Badanie wpływu acteozyd (aktywny składnik Cistanche Deserticola) na NAFLD poprzez indukowanie autofagii

2 wyniki

2.1 Porównanie poziomów ekspresji białka LC 3- ⅱ w komórkach Hepg2 traktowanych za pomocąDziałaj i ech względna ekspresja białka LC 3- ⅱW komórkach HEPG2 traktowanych BAFA1 (0. 67 ± 0. 0 4) był znacznie wyższy niż w pustej grupie kontrolnej (0. 41 ± 0. 0 2). Względne wyrażenie LC {{1 {{2 0}}}} ⅱ Białko w komórkach HEPG2 w grupie rapamycin+Bafa1 (1.24 ± {3 0}}. (0. 28 ± {{4 0}}. 02). Ekspresja białka LC 3- ⅱ w komórkach HEPG2 w grupie ECH+BAFA1 i grupie ACT+BAFA1 [0,43 ± 0,02 i 1,36 ± 0,11, odpowiednio], były odpowiednio wyższe niż w grupie ECH i grupie ACT [(0,18 ± 0,01 i 0,28 ± 0,02, a różnice były odpowiednio (Różnice St Statistialnie (P (0,18 0,18 ± 0,01 i 0,02], a różnice znaczące (P.<0.05).

TCM Herb Cistanche dla ochrony wątroby

2.2 Porównanie poziomów ekspresji białka LC 3- ⅱ w komórkach Hepg2 traktowanych różnymi stężeniami ACT

The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{1 0}}}}. 0 5); LC 3- ⅱ Poziomy ekspresji białek komórek HEPG2 w BAFA1 w połączeniu z 25, 5 0 i 1 0 0 μmol/l grup ACT (1.17 ± 0. 3 0, 1,83 ± 0. 53 i 0. 97 ± 0,25, odpowiednio) były znacznie wyższe niż w grupie ACT 25, 50 i 100 μmol/L (0,38 ± 0,09, 0,35 ± 0,18 i 0,30 0,15), z znaczącymi różnicami (p<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.

Uwaga: A. immunoblotting białkowy; B. Wyniki analizy półilościowej; w porównaniu z grupą ACT bez BAFA1, AP<0.05.
Rycina 1 Porównanie poziomów ekspresji białka LC 3- w komórkach Hepg2 traktowanych różnymi stężeniami ACT

2.3 Porównanie żywotności komórek HepG2 traktowanych różnymi stężeniami ACT przez 24 i 48 godzin

Wartości OD komórek HEPG2 po interwencji z 0, 2 0, 4 {{1 0}}, 6 0, 8 0 i 1 0 0} {{14} dla 24 H były 0. 98 ± 0. 17, 0. 99 ± {{3 0}}. 15, 0. 99 ± {43}}. 19, 1. 0. 94 ± 0. 15 i 0. 94 ± 0. 20, odpowiednio; a wartości OD komórek HEPG2 po interwencji przez 48 godzin wynosiły odpowiednio 3,06 ± 0,27, 0,96 ± 0,27, 2,88 ± 0,27, 3,08 ± 0,15, 3,01 ± 0,13 i 0,09 ± 0,22. Nie było istotnej różnicy w wartościach OD komórek HEPG2 po 24 i 48 godzinach interwencji o różnych stężeniach ACT (F =0. 213, 0,213, p =0. 96, 0,36). Patrz Rysunek 2.

Uwaga: A. Komórki Hepg2 traktowano różnymi stężeniami ACT przez 24 godziny; Komórki B. Hepg2 traktowano różnymi stężeniami ACT przez 48 godzin.

Ryc. 2 Wartości OD przy 570 nm po 24 i 48 godzinach leczenia o różnych stężeniach ACT

2.4 Porównanie poziomów TG i barwienia czerwonego O in vitro w modelu NAFLD po interwencji ACT

Poziom TG komórek HEPG2 w grupie modelowej (34,15 ± 1,90) był znacznie wyższy niż w grupie kontrolnej pustej (14,17 ± 2,74) i grupie interwencyjnej ACT (19,11 ± 1,68), a różnice były istotne statystycznie (p istotne statystycznie (p istotne statystycznie (P<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).

