" naciek="" makrofagów="" i="" neutrofili="" oraz="" regulację="" w="" dół="" genów="" prozapalnych="" i="" proapoptotycznych="" w="" przeszczepach="" uw="" plus="" sts="" w="" porównaniu="" z="" przeszczepami="" uw="" (p=""><>

Wniosek:Po raz pierwszy pokazujemy, że konserwacja przeszczepów nerkowych w roztworze UW uzupełnionym STS chroni przed przedłużonym zimnym IRI poprzez hamowanie szlaków apoptotycznych i zapalnych, a tym samym poprawiając funkcję przeszczepu i przedłużając przeżycie biorcy. Może to stanowić nowatorską strategię terapeutyczną mającą zastosowanie klinicznie w celu zminimalizowania szkodliwego wyniku klinicznego przedłużonej zimnej IRI w przypadku:nerkaprzeszczep.

Słowa kluczowe:Tiosiarczan sodu (STS) Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) Statyczne przechowywanie (SCS)Nerkaprzeszczep Przeżycie przeszczepu i biorcy

1. Wstęp

Nerkatransplantacja jest optymalnym leczeniem schyłkowej fazynerkanerkowychoroba (ESRD). W porównaniu do dializy,nerkaprzeszczep jest lepszy, ponieważ zapewnia lepszą jakość życia i zapewnia znaczną korzyść w zakresie przeżycia, a także jego opłacalność [1–3]. Jednak pobranie nerek dawcy jest nieodłącznie związane z uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym (IRI), nieuniknioną konsekwencją ustania i późniejszego przywrócenia przepływu krwi podczas przeszczepu [4]. Obecną strategią łagodzenia IRI wywołanej przeszczepem jest statyczne przechowywanie w chłodni (SCS) przeszczepów nerki w standardowych roztworach konserwujących, takich jak roztwór University of Wisconsin (UW) na lodzie w temperaturze 4 ◦C w okresie przed przeszczepem [5]. Wykazano jednak, że przedłużone SCS wiąże się ze zwiększoną śmiercią komórek, stanem zapalnym i innymi szkodliwymi zdarzeniami komórkowymi i molekularnymi, które ostatecznie prowadzą do zwiększonej częstości występowania opóźnionej funkcji przeszczepu (DGF), ostrej martwicy kanalików (ATN) i zmniejszenia przeszczepu. przeżycie [6–10]. Ponadto, aby nadążyć za globalnie rosnącą częstością występowania ESRD i stale rosnącą liczbą pacjentów na listach oczekujących na przeszczep, wiele ośrodków transplantacyjnych akceptuje przeszczepy nerki z przedłużonymi okresami zimnego niedokrwienia, co dodatkowo przyczynia się do ogólnego uszkodzenia tkanek. Po SCS następuje reperfuzja, w której do zimnego przeszczepu niedokrwiennego powraca ciepła, natleniona krew. Reperfuzja, będąca fazą efektorową uszkodzenia niedokrwiennego, charakteryzuje się zwiększonym uszkodzeniem tkanek [11–13].

Potencjalna strategia terapeutyczna mająca na celu ograniczenie zimnej IRI podczasnerkatransplantacja obejmuje uzupełnienie standardowego roztworu konserwującego siarkowodorem (H2S), endogennie wytwarzanym gazoprzekaźnikiem, który, jak wykazano, odgrywa ważną rolę fizjologiczną w rozszerzaniu naczyń i sygnalizacji komórkowej [14-16]. Wcześniej wykazaliśmy, że przedłużone SCS w roztworze UW uzupełnionym H2S zmniejsza IRI wywołaną przeszczepem na zimno i poprawia przeżycie przeszczepu w mysich modelach syngenicznego i allogenicznego przeszczepu nerki [17–19, 41, 42]. Jednak cząsteczki donorowe H2S stosowane w tych badaniach nie są żywotne klinicznie. Doprowadziło to do rozważenia zastosowania tiosiarczanu sodu (STS), leku będącego dawcą H2S, zatwierdzonego przez Food and Drug Administration (FDA) do leczenia kalcyfilaksji u pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek, toksyczności indukowanej cisplatyną w leczeniu raka oraz jako antidotum na zatrucie cyjankami [20–23]. Ostatnie badania wykazały, że STS wykazuje działanie ochronne w zwierzęcych modelach IRI [24–26]. Jednak jego wpływ na IRI zimnej nerki wywołanej przeszczepem nie jest znany. Dlatego niniejsze badanie bada działanie ochronne na nerki STS w modelu in vitro IRI nerki i szczurzym modelu syngenicznego ortotopowego przeszczepu nerki.

2. Materiały i metody

2.1. Protokół eksperymentalny in vitro

Do oceny ochronnego wpływu STS podczas nerkowej IRI zastosowano model in vitro zimnej hipoksji i urazu reoksygenacji na ciepło, który naśladuje warunki komórkowe podczas zimnej IRI in vivo. Komórki nabłonkowe nerki szczura (linia komórkowa NRK{{0}}E; ATCC, USA) zostały użyte w eksperymentach in vitro, ponieważ komórki te są podatne na uszkodzenie niedokrwienne [27], a ich zastosowanie jest zgodne ze szczurami model transplantacji wykorzystany w drugim celu tego badania. Komórki hodowano w Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zawierającym 10 procent płodowej surowicy bydlęcej (FBS) inaktywowanej przez ogrzewanie w 60◦C przez 20 min i 1 procent penicyliny/streptomycyny (P/S). Komórki inkubowano w normalnych warunkach wzrostu 37°C, 21% O2 i 5% CO2. Komórki kontrolne były w warunkach identycznych jak dla komórek przedeksperymentalnych. Komórki doświadczalne traktowano albo pożywką wolną od surowicy (SF), SF plus 200 nM AP39, albo SF o różnych stężeniach (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) pentahydratu tiosiarczanu sodu (STS), które otrzymano z 250 mg/ml roztwór STS do wstrzykiwań (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanada]). Zastosowano stężenie 200 nM AP39, ponieważ wcześniej wykazaliśmy, że AP39 w tym stężeniu działa cytoochronnie przeciwko tej samej linii komórkowej w podobnym modelu zimnej IRI [20]. Komórki następnie inkubowano w temperaturze 10◦C przez 24 godziny w warunkach hipoksji (5 procent CO2, 0,5 procent O2, 95 procent N2) w komorze hipoksji HypOxystation H85 (HYPO2YGEN, USA) w celu wywołania zimnego urazu niedokrwiennego. Zastosowano temperaturę hipotermiczną 10 ◦C, ponieważ była to najniższa temperatura, jaką można było osiągnąć technologicznie przy zachowaniu 0,5% poziomu niedotlenienia O2. Po niedotlenieniu pożywkę zawierającą komórki doświadczalne zastąpiono pożywką kontrolną, a komórki ponownie natleniono poprzez inkubację w normalnych warunkach wzrostu (37◦C, 21% O2 i 5% CO2) przez 24 godziny w celu symulacji reperfuzji i związanego z nią uszkodzenia. Po 24-godzinnej reoksygenacji żywotność komórek oceniano poprzez barwienie komórek aneksyną V sprzężoną z FITC (FITC-Annexin-V; BioLegend, USA) i 7-aminoaktynomycyną D (7-AAD; BioLegend, USA) ), który mierzy odpowiednio apoptozę i martwicę komórek. Komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu CytoFLEX S (Beckman Coulter, USA). FlowJo wersja 11 (FlowJo LLC, USA) została wykorzystana do odpowiedniego bramkowania danych do analizy statystycznej.

2.2. Zwierzęta eksperymentalne

Trzydzieści samców szczurów Lewis o wadze 275-300 gi zakupionych od Charles River (St. Constant, QC, Kanada) trzymano w ośrodku Animal Care and Veterinary Services na Western University (Londyn, ON) w standardowych warunkach. Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Western University Council on Animal Care and Animal Use z protokołem ID 2018-155.

2.3. Model przeszczepu nerki

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >utrata masy ciała o 20 procent) lub śmierć. Humanitarne punkty końcowe sprawdzano dwa razy dziennie, a wszystkie szczury uśmiercano przez wystawienie na działanie CO2 w komorze przy natężeniu przepływu 40%. W czasie eutanazji nie było żadnych komplikacji chirurgicznych, które mogłyby spowodować różnice w wynikach.

2.4. Analiza czynności nerek

Po przeszczepieniu nerki szczury monitorowano w klatkach metabolicznych przez 14 dni, a następnie uśmiercano. Próbki krwi i moczu zebrano na POD 3, 5, 7, 10 i 14 w celu określenia parametrów czynności nerek (kreatynina w surowicy, azot mocznikowy we krwi [BUN], osmolalność moczu i wydalanie moczu). BUN i kreatynina w surowicy pochodziły od biorców przeszczepu nerki, a szczury poddane operacji pozorowanej zmierzono przy użyciu analizatora chemicznego IDEXX Catalyst One (Markham, ON). Poziomy osmolalności moczu określano za pomocą osmometrii temperatury zamarzania przy użyciu urządzenia 3320 Osmometer (Advanced Instruments, Norwood, MA) i porównywano ze standardami dostarczonymi przez firmę.

2.5. Analiza histopatologiczna i morfometryczna

Zatopione w parafinie tkanki nerki pocięto na skrawki o grubości 4 µm i zamontowano na szkiełkach mikroskopowych do celów histologicznych. Skrawki barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E), znakowaniem końca dUTP terminalną transferazą deoksynukleotydylową (TUNEL) w celu określenia odpowiednio stopnia ATN i apoptozy. Sekcje H&E otrzymały ocenę ATN przez zaślepionego nefrologa według następującego schematu: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 procent przeszczepu ATN. Skrawki nerki wybarwiono również następującymi przeciwciałami podstawowymi: markerem uszkodzenia nerek (KIM-1), markerem powierzchni makrofagów CD68 i mieloperoksydazą swoistą dla neutrofili (MPO; Abcam®, Toronto, Kanada) i uwidoczniono za pomocą przeciwciał drugorzędowych i Chromogen substratu DAB przy użyciu Dako Envision System (Dako, Glostrup, Dania) zgodnie z protokołem producenta, a następnie analizowany pod cyfrowym mikroskopem świetlnym Eclipse 90i (Nikon® Instruments, New York) przy powiększeniu 10x i oznaczany ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ v. 1.8 (National Instytuty Zdrowia, Bethesda, MD).

2.6. Analiza ilościowa PCR

Całkowity RNA wyizolowano z tkanek przeszczepu nerki uzyskanych w POD 3 przy użyciu zestawu RNeasy® Mini (Qiagen, Toronto, Kanada) i poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA przy użyciu zestawu do syntezy cDNA OneScript® Plus (ABM, Kanada) w połączeniu z oligo(dT)12– 18 starterów zgodnie z protokołem producenta. Wyizolowane RNA i cDNA analizowano za pomocą nanokropli (Spektrofotometr DeNovix DS-11, Kanada) przed użyciem, z ocenami A260/280 konsekwentnie >1,95 i >1,8. Mieszanina reakcyjna każdej próbki qPCR miała objętość 20 µl i została sporządzona zgodnie z protokołem Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanada) i analizowana przy użyciu urządzenia CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Kanada) . Sekwencje starterów zaprojektowano przy użyciu oprogramowania Primer-BLAST (NCBI) przeciwko beta-aktynie, poli(ADP-rybozie) polimerazie (PARP), interferonowi-gamma (IFN-), czynnikowi martwicy nowotworu alfa (TNF-), interleukinie 6 (IL -6), chłoniak z komórek B 2 (Bcl-2), białko X związane z Bcl-2- (BAX), kaspaza 3, agonista śmierci domeny oddziałującej z BH3 (BID), c-Jun Kinaza N-końcowa 1/2 (JNK1/2), koaktywator Pparg 1 alfa (PGC-1 ), kompleks mitochondrialny I (NDUFB8), kompleks mitochondrialny II (SDHB), kinaza białkowa aktywowana mitogenami 1/2 (ERK1 /2), geny lipokaliny neutrofilowej żelatynazy (NGAL) i cząsteczki uszkodzenia nerek -1 (KIM-1). Wszystkie geny będące przedmiotem zainteresowania zostały znormalizowane względem beta-aktyny. Krotność zmian ekspresji genów porównano ze szczurami operowanymi pozornie i obliczono metodą ΔΔCt.

2.7. Analiza statystyczna

Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania statystycznego GraphPad (La Jolla, CA) Prism, wersja 9.0. Dane dotyczące przeżycia analizowano za pomocą analizy przeżycia Kaplana-Meiera i testu log-rank, podczas gdy dane dotyczące ekspresji genów qPCR analizowano za pomocą niesparowanego jednokierunkowego testu t-Studenta. Wszystkie inne dane analizowano stosując jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post-hoc Tukeya w celu określenia różnic statystycznych między grupami. Istotność statystyczną przyjęto przy p<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Wyniki

3.1. Pożywka niezawierająca surowicy z suplementacją STS poprawia przeżycie komórek nabłonka kanalików nerkowych podczas zimnej hipoksji/reoksygenacji

Analiza cytometrii przepływowej po wybarwieniu pod kątem apoptozy i martwicy wykazała, że ​​komórki NRK{{0}}E traktowane SF podczas zimnej IRI in vitro wykazywały znacząco zmniejszoną żywotność komórek w porównaniu z komórkami kontrolnymi (normoksycznymi) (ryc. 1A; p < 0.05).="" podczas="" gdy="" wszystkie="" próbki="" eksperymentalne="" wykazywały="" znacznie="" niższą="" żywotność="" komórek="" nabłonka="" kanalików="" nerkowych="" niż="" komórki="" hodowane="" w="" warunkach="" normoksycznych="" (p="">< 0.05),="" komórki="" traktowane="" sf="" uzupełnione="" 150="" µm="" i="" 500="" µm="" sts="" wykazywały="" znacznie="" wyższą="" żywotność="" niż="" te="" traktowane="" z="" samą="" pożywką="" sf="" (fig.="" 1a;="" p="">< 0,05),="" co="" odpowiadało="" znacznie="" zmniejszonej="" apoptozie="" w="" porównaniu="" z="" komórkami="" traktowanymi="" samą="" pożywką="" sf="" (fig.="" 1b;="" p="">< 0,05).="" dodatkowo,="" wzrost="" żywotności="" komórek="" i="" spadek="" apoptozy="" wydaje="" się="" osiągać="" optymalne="" poziomy="" przy="" 150="" µm="" i="" 500="" µm="" sts,="" ponieważ="" wyższa="" dawka="" odwróciła="" te="" trendy="" (ryc.="" 1a="" i="">

3.2. Suplementacja roztworu UW STS poprawia wczesne przeżycie i funkcjonowanie przeszczepu nerki

Zachowanie przeszczepów nerkowych w roztworze UW uzupełnionym STS znacznie poprawiło przeżywalność biorców z 83% przeżywalnością do POD 14 (dzień uśmiercania) w porównaniu z grupą kontrolną bez suplementacji STS, która wykazała przeżycie 12,5%, szczególnie w pierwszych 3 dniach (ryc. 2A; p < 0.05).="" ponadto="" suplementacja="" sts="" znacznie="" poprawiła="" funkcję="" przeszczepu="" we="" wczesnym="" okresie="" po="" przeszczepie="" w="" porównaniu="" z="" samym="" leczeniem="" uw.="" poziomy="" kreatyniny="" w="" surowicy="" i="" bun="" były="" znacząco="" podwyższone="" zarówno="" w="" grupach="" uw,="" jak="" i="" uw="" plus="" sts="" na="" pod="" 3,="" co="" korelowało="" ze="" zmniejszoną="" osmolalnością="" moczu="" w="" porównaniu="" do="" pozorowanej="" (ryc.="" 2b,="" c="" i="" 3a;="" p="">< 0.="" {{25="" }}5).="" jednak="" poziomy="" kreatyniny="" w="" surowicy="" i="" bun="" w="" grupie="" uw="" plus="" sts="" znacznie="" spadły="" w="" pod="" 3="" z="" odpowiednim="" wzrostem="" osmolalności="" moczu="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" uw="" (ryc.="" 2b,="" c="" i="" 3a;="" p="">< 0,05).="" co="" ciekawe,="" poziomy="" kreatyniny="" w="" surowicy="" i="" bun="" w="" grupie="" uw="" plus="" sts="" zmniejszały="" się="" stopniowo="" od="" pod="" 3="" do="" pod="" 14="" ze="" zwiększoną="" osmolalnością="" moczu="" i="" były="" porównywalne="" z="" tymi="" w="" grupie="" pozorowanej="" (ryc.="" 2b,="" c="" i="" 3a).="" również="" wydalanie="" moczu="" w="" grupie="" uw="" plus="" sts="" było="" znacząco="" wyższe="" w="" ciągu="" pierwszych="" czterech="" dni="" po="" operacji="" w="" porównaniu="" z="" grupami="" uw="" i="" sham="" (ryc.="" 3b;="" p="">< 0,05).="" jednak="" stopniowo="" zmniejszał="" się="" w="" kierunku="" wartości="" wyjściowej="" (sham)="" i="" był="" porównywalny="" z="" wartością="" sham="" na="" pod="" 14,="" podczas="" gdy="" wydalanie="" moczu="" u="" szczura,="" który="" przeżył="" w="" grupie="" uw,="" pozostało="" wyższe="" niż="" wartość="" wyjściowa="" na="" pod="" 14="" (ryc.="">

3.3. Dodanie STS do roztworu UW łagodzi wywołaną przeszczepem śmierć komórek po przeszczepie nerki

Skrawki nerki uzyskane na POD 3 i 14 wybarwiono TUNEL jako miarę apoptotycznej śmierci komórek i oceniono przez ślepego patologa nerek (Fig. 4A). Przeszczepy nerki z grupy UW wykazywały znacznie wyższą śmierć komórek apoptotycznych w POD 3, na co wskazuje wyższy wynik TUNNEL w porównaniu z nerkami z grup UW plus STS i Sham (ryc. 5A i b; p < 0.="" {{11}="" }5).="" przeszczepy="" z="" grupy="" uw="" plus="" sts="" nie="" różniły="" się="" znacząco="" w="" porównaniu="" z="" przeszczepami="" sham="" w="" tym="" samym="" punkcie="" czasowym="" i="" pod="" 14="" (ryc.="" 4b).="" dodatkowo,="" podczas="" gdy="" przeszczepy="" z="" obu="" grup="" uw="" i="" uw="" plus="" sts="" wykazały="" znacznie="" wyższe="" wyniki="" atn="" w="" pod="" 3="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" sham="" (ryc.="" 5;="" p="">< 0.="" 0="" 5),="" przeszczepy="" uw="" plus="" sts="" wykazali="" obniżone="" wyniki="" atn="" na="" pod="" 3="" w="" porównaniu="" z="" uw="" (ryc.="" 5;="" p="">< 0,05).="" ponadto,="" podczas="" gdy="" biorcy="" przeszczepów="" uw="" nie="" przeżyli="" do="" pod="" 14,="" a="" zatem="" ich="" wyników="" atn="" nie="" można="" było="" określić="" na="" pod="" 14,="" te="" z="" przeszczepów="" uw="" plus="" sts="" przeżyły="" do="" ​​pod="" 14,="" ale="" wykazały="" znacznie="" wyższe="" wyniki="" atn="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" sham="" (ryc.="" 5;="" p=""><>

3.4. Przeszczepy nerki zachowane w roztworze UW uzupełnionym STS wykazywały zmniejszone markery uszkodzenia i naciek zapalny po przeszczepie nerki

Skrawki nerki uzyskane na POD 3 i 14 wybarwiono KIM -1 w celu wykrycia uszkodzenia kanalików proksymalnych, a także CD68 (marker makrofagów) i MPO (marker neutrofili) i oceniono przez ślepego patologa nerek (ryc. 6A, 7A, i C). Ekspresja tkanki nerkowej KIM-1, CD68 i MPO była znacznie wyższa w grupie UW na POD 3 w porównaniu z tymi z grup UW plus STS i Sham (ryc. 6B, 7B i D; p < {{11}="" }.05)="" podczas="" gdy="" ekspresja="" tych="" markerów="" w="" przeszczepach="" uw="" plus="" sts="" nie="" była="" znacząco="" różna="" w="" porównaniu="" z="" sham="" na="" pod="" 14="" (ryc.="" 6b,="" 7b="" i="" d;="" p=""> 0,05).

3.5. Suplementacja STS roztworem UW hamowała ekspresję nerkowych genów prozapalnych, proapoptotycznych i mitochondrialnych

Ekspresję genów markerów prozapalnych, proapoptotycznych, ukierunkowanych na mitochondria i uszkodzeń nerek określono za pomocą qRT-PCR w przeszczepionych nerkach uzyskanych na POD 3. Ekspresja genów prozapalnych IFN-, TNF- i IL{{8 }} były znacznie zwiększone w przeszczepach UW w stosunku do przeszczepów UW plus STS na POD 3 (ryc. 8A; p < 0.05)="" i="" podążały="" za="" tym="" samym="" wzorem="" z="" genami="" proapoptotycznymi="" parp,="" bax="" ,="" kaspazy-3,="" bid,="" jnk1="" i="" jnk2="" (ryc.="" 8a;="" p="">< 0.05)="" podczas="" gdy="" ekspresja="" antyapoptotycznego="" bcl-2="" była="" nieznacznie="" zwiększona="" w="" uw="" grupa="" plus="" sts="" w="" porównaniu="" z="" grupą="" uw,="" chociaż="" wzrost="" ten="" nie="" osiągnął="" istotności="" statystycznej="" (ryc.="" 8a).="" ponadto="" ekspresja="" genów="" mitochondrialnych="" pgc-1="" ,="" ndufb8="" (kompleks="" i)="" i="" sdhb="" (kompleks="" ii)="" w="" przeszczepach="" uw="" była="" znacząco="" obniżona="" w="" porównaniu="" z="" przeszczepami="" uw="" plus="" sts="" (ryc.="" 8b;="" p="">< 0="" 05)="" podczas="" gdy="" odwrotność="" zaobserwowano="" w="" przypadku="" ekspresji="" erk1="" i="" erk2="" (ryc.="" 8b;="" p="">< 0,05).="" ponadto="" ekspresja="" genu="" kim-1="" w="" przeszczepach="" uw="" była="" istotnie="" zwiększona="" w="" porównaniu="" z="" przeszczepami="" uw="" plus="" sts="" (ryc.="" 8c;="" p="">< 0,05),="" podczas="" gdy="" zmniejszona="" ekspresja="" ngal="" w="" przeszczepach="" uw="" plus="" sts="" nie="" osiągnęła="" istotności="" statystycznej="" w="" porównaniu="" z="" przeszczepy="" uw="" (ryc.="" 8c;="" p=""> 0,05).

4. Dyskusja

Badanie to określa suplementację standardowego roztworu konserwującego STS, klinicznie żywotnym dawcą H2S zatwierdzonym przez FDA, w celu złagodzenia zimnego IRI nerkowego wywołanego przeszczepem, poprawy jakości przeszczepu i przedłużenia przeżycia biorcy. Wykorzystując model in vitro nerkowej IRI i szczurzy model syngenicznego ortotopowego przeszczepu nerki, po raz pierwszy wykazaliśmy, że suplementacja roztworu UW z STS podczas przedłużonego SCS ma działanie ochronne dla narządów i narządów.

Głównym odkryciem naszego modelu in vitro jest to, że suplementacja STS do pożywek bez surowicy chroni komórki nabłonka nerkowego przed zimną hipoksją i apoptozą wywołaną ciepłą reoksygenacją oraz zwiększa żywotność, co jest zgodne z naszym poprzednim badaniem, w którym wykazaliśmy ochronne działanie mitochondriów -ukierunkowany na lek donorowy H2S, AP39, w modelu in vitro zimnej IRI nerek [20]. Co ciekawe, wyższe stężenie STS wynoszące 1 mM odwróciło korzystne efekty, co oznacza, że ​​STS wykazuje dwufazowe zjawisko odpowiedzi na dawkę, określane jako hormesis, w którym niższe stężenie jest cytoochronne, podczas gdy wyższe stężenie jest cytotoksyczne. Uszkodzenie mitochondriów jest główną konsekwencją IRI nerek, ponieważ przepuszczalność mitochondriów może hamować produkcję adenozynotrójfosforanu (ATP) i zwiększać tworzenie reaktywnych form tlenu (ROS), niszczącego mediatora uszkodzenia tkanek [13]. Ostatnio zasugerowano, że mitochondria są głównym miejscem aktywności STS. Wiadomo, że STS nie tylko generuje H2S w mitochondriach poprzez redukcję zależną od glutationu i odwrotnie poprzez szlak utleniania siarczków, ale także zachowuje mitochondrialną syntezę ATP, zmniejsza produkcję ROS i poprawia złożone aktywności enzymów w łańcuchu transportu elektronów (ETC) [24]. ,28-30]. Ponadto ostatnie badania wykazały, że STS znacząco zwiększył ekspresję PGC-1, pozytywnego regulatora biogenezy mitochondriów i produkcji ATP [26], co jest zgodne z naszymi obserwacjami in vivo. Te mechanizmy molekularne mogą odpowiadać za znacznie zwiększoną ekspresję mitochondrialnych kompleksów ETC I i II (odpowiednio NDUFB8 i SDHB) w naszym modelu przeszczepu nerki ze zwiększoną przeżywalnością i funkcją, jak obserwowane w przeszczepach nerkowych zachowanych w roztworze UW uzupełnionym STS.

Opierając się na naszych wynikach in vitro, postanowiliśmy zbadać, czy ochronny efekt STS można zastosować in vivo na modelu przeszczepu, w którym zimna IRI jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do dysfunkcji przeszczepu i zwiększonych powikłań po przeszczepie. Nasze odkrycia pokazują, że przedłużone (24 h) SCS przeszczepów nerki w roztworze UW uzupełnionym STS istotnie poprawia jakość i funkcję przeszczepu, charakteryzującą się obniżonym poziomem kreatyniny i BUN w surowicy, wyższym wydalaniem moczu i wydłużonym przeżyciem biorców w porównaniu z przeszczepami konserwowanymi w samym roztworze UW . Należy zauważyć, że natychmiastowe oddawanie moczu nawet po klinicznym przeszczepieniu nerki jest krytycznym wynikiem, który decyduje o tym, czy dializa jest wymagana w celu zajęcia się funkcją opóźnionego przeszczepu (DGF). Dlatego nasza obserwacja, że ​​STS zwiększa wydalanie moczu natychmiast po przeszczepie i jest porównywalna z grupą pozorowaną na POD 14, jest obiecującym odkryciem. Obserwowana poprawa czynności nerek po przeszczepieniu przeszczepów zachowanych w roztworze UW uzupełnionym STS również przyniosła znaczną poprawę przeżywalności. Ilościowo suplementacja STS przedłużyła żywotność przeszczepu tak, że 83 procent (5/6) szczurów, które otrzymały przeszczepy UW plus STS, przeżyło do POD 14 (dzień uśmiercania) w porównaniu do tylko 12,5 procent (1/8) szczurów biorców przeszczepy zakonserwowane w roztworze UW bez suplementacji STS. To odkrycie z obecnego badania jest również zgodne z naszym poprzednim badaniem, w którym tylko 14 procent (1 z 7) szczurów biorców przeszczepów zostało zachowanych w roztworze UW przez 24 godziny bez suplementacji H2S (GYY4137), przetrwało do POD 14 [20] .

Oprócz wykazania poprawy parametrów czynności nerek, suplementacja STS hamowała również apoptozę przeszczepu nerki i stan zapalny poprzez zmniejszenie ekspresji tkankowej genów proapoptotycznych i prozapalnych, przy jednoczesnym zwiększaniu aktywności genów antyapoptotycznych i zmniejszaniu CD68-dodatnich makrofagów i Neutrofile MPO-dodatnie, co łącznie skutkowało obniżoną ekspresją KIM-1 i ATN, a ostatecznie zachowało morfologię nerek. Wiadomo, że te zapalne cytokiny są mediatorami śmierci komórek podczas zimnej IRI [31], a ich redukcja w przeszczepach UW plus STS jest prawdopodobnie spowodowana dobrze znaną charakterystyką STS, polegającą na zmniejszeniu przepuszczalności śródbłonka w pojedynczej warstwie śródbłonka naczyniowego, osłabieniu wytwarzania cytokin i wywołują produkcję cytokin przeciwzapalnych [32]. Ponadto nasze odkrycie, że suplementacja STS roztworem UW zmniejsza ekspresję genów prozapalnych, odpowiada temu z poprzedniego badania nad działaniem przeciwzapalnym STS poprzez zmniejszenie poziomu TNF- i IL-6 w chorobach neurologicznych [33]. ,34]. Mechanicznie STS dezaktywuje kaspazę-3, przyłączając się do jej miejsca aktywnego poprzez silne wiązania wodorowe i tym samym uniemożliwiając dostęp naturalnego substratu do miejsca aktywnego, ostatecznie hamując apoptozę [35]. STS blokuje również aktywację JNK, białka, które odgrywa kluczową rolę w sygnalizacji apoptotycznej [35], co potwierdza nasze odkrycie dotyczące regulacji w dół wpływu STS na kaspazę3 i JNK. Nie jesteśmy jednak w stanie określić, czy takie mechanizmy działają w niniejszym badaniu, ponieważ nie przeprowadziliśmy dodatkowych eksperymentów w celu zbadania tych mechanizmów molekularnych.

Głównym ograniczeniem naszego eksperymentu in vitro jest wyzwanie techniczne polegające na zastosowaniu obecnej standardowej temperatury przechowywania 4 ◦C [36], ponieważ zastosowana przez nas temperatura 10 ◦C była najniższą temperaturą, jaką można było osiągnąć technologicznie bez narażania środowiska hipoksji. Jest to prawdziwa różnica w odniesieniu do komórkowych procesów fizjologicznych, a także technik konserwacji. Potencjalnym rozwiązaniem jest użycie chemicznie wywołanej hipoksji w plastikowej torbie i umieszczenie jej w lodówce o temperaturze 4◦C, aby odzwierciedlić kliniczne warunki SCS. Jednak te worki do wytwarzania atmosfery beztlenowej zostały zaprojektowane do użytku w wysokich temperaturach (21–37 ◦C), ponieważ w tych warunkach działają związki chemiczne, które indukują środowisko hipoksji. Przyszłe badania powinny mieć na celu optymalizację temperatury w komorze hipoksji, aby naśladować kliniczne ustawienia SCS. Osiągnięcie stałej temperatury 4◦C bez narażania środowiska hipoksji pozwoli nam określić, czy fenotypy obserwowane w doświadczalnym modelu zimnej IRI in vitro są konsekwentnie wyrażane. Poza eksperymentem in vitro nasz szczurzy model przeszczepu również nie jest pozbawiony wad. Przeprowadziliśmy syngeniczny przeszczep nerki (genetycznie identyczni dawcy i biorcy z kompatybilnością immunologiczną), który ma zastosowanie tylko do bliźniąt jednojajowych w klinicznym przeszczepieniu nerki, podczas gdy większość klinicznych przeszczepów nerki ma charakter allogeniczny (genetycznie różni dawcy i biorcy). Przeszczep allogeniczny zmusza biorców przeszczepu do poddania się badaniom immunologicznym przed przeszczepem w celu zidentyfikowania ludzkich antygenów leukocytowych dawcy (HLA; cząsteczki, które indukują i regulują odpowiedź immunologiczną), określenia zgodności immunologicznej między dawcami i biorcami oraz uniknięcia odrzucenia narządu [37, 38]. Przyszłe badania z wykorzystaniem STS powinny uwzględniać transplantację allogeniczną. Innym modelem ograniczonego przeszczepu nerki jest fakt, że skupiliśmy się na żywych dawcach, w wielu ośrodkach transplantacyjnych na całym świecie coraz powszechniejsze stają się nieoptymalne przeszczepy od dawców po śmierci sercowej (DCD) jako źródło nerek dawcy [39]. DCD naraża narządy dawcy na różne okresy ciepłego niedokrwienia oprócz zimnych okresów niedokrwienia podczas SCS i wiąże się ze zwiększonymi wskaźnikami DGF i zmniejszoną przeżywalnością przeszczepu w porównaniu z żywymi dawcami [40]. Dlatego w przyszłych badaniach należy wziąć pod uwagę model przeszczepu nerki DCD, aby ocenić wpływ STS na IRI w tym modelu.

Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że uzupełnienie standardowego roztworu konserwującego klinicznie żywotnym lekiem dawcy H2S podczas długotrwałego SCS przeszczepów nerki chroni przed indukowaną przez przeszczep zimnej IRI nerki, poprawia ogólną jakość przeszczepu i funkcję przeszczepu oraz przedłuża przeżycie biorcy przeszczepu. Biorąc pod uwagę, że ryzyko DGF wzrasta wraz z przedłużonym okresem zimnego niedokrwienia w klinicznym przeszczepieniu nerki, co budzi poważne obawy kliniczne, obserwacja, że ​​STS chroni przeszczepy nerki podczas długotrwałego SCS i zapobiega DGF po przeszczepie, stanowi wielką obietnicę kliniczną, która może zmniejszyć lub zapobiec częstość występowania DGF w klinicznym przeszczepieniu nerki w najbliższej przyszłości. Zatem przyszła korzyść z dodania STS do rozwiązań konserwujących może stanowić potencjalne rozwiązanie tego trwającego problemu. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to uzupełnia rosnącą literaturę, która potwierdza cytoprotekcyjne działanie STS i innych dawców H2S wobec narządowej IRI, szczególnie poprawiając wyniki przeszczepu w zimnej IRI nerkowej wywołanej przeszczepem. Strategie te mogą ułatwić stosowanie większej liczby przeszczepów narażonych na przedłużone okresy zimnego niedokrwienia, co może zwiększyć pulę narządów możliwych do przeszczepienia.

Oświadczenie o wkładzie autorskim CRediT

Wszyscy autorzy wyrazili zgodę na przesłanie tego rękopisu. Nie ma konfliktu interesów.

Bibliografia

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford i wsp., Porównanie śmiertelności u wszystkich pacjentów dializowanych, pacjentów dializowanych oczekujących na przeszczep i biorców pierwszego przeszczepu od zwłok, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725-1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll i in., Przegląd systematyczny: przeszczep nerki w porównaniu z dializą w klinicznie istotnych wynikach, Am. J. Przeł. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte i wsp., Opłacalność przeszczepu nerki z DCD we Włoszech, Transplant. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Ischemia-reperfusion damage, Eur. J. Trauma Emerg. Chirurg. 33 (6) (2007) 600-612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Ochrona organów: obecne koncepcje i nowe strategie na następną dekadę, Transfus. Med. Matka. 38 (2) (2011) 125-142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Zimne niedokrwienie i zmniejszone długoterminowe przeżycie allogenicznych przeszczepów nerki ze zwłok, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713-718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo i wsp., Główne skutki opóźnionej funkcji przeszczepu i czasu zimnego niedokrwienia na przeżycie przeszczepu nerki, Nephrol. Wybierz. Przeszczep. 21 (6) (2006) 1689-1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Wpływ czasu zimnego niedokrwienia na przeżycie przeszczepu wśród biorców przeszczepu ECD: sparowana analiza nerek, Am. J. Przeszczep. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Czynniki ryzyka biorcy związane z opóźnioną funkcją przeszczepu: sparowana analiza nerek, Przeszczep 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay i wsp., Każda dodatkowa godzina zimnego niedokrwienia istotnie zwiększa ryzyko niepowodzenia przeszczepu i śmiertelności po przeszczepie nerki, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343-349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Przeciwutleniacze ukierunkowane na mitochondria: przyszłe perspektywy w uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym nerek, Oxid. Med. Komórka Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Stres oksydacyjny spowodowany mitochondrialnym przeciążeniem wapniem, Ann. Akademia Nowego Jorku. Nauka. 1201 (2010) 183-188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Rola mitochondriów w uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym, Transplantation 73 (4) (2002) 493-499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Emerging role of gasotransmitters in nerek transplantation, Am. J. Przeszczep. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Siarkowodór i sygnalizacja komórkowa: gracz zespołowy czy sędzia? Fizjol roślin. Biochem. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, Efekt wazorelaksacyjny H(2)S jako nowego endogennego gazowego otwieracza kanałów K(ATP), EMBO J. 20 (21) (2001) 6008-6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter i in., Leczenie siarkowodorem łagodzi uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne przeszczepu nerki podczas przechowywania w chłodni i poprawia wczesną funkcję przeszczepu nerki i przeżycie po allogenicznym przeszczepie nerki, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806-1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Uzupełniający siarkowodór chroni funkcję nerki przeszczepionej i przedłuża przeżycie biorcy po długotrwałym uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym przez łagodzenie apoptozy przeszczepu nerki i zapalenie, BJU Int. 110 (11 pkt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian i in., Siarkowodór chroni przeszczepy nerkowe przed długotrwałym uszkodzeniem na zimno niedokrwienno-reperfuzyjnym poprzez specyficzne działania mitochondrialne, Am. J. Przeszczep. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Tiosiarczan sodu w ostrym zatruciu cyjankiem: badanie na modelu szczura, Ann. Farmacja Ks. 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri i wsp., Tiosiarczan sodu chroni przed zaburzeniami czynności nerek po hipertermicznej chemioterapii dootrzewnowej (HIPEC) z użyciem Cisplatyny, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897-902.