Badanie funkcji neuroendokrynno-immunologicznych Cistanche Deserticola i jej produktów do gotowania na parze wina ryżowego w modelu szczurzym indukowanym glukokortykoidami-Ⅰ

1. Wprowadzenie

Cistanche desericola, zwany „żeń-szeniem pustynnym”, jest tradycyjną medycyną chińską stosowaną od wieków jako zioło tonizujące yang.pobudzający nerki i wzmacniający Yang[1]. Osiem gatunków i jedna odmianaCistanche Herba zostały zarejestrowane w Chinach i tylkoCistanche desericolaYC Ma iCistanche tubulosa(Schenk) Wight są zapisane w Farmakopei Chińskiej [2]. Wykazały to badania farmakologiczneCistancze Herbawykazuje działanie neuroprotekcyjne [3], immunomodulujące [4], kardioprotekcyjne [5], przeciwzmęczeniowe [6], przeciwzapalne [7], hepatoprotekcyjne [8], przeciwutleniające [9], przeciwbakteryjne [10], przeczyszczające [11] i przeciwnowotworowe efekty [12]. Szerokie spektrum zgłaszanych aktywności biologicznych tego rodzaju przypisuje się jego złożonemu i zróżnicowanemu składowi fitochemicznemu.Cistanche desericolazawiera glikozydy fenyloetanolowe, irydoidy, polisacharydy [13] itp. Zawartość glikozydów fenyloetanoidowych jest najwyższa w oryginalnych materiałach leczniczych [14].

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA OŻYWANIA NEREK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Przetwarzanie chińskiej Materia Medica (CMM) to tradycyjna technika farmaceutyczna spełniająca różne wymagania dotyczące leczenia, dozowania i przygotowywania preparatów zgodnie z teorią tradycyjnej medycyny chińskiej. Te przetworzone produkty nazywane są kawałkami wywaru i są używane w klinikach. Przetwarzanie ma na celu zwiększenie skuteczności i zmniejszenie toksyczności surowych leków. W Farmakopei Chińskiej z 2015 r. odnotowano, że grube plastry Cistanche (CD) i Cistanche gotowane na parze na winie ryżowym (WCD) można stosować w klinice jako kawałki wywaru. Nasza grupa badawcza wykazała, że ​​działanie przeczyszczające zostało złagodzone, a działanie przeciwstarzeniowe i wzmacniające nerki-yang uległo wzmocnieniu po gotowaniu Cistanche na parze z winem ryżowym [15].

W zespole niedoboru nerki-yang funkcja osi podwzgórze–przysadka–nadnercza–grasica (HPAT) jest zaburzona [16]. Pacjenci z niedoborem nerek-yang mają również rozległe zaburzenia odporności. Dysfunkcja osi HPA jest ściśle powiązana z niedoborami odporności. Teoria sieci neuroendokrynno-immunologicznej (NEI) pokazuje, że układ odpornościowy i neuroendokrynny mają wiele wspólnych ligandów i receptorów [17], a podwzgórze uważa się za kluczowy element łączący układ neuroendokrynny z układem odpornościowym.

W tym badaniu powtórzyliśmy niedobór nerki-yang u modelowych szczurów po wstrzyknięciu egzogennych kortykosteroidów i zbadaliśmy mechanizm niedoboru nerki-yang w odpowiedzi na różne przetworzone produkty Cistanche desericola z punktu widzenia funkcji układu odpornościowo-endokrynnego.

2. Materiały i metody

2.1. Materiały i odczynniki

Cistanche desericola została zebrana od Alashan Neimenggu w 2019 r.5 i zidentyfikowana jako suszone, mięsiste łodygi Cistanche desericola YC Ma przez prof. Yanjuna Zhai (Szkoła Farmacji, Uniwersytet Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Liaoning, Chiny). Wzory bonów przechowywano w Centrum Technologii Inżynierii Przetwarzania w Liaoning.

Standardowe związki ajugolu zakupiono od Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Chiny); cistanozyd F,echinakozyd, cistanozyd A i izoakteozydzostały zakupione od Must Company (Syczuan, Chiny); Acteozyd zakupiono od Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Chiny). Acetonitryl i metanol klasy MS zakupiono od Merck KGaA (Darmstadt, Niemcy). Kwas mrówkowy klasy HPLC zakupiono od Merck KGaA (Darmstadt, Niemcy). Wino ryżowe zakupiono od Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Chiny).

Kortykosteron (CAS: 50-22-6, czystość > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pigułki do żucia chinkuei shin (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), szczur ACTH, CRH, T, IL{{ Zestawy do wykrywania 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 i IL-10 ELISA zakupiono od Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Zestaw do testu ELISA kortyzolu szczura dostarczyła firma BOSK Co., szczurze przeciwciało CD4, przeciwciało CD8a (nr 561833 i 559976), lizat RBC (Solarbio, R1010), roztwór buforowy PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM i startery -aktyny powyżej i poniżej zostały dostarczone przez zestaw do odwrotnej transkrypcji Guangzhou Invitrogen Co. (nr RR037A) i zestaw do syntezy cDNA (nr 10000068167) zostały dostarczone przez Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Chloroform, izopropanol, 75% etanol i uretan wszystkie roztwory były analitycznie czyste i zostały wyprodukowane przez Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultraczystą wodę wytworzono w systemie Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, USA).

2.2. Instrumenty eksperymentalne

Marker enzymatyczny (Thermo, model 3530911931), automatyczna myjka płytek (model HBS- 4009), cyfrowy miernik siły push-pull z wyświetlaczem (model VICTOR- 50N), wysokoobrotowa wirówka zamrażająca (model Sigma 3k15 ), ultramikrospektrofotometr (model B-50Q), wzmacniacz genów (model L96G), fluorescencyjny ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (model StepOne), cytometr przepływowy (model AC66051710132), mikrotom parafinowy (model Laika), mikroskop (Olympus , model BS-53) i instrument do czystej wody (model F7JA36507).

2.3. Przygotowanie próbek do UPLC-Q-TOF-MS i eksperymentów farmakologicznych

WCD zostało przetworzone z tej samej partiiCistanche desericolaw naszym laboratorium. W celu przygotowania WCD suche kawałki CD (o grubości 5 mm) (100 g) zalano winem ryżowym (30 ml), gotowano na parze pod wysokim ciśnieniem (1,25 kPa) przez 4 godziny, a następnie suszono w temperaturze 55°C.

Grube proszki CD i WCD namoczono w 10 razy 95% etanolu przez 0,5 godziny, ekstrahowano pod chłodnicą zwrotną 3 razy za każdym razem przez 1 godzinę, przesączono, a przesącze 3 razy połączono. Etanol odzyskano pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano ekstrakt do podawania. Ekstrakt (1 ml) dodano do 50% metanolu, doprowadzając całkowitą objętość do 20 ml i przechowywano w temperaturze 4 stopni w celu analizy zawartości.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. Warunki analizy UPLC-QqQ-MS dla ekstraktów CD i WCD

2.4.1. Warunki analityczne LCThMS

Do akwizycji i przetwarzania danych wykorzystano system UPLC-MSThMS z oprogramowaniem MassLynx 4.1 Analyst. Kolumnę analityczną stanowiła Acquity UPLC BEH C18 (1{{1{12}}}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 µm) w temperaturze 40 stopnia C. Faza ruchoma stanowił 0,1% wodny roztwór kwasu mrówkowego (A) i acetonitryl zawierający 0,1% kwasu mrówkowego (B). Gradient elucji wynosił 0,00–1,{17}} min przy 3% B, 1,01–2,00 min przy 3%–11,5% B, 2,01–3.{{29 }} min przy 12% B, 3,01–4,00 min przy 15% B, 4,01–5,00 min przy 20% B, 5,01–6,00 min przy 22 % B, 6,01–8,00 min przy 25% B i 8,01–9,00 min przy 10% B. Szybkość przepływu wynosiła 0,3 mLTh min, a objętość wstrzyknięcia 1,0 μL.

W trybie jonów ujemnych zastosowano spektrometr masowy Waters z potrójnym poczwórnym kwadrutem (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) wyposażony w źródło jonizacji przez elektrorozpylanie (ESI). Gazem desolwatacyjnym był azot o natężeniu przepływu 500 LThh w temperaturze 250 stopni. Wszystkie wykryte związki mierzono w trybie monitorowania wielu reakcji (MRM); W tabeli 1 przedstawiono parametry energetyczne, a w tabeli 2 krzywe kalibracyjne analizowanych składników.

2.4.2. Przygotowanie substancji odniesienia

Tubulozyd A (3,02 mg), echinakozyd (3,00 mg), 2′-acetylakteozyd (2,34 mg), akteozyd (2,45 mg), izoakteozyd (0,61 mg), cistanozyd F ( 2,14 mg), salidrozyd (3,39 mg), kwas genipozydowy (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) i katalpol (2,39 mg) rozpuszczono w metanolu w celu przygotowania roztworu podstawowego. Roztwór podstawowy rozcieńczono metanolem w celu uzyskania odpowiednich stężeń dla roboczych roztworów wzorcowych. Wszystkie przygotowane roztwory przechowywano przed użyciem w temperaturze 4 stopni.

2.5. Przygotowanie i grupowanie modeli zwierzęcych

Samce szczurów SD (180–220 g) zakupiono od Liaoning Changsheng Biotechnological Co., numer zezwolenia dla zwierząt: SCXK (Liao) 2015–0001. Wszystkim szczurom zapewniono swobodny dostęp do pożywienia i wody w temperaturze 25 stopni i wilgotności względnej 30–50%. Przed eksperymentami zwierzęta trzymano przez 7 dni.

Sto szczurów podzielono losowo na 10 grupy: grupę ślepą kontrolną (BC), grupę kontrolną modelową (MC), grupę kontrolną pozytywną (PC), grupę kontrolną wina ryżowego (WC), grupę CD z dużą dawką (CD -HD), grupa CD ze średnią dawką (CD-MD), grupa CD z niską dawką (CD-LD), grupa WCD z dużą dawką (WCD-HD), grupa WCD ze średnią dawką (WCD-MD) i Grupa niskodawkowa WCD (WCD-LD). Dawki CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD i CD-LDThWCD-LD wynosiły odpowiednio 5,48 gTh(kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) i 1,37 gTh(kg ∙ d). Dawka dla grupy PC wynosiła 1,646 gTh(kg ∙ d), a dla grupy WC 1 mLTh100 g przez 40 dni. Szóstego dnia po podaniu szczurom wstrzyknięto podskórnie wodną zawiesinę kortykosteronu (kortykosteron + 0,1% dimetylosulfotlenek + 0,1% Tween-80 + 0,9% chlorek sodu), z wyjątkiem dla grupy BC [18]. Stężenie kortykosteronu wynosiło 5 gThL, a dawka 0,1 mLTh100 g. Szczurom w grupie BC podano sól fizjologiczną + 0,1% dimetylosulfotlenku + 0,1% Tween- 80 + 0,9% chlorku sodu przez wstrzyknięcie w tej samej dawce.

2.6. Wyznaczanie funkcji osi HPA

2.6.1. Test masy, temperatury i siły trzymania

Co 3 dni wykonywano próbę masy ciała, a co 6 dni mierzono temperaturę. podczas eksperymentu. W 39. dniu za pomocą miernika chwytu zmierzono maksymalną siłę kończyny tylnej. Szczury umieszczono na gładkich platformach, tak aby ich tylne kończyny chwytały tylną tyczkę. Szczury instynktownie chwytają każdy przedmiot, aby zapobiec cofnięciu się, gdy pociągnie się ogon, aż siła ciągnięcia przekroczy chwyt. Kiedy szczur stracił przyczepność, przedwzmacniacz mógł automatycznie zarejestrować maksymalną siłę chwytu.

2.6.2. Oznaczanie poziomu T, CRH, ACTH, CORT i kortyzolu w surowicy

Godzinę po ostatnim podaniu szczury znieczulono poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu uretanu (20 gTh100 ml). Następnie pobrano próbki krwi, odwirowano przy 3500 obr./min przez 15 minut w celu uzyskania surowicy i przechowywano w temperaturze -20°C. Stężenia T, CRH, ACTH, CORT i kortyzolu mierzono za pomocą szczurzych zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.

2.6.3. Obserwacje mikroskopowe

Strukturę morfologiczną tkanki nadnerczy obserwowano poprzez barwienie HE. Tkankę nadnerczy utrwalono w 10% paraformaldehydzie, odwodniono w etanolu, nadano przezroczystości roztworem ksylenu, zatopiono metodami konwencjonalnymi, pocięto na plastry o grubości 4 µm, odparafinowano roztworem ksylenu, uwodniono gradientem etanolu, a następnie wybarwiono hematoksyliną i eozyną roztwór barwiący. Po nadaniu przezroczystości za pomocą ksylenu, płytkę uszczelniono obojętną gumą i obserwowano pod mikroskopem.

2.6.4. Barwienie immunohistochemiczne ekspresji białek Bax, Bcl-2, kaspazy-3, Fas i FasL w nadnerczach

Utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie skrawki nadnerczy szczurów odparafinowano i ponownie nawodniono po pocięciu na grubość 4 µm. W celu zablokowania aktywności endogennej peroksydazy skrawki inkubowano wstępnie w bloku nadtlenku wodoru przez 10 min. Skrawki zanurzono w 0,01 M cytrynianie (pH 6,0) i ogrzano do wrzenia. Procedurę powtórzono po 5–10 minutach. Po ochłodzeniu skrawki przemyto 1–2 razy PBS (pH 7,2–7,6), pozostawiono w temperaturze pokojowej na około 5 minut i przemyto 2–3 razy PBS (pH 7,2–7,6). Dodano 5% roztwór blokujący BSA w temperaturze pokojowej i nadmiar płynu na skrawku wytrząsano 20 minut później. Dodano rozcieńczone przeciwciała pierwotne specyficzne dla FasTh FasL, Bcl-2ThBax i kaspazy-3 (rozcieńczone 1:100 PBS) i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 stopni przez noc. Skrawki przemywano 2–3 razy PBS (pH 7,2–7,6). Następnie dodano biotynylowaną kozią anty-mysią IgG, a skrawki suszono w temperaturze 20–37 stopni przez 20 minut i przemywano PBS (pH 7,2–7,6) 4 razy przez 5 minut. Po dokładnym przemyciu w PBS skrawki inkubowano z mieszaniną odczynników A i B przez 30 minut, inkubowano z PBS przez 45 minut i na koniec wywoływano substratem DAB (DAKO) przez 30 minut, po czym lekko kontrastowano hematoksyliną, odwodniono, i zamontowane.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA WZMOCNIENIA WRAŻEŃ SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Określenie funkcji odpornościowych

2.7.1. Obliczanie wskaźnika narządów odpornościowych

Godzinę po ostatnim podaniu szczury znieczulono poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu uretanu (20 gTh100 ml), a następnie usunięto śledzionę i grasicę i natychmiast zważono pod sterylnym kapturkiem. Współczynniki wagowe śledziony lub grasicy (%) – masa śledziony lub grasicy (mg) Masa ciała (g).

2.7.2. Wykrywanie podzbiorów limfocytów T we krwi obwodowej

Splenocyty i hemocyty inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi anty-CD4 (PE) i anty-CD8 (FITC) przez 30 minut w ciemności. Dodano 2 ml lizatu erytrocytów i roztwór mieszano przez worteksowanie. Roztwór pozostawiono w ciemności na 10 minut i wirowano przez 5 minut. Supernatant odrzucono, a następnie roztwór przemyto 3 razy lodowatym PBS i ponownie zawieszono w roztworze permeabilizującym PBS. Co najmniej 10000 komórek analizowano metodą cytometrii przepływowej w ciągu 1 godziny od każdego barwienia Mab.

2.7.3. Oznaczanie poziomu IL-10, IL-6, IL-2, TNF- i IFN-c w surowicy

Godzinę po ostatnim podaniu szczury znieczulono poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu uretanu (20 gTh100 ml) i pobrano krew z aorty brzusznej. Krew odwirowano przy 3500 obr./min przez 15 minut w celu otrzymania surowicy i przechowywano w temperaturze -20 stopni. Stężenia IL-10, IL-6, IL-2, TNF- i IFN-c oznaczono za pomocą szczurzych zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.

2.8. Ekspresja CaM w tkankach podwzgórza i przysadki mózgowej

Całkowity RNA ekstrahowano z tkanek podwzgórza i przysadki mózgowej za pomocą TRIzolu. Odwrotną transkrypcję przeprowadzono na 10 µl całkowitego RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Równe ilości cDNA analizowano za pomocą qPCR w obecności barwnika wiążącego dsDNA (Promega, USA) i systemu CFX 96 Real-time PCR System (Bio-Rad, USA), aby przyjrzeć się różnym genom w warunkach początkowej aktywacji w 95 stopni przez 10 min, 40 cykli denaturacji w 95 stopniach przez 15 s i wydłużanie w temperaturze 60 stopni przez 1 min.

Startery dla CaM i -aktyny podano w Tabeli 1, a -aktynę zastosowano jako kontrolę wewnętrzną. Każdą próbkę normalizowano wykorzystując różnicę w progach krytycznych (Ct) pomiędzy genem docelowym i -aktyną. Do opisu wyniku wykorzystano równanie: ΔΔCt � (gen docelowy Ct – gen Ct -aktyny) grupa eksperymentalna – (gen docelowy Ct – gen Ct -aktyny) grupa kontrolna. Następnie porównano poziomy mRNA w każdej próbce, stosując docelowy gen ekspresji 2- ΔΔCt. Wyniki każdej grupy uśredniono (tab. 3).

2.9. Analiza statystyczna

Wszystkie dane analizowano przy użyciu oprogramowania SPSS (wersja 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Różnice między grupami analizowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (ANOVA). Wyniki wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD) przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism (wersja 6.0, San Diego, Kalifornia, USA). Różnice o wartości P mniejszej niż 0,05 uznano za istotne statystycznie.

3. Wyniki eksperymentów

3.1. Analiza UPLC-QqQ-MS

Aby osiągnąć najlepszą separację, kształt piku i krótki czas analizy, w naszym wstępnym eksperymencie zbadano warunki chromatograficzne, w tym kolumnę, fazę ruchomą i program gradientowy. Typowe chromatogramy w trybie MRM przedstawiono na rysunku 1.

Z tabeli 4 wynika, że ​​zawartość glikozydów fenyloetanoidowych w WCD wzrosła w porównaniu z CD, szczególnie w przypadku echinakozydu i akteozydu, podczas gdy zawartość irydoidów w WCD spadła.

3.2. Rozporządzenie dotyczące funkcji osi HPA

3.2.1. Test masy, temperatury i siły trzymania

Szczury z grupy MC i grupy eksperymentalne po podaniu kortykosteronu stopniowo wykazywały objawy niedoboru nerek-yang. Objawy, takie jak utrata masy ciała, hipotermia, utrata blasku włosów, opadanie ducha, opóźnienie w reakcji oraz znaczny spadek spożycia wody i aktywności, uległy znacznej poprawie w grupach CD i WCD. Rysunek 2(a) pokazuje zmiany masy. Zwiększyła się masa każdej z grup leków, szczególnie w grupach CDHD i WCD-HD. Przyrost masy ciała był najniższy w grupie MC. Na rycinie 2(b) przedstawiono zmiany temperatury, które były najniższe w grupie MC oraz wzrost temperatury w grupach WCD-HD, WCD-MD i WCD-LD.

Rycina 2(c) pokazuje, że siła trzymania wzrosła w grupie BC i każdej z grup eksperymentalnych, a grupa WCD-MD była najwyższa, co wykazało, że oznaki osłabienia wywołanego niedoborem nerki-yang uległy poprawie po podaniu.

3.2.2. Poziomy T, CRH, ACTH, CORT i kortyzolu

Rycina 3 pokazuje, że w porównaniu z grupą BC poziom T, CRH, ACTH i CORT w surowicy szczura spadł (P < 0.01), a poziom kortyzolu spadł (P < 0.05) w grupie MC. W porównaniu do grupy MC wzrósł poziom T w grupach WCD-HD i WCD-MD (P < 0.01), poziom CRH w WCD-LD, Poprawa w grupach WCD-MD i WC (P <{24}},01), zawartość ACTH wzrosła w grupach CD-HD, WCD-MD i WCD-HD (P <0,01), podniósł się poziom CORT w grupie CD-MD, WCD-MD i WCD-HD (P < 0,01) oraz podwyższony w grupach CDHD i WCD-LD (P < 0,05), a poziom kortyzolu wzrósł w każdej z grup leków.

3.2.3. Wyniki obserwacji mikroskopowych

Tkankę nadnerczy można podzielić na warstwę korową i warstwę rdzeniową. Warstwy korowe obejmują warstwy kuliste, pęczkowe i siatkowe. Komórki zawierają więcej lipidów, a warstwa rdzenia składa się głównie z komórek guza chromochłonnego i niewielkiej ilości tkanki włóknistej. Jak pokazano na rycinie 4, odkryliśmy, że w grupie BC wszystko było w normie, podczas gdy w grupie MC kora nadnerczy miała wyraźny rozrost, zanik komórkowy i zwiększoną gęstość. Bulwiasty pasek zgrubiał, a przezroczysta strefa pęczkowa, wąska strefa siatkowa i mniejsze komórki wykazywały nierówne zabarwienie i przekrwienie naczyń włosowatych. W grupie PC widoczne były granice korowe i rdzeniowe. Komórki pasm kulistych i pęczków ułożyły się równomiernie, a struktura morfologiczna została przywrócona. Tę samą lepszą regenerację zaobserwowano w grupach WCD, a efekty w grupie WCD-MD były lepsze niż w grupach WCD-HD i WCD-LD. Morfologia nadnerczy w grupach CD nie była tak dobra jak w grupach WCD.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%