Uwaga: A. Poziom TG; B. Red O barwienia O (20 ×); W porównaniu z grupą modelową AP<0.05.
Rycina 3 Porównanie poziomu TG i barwienia czerwonego O w modelu komórek in vitro NAFLD po leczeniu ACT

2.5 Porównanie autofagosomów i kropelek lipidowych Po obróbce ACT w porównaniu z grupą kontrolną ślepą, kropelki lipidów komórek HEPG2 w grupie leczenia rapamycyny i grupy interwencyjnej ACT znacznie wzrosły, a autofagosomy LC3 komórek HEPG2 w grupie interwencji ACT wzrosły znacząco, a kolokalizowały krople lipidowe w przestrzeni przestrzeni. Patrz rysunek 4.

3 Dyskusja

NAFLD jest najczęstszą przewlekłą chorobą wątroby na świecie, odpowiadającą za około 1/4 całkowitej populacji świata i stała się globalnym problemem zdrowia publicznego. Nadużycie jest głównym czynnikiem napędzającym NAFLD. Nadmierne spożywanie składników odżywczych przez komórki wątroby powoduje nadmierne odkładanie tłuszczu w komórkach, prowadząc do reakcji lipotoksycznych, takich jak stres komórkowy (stres oksydacyjny i stres retikulum endoplazmatyczny), aktywacja zapłonowa i fibroza komórkowa [{2 {{2 {{2}. W ostatnich latach badania wykazały, że autofagia odgrywa ważną rolę w zapobieganiu rozwojowi ludzkiego NAFLD. Wyniki wykrywania wskaźnika związanego z autofagią u wątpliwości pacjentów z NAFLD i bezalkoholową chorobą wątroby stłuszczowej oraz wątroby otyłych i wysokotłuszczowych myszy diety wykazały, że proces autofagii w hepatocytach został zablokowany, co doprowadziło do masowej akumulacji wewnątrzkomórkowych TG i innych kropel lipidowych [16]. Inne badania wykazały, że po tym, jak kluczowy gen 7 autofagii hepatocytów został specjalnie znokautowany u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową, poziom TG w mysich hepatocytach znacznie wzrósł [17]. Jednak po nadekspresji genu ATG7 lub interwencji za pomocą induktorów autofagii, takich jak rapamycyna i karbamazepina, zwyrodnienie tłuszczu w wątrobie myszy zostało znacznie zmniejszone [18-20].
Sugeruje to, że zwyrodnienie tłuszczu w wątrobie można znacznie zmniejszyć poprzez poprawę aktywności autofagii wątroby, zapewniając skuteczną strategię leczenia NAFLD. Produkty naturalne, jako główne źródło nowego leku, są szeroko stosowane w zapobieganiu i leczeniu różnych chorób wątroby. Jako doskonały produkt powszechnie stosowany w tradycyjnej medycynie chińskiej, Cistanche Deserticola przyciągnęła powszechną uwagę ze względu na swoje działanie farmakologiczne, takie jak neuroprotekcja, immunomodulacja, przeciwutleniacz, przeciwnowotworowa i ochrona wątroby. Do tej pory izolowano ponad 120 związków z Cistanche Deserticola, w tym glikozydy fenyloetanoidowe, terpenoidy i ich glikozydy, lignany i ich glikozydy, oligosacharydy, poliole i polisacharydy [21]. Wśród nich glikozydy fenyloetanoidowe są najczęściej badaną klasą związków w aktywnych składnikach Cistanche Deserticola. ECH i ACT są reprezentatywnymi związkami glikozydów fenyloetanoidowych Cistanche deserticola, które mają pozytywne działanie w przeciwutleniaczy, chroniąc wątrobę, mięśnia sercowe, komórki nerwowe i wzmacniając pamięć [{2}}]. Jednak w procesie autofagii w ochronie wątroby nie ma jednak istotnej literatury o tym, czy glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche Deserticola są zaangażowane w proces autofagii w ochronie wątroby.

Autofagia jest procesem samozniszczania, który jest wszechobecny w ciele. Jest to proces kataboliczny, w którym autofagosomy degradują komórkowe odpady metaboliczne. Proces autofagii ogólnie obejmuje trzy procesy: inicjację autofagii, autofagiczne przedłużenie błony i tworzenie autofagicznego lizosomu, które są głównie regulowane przez białko docelowe rapamycyny i szlaki sygnalizacyjne kinazy fosfatydyloinozytolu -3. Autofagosomy są markerami autofagii komórkowej. W procesie tworzenia autofagosomów seria białek związanych z autofagią, w tym ATG5 ~ 12 i LC3. Dlatego w tym badaniu skonstruowało system oceny autofagii, wykryło poziom ekspresji białka markera autofagii LC3 na poziomie molekularnym i oceniło zdolność indukcji autofagii dwóch glikozydów fenyloetanoidowych po pustkowisku Cistanche w komórkach HEPG2. Wyniki wykazały, że po dodaniu leczenia BAFA1 na podstawie interwencji rapamycyny induktora autofagii, wewnątrzkomórkowy LC 3- ⅱ komórek HEPG2 znacznie wzrósł, co wskazuje, że system oceny autofagii może dokładnie ocenić indukcję autofagii leków; Po tym, jak ECH i ACT traktowano BAFA1, ekspresja białka LC 3- ⅱ w komórkach HEPG2 w grupie ECH+BAFA1 i grupie ACT+BAFA1 była znacznie wyższa niż w grupie ECH i grupie ACT, a różnice były istotne statystycznie (P były istotne statystycznie (p.<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and wywieranie ochrony wątrobyi inne funkcje biologiczne. Po drugie, bezpieczeństwo jest głównym czynnikiem w opracowywaniu leków. W celu oceny bezpieczeństwa ACT, badanie to dodatkowo przetestowano wpływ ACT na żywotność komórek Hepg2. Wyniki wykazały, że żywotność komórek HEPG2 prawie nie wpłynęła na interwencję z różnymi stężeniami ACT, co wskazuje, że ACT może być stosowany jako kandydujący lek do dalszego badania jego działań farmakologicznych i mechanizmów molekularnych.

Autofagia jest wysoce zachowanym procesem biologicznym w komórkach, a niewielkie zmiany stężeń leku wpłyną na poziom autofagosomów komórkowych. Aby dalej określić optymalne stężenie ACT w celu indukcji tworzenia autofagosomów w komórkach Hepg2, w tym badaniu zastosowano różne stężenie ACT w połączeniu z BAFA1 w celu leczenia komórek Hepg2 i wykryło poziom ekspresji białka LC 3-} ⅱ w komórkach. Wyniki wykazały, że ACT 50 μmol/L może znacznie zwiększyć poziom autofagosomów w komórkach HEPG2. Dlatego w tym badaniu wykorzystano ACT 50 μmol/L w celu interwencji w modelu komórkowym NAFLD skonstruowanym in vitro i wstępnie zbadano związek między jegoOchrona wątrobyFunkcja i autofagia.
Powiązane badania modeli komórek NAFLD wykazały, że po interwencji in vitro z wolnymi kwasami tłuszczowymi poziom TG komórek HEPG2 znacznie wzrósł, a agregację tłustych kropelek lipidów można wyraźnie zaobserwować w komórkach [24-25]. W tym badaniu zastosowano 100 μmol/L PA do interwencji w komórkach Hepg2 in vitro przez 24 godziny. Poziom TG komórek HEPG2 w grupie modelowej był znacznie wyższy niż w grupie kontrolnej pustej. Jednocześnie agregację kropelek lipidów można było wyraźnie zaobserwować w komórkach, co wskazuje, że model komórek NAFLD został pomyślnie skonstruowany. W celu dalszego obserwowania wpływu ACT na model komórek NAFLD, ACT 50 μmol/L zastosowano do interwencji w modelu komórek in vitro NAFLD, a wpływ ACT na NAFLD oceniono przez wykrywanie poziomu TG i barwienie czerwoną O. Wyniki wykