Badanie funkcji neuroendokrynno-immunologicznych Cistanche Deserticola i jej produktów do gotowania na parze wina ryżowego w modelu szczurzym indukowanym glukokortykoidami-Ⅱ

3.2.4. Immunohistochemia

Apoptoza neuronów jest kontrolowana przez wiele genów apoptotycznych i antyapoptotycznych, głównie gen promujący apoptozę Bax i geny antyapoptotyczne z rodziny genów Bcl-2. Bcl-2 jest zlokalizowany w organellach wytwarzających reaktywny tlen, takich jak mitochondria, siateczka śródplazmatyczna i błony jądrowe. Bcl-2 ma niewielki wpływ na wolne rodniki tlenowe, ale możezapobiegają uszkodzeniom oksydacyjnym w komórkach. Bax transportuje z cytoplazmy do błony mitochondrialnej, zmienia strukturę błony mitochondrialnej i sprzyja uwalnianiu cytochromu c i indukcji apoptozy.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

W cytoplazmie nadnerczy występowała ekspresja białka Bax i Bcl-2. Zabarwienie wykazało wszystkie żółte cząstki. W porównaniu z grupą BC, średnia gęstość optyczna białka Bax w grupie MC znacznie wzrosła (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

Rycina 5(b) pokazuje, że w porównaniu z grupą BC średnia gęstość optyczna białka Bcl-2 w grupie MC znacznie spadła (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

Białko kaspaza-3 jest zlokalizowane głównie w cytoplazmie w swojej pierwotnej postaci w normalnych tkankach i charakteryzuje się niską ekspresją. Sygnały pozytywne są bladożółte lub brązowawo-żółte. W porównaniu z grupą BC ekspresja kaspazy-3 w grupie MC znacznie wzrosła (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

W normalnych tkankach ekspresja genu Fas była zmniejszona, a pozytywny sygnał hybrydyzacji in situ był brązowawo-żółty. Jak pokazano na rycinie 5 (d), w porównaniu z grupą BC, średnia gęstość optyczna białka Fas w grupie MC wzrosła (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

Białko FasL zlokalizowane jest głównie w błonie komórkowej lub cytoplazmie, a jego pozytywne sygnały mają kolor brązowy. W porównaniu z grupą BC, średnia gęstość optyczna genu FasL w grupie MC znacznie wzrosła (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Wyniki pokazały, że CD i WCD mogąindukują apoptozę w komórkach zapalnychoraz zmniejszają uszkodzenie nadnerczy poprzez promowanie ekspresji białka FasL i wiązanie się z białkiem Fas, aktywację białka kaspazy-3 i wyzwalanie kaskady kaspaz. Najlepszy efekt uzyskała grupa WCD-HD.

3.3. Określenie funkcji odpornościowej

3.3.1. Indeks narządów odpornościowych

W porównaniu do grupy BC, współczynnik grasicy i wskaźnik śledziony w grupie MC znacząco spadły (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better. 

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3.2. Wykrywanie podzbiorów limfocytów T we krwi obwodowej

Odsetek komórek CD4+ w lewym górnym kwadrancie i komórek CD8+ w prawym dolnym kwadrancie w BC i każdej grupie leków był wyższy niż w grupie MC. W porównaniu z grupą BC, odsetek CD4+ThCD8+ znacznie spadł w grupie MC (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. Oznaczanie poziomu IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α i IFN-C w surowicy

Rycina 8 pokazuje, że w porównaniu z grupą BC poziom IL-6, TNF- i IFN-c znacznie wzrósł (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Wyniki eksperymentu obserwacyjnego pod mikroskopem tkankowym Lymus

Rycina 9 pokazuje, że w grupie BC obecna była duża liczba limfocytów. Limfocyty i retikulocyty były luźno ułożone pośrodku z rozproszonymi okrągłymi lub owalnymi tymocytami. Nie stwierdzono martwicy, nacieku komórek zapalnych i żadnych nieprawidłowych zmian.

W grupie MC stwierdzono dużą ilość tkanki martwicy limfatycznej, z nieuporządkowanym układem limfocytów i retikulocytów w środku. Zaniknęły okrągłe lub owalne tymocyty, widoczna była masywna degeneracja lub martwica komórek oraz naciek komórek zapalnych z nieprawidłowymi zmianami patologicznymi.

W grupach CD charakterystyka morfologiczna limfocytów wróciła do normy, a rozmieszczenie centralnych limfocytów i retikulocytów było prawie normalne. Okrągłe lub owalne tymocyty wyzdrowiały, ale pozostała niewielka liczba limfocytów zwyrodnieniowych lub martwiczych oraz naciekających komórek zapalnych.

W grupach WCD i grupie PC cechy morfologiczne limfocytów były lepiej naprawione. Limfocyty i retikulocyty w centrum były dobrze wyrównane, okrągłe lub owalne tymocyty były prawie normalne, ale pozostała niewielka liczba limfocytów naciekających i zwyrodnieniowych.

3.4. Ekspresja genu białka CaM

Do zbadania ekspresji mRNA CaM wzięto pod uwagę wartość RQ (mRNA CaM – mRNA aktyny). RQ grupy BC wynosiło 1. Ekspresja mRNA CaM w podwzgórzu w grupie MC znacząco wzrosła (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Dyskusja

Farmakopea Chińska [2] podaje, że CD i WCD mogą być stosowane w klinice jako główne rodzaje wywarów. Po ugotowaniu na parze z winem ryżowym,działa przeciwstarzeniowo i tonizująco na nerki-yangzostały wzmocnione. Za pomocą UPLC-QqQ-MS wykryliśmy ilościowe zmiany w bazie materiału chemicznego podczas procesu parowania wina ryżowego. Glikozydy irydoidowe były niestabilne, a zawartość tych glikozydów spadła, a nawet stała się niewykrywalna. Zmieniła się także zawartość glikozydów fenyloetanolowych, co może powodować zmiany w farmakodynamice i efekcie klinicznym.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Klasyczny model niedoboru Yang nerek został odtworzony poprzez podskórne wstrzyknięcie kortykosteronu [19]. Przedawkowanie kortykosteronu może hamować wydzielanie CRH w podwzgórzu. W międzyczasie tajemnica ACTH również została zahamowana. Obniżył się poziom hormonu kory nadnerczy, a co za tym idzie, upośledzona została funkcja osi HPA. Niedoczynność osi HPA jest częstą cechą niedoboru Yang nerek [20]. Następnie szczury wykazują zjawisko „wyczerpania”, a objawy są zgodne z objawami niedoboru nerki-yang w klinice.

W grupie MC poziom CRH, ACTH, T i CORT w surowicy szczurów znacząco spadł (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Modulowanie proporcji członków rodziny Bcl-2 jest jednym z podstawowych mechanizmów, dzięki którym FasThFasL pośredniczy w szlaku receptora śmierci, a rodzina Bcl-2 reguluje szlak mitochondrialny [21]. Czynnik hamujący apoptozę Bcl-2 i czynniki indukujące apoptozę, takie jak Bax, należą do rodziny Bcl-2 [22]. Apoptozę komórek można określić na podstawie względnego stosunku czynników hamujących apoptozę do czynników indukujących apoptozę [23]. Mitochondria pełnią funkcję centralnych punktów kontrolnych dla wielu form apoptozy [24]. Niniejsze badanie wykazało, że CD-MD i WCD mogą wywnioskować ekspresję Bax i zwiększyć Bcl-2 dopoprawić niedobór nerki-yang. Fas jest głównym receptorem śmierci, który indukuje apoptozę poprzez ligację z ligandem Fas (FasL) [25]. Ekspresja Fas i FasL wzrosła w grupie MC, natomiast ekspresja ta wzrosła istotnie w grupie WCD-MD (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

Niedobór funkcji odpornościowych jest jednym z ważnych objawów niedoboru nerki-yang [28]. W tym badaniu odkryliśmy, że wskaźnik śledziony i grasicy w grupie WCD-MD znacznie się poprawił (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

Oś HPA jest najważniejszym układem regulacyjnym, ponieważ reguluje wydzielanie glukokortykoidów oraz układ hormonalny w celu utrzymania funkcji wydzielniczej kory nadnerczy [32]. Nadekspresja mRNA CaM w tkance podwzgórza była związana z niedoborem Yang nerek. CD i WCD mogą blokować kanały wapniowe, hamować ekspresję mRNA CaM w podwzgórzu i zmniejszać napływ wapnia, zmniejszając w ten sposób aktywność kompleksu Ca2+·CaM.

Powstawanie niedoboru yang nerek jest procesem rozwoju choroby przewlekłej. Nerka nie jest już pojęciem czysto anatomicznym i jest to ogólne określenie układu odporności neuroendokrynnej i układu moczowo-płciowego. Sieć neuroendokrynno-immunologiczna (NEI) jest ważnym zintegrowanym systemem regulacyjnym [33]. CD i WCD mogą regulować funkcję osi HPAT i poprawiać regenerację niedoboru nerki-yang. Wynik ten stanowi podstawę eksperymentalną do klinicznego zapobiegania i leczenia niedoboru Yang nerek.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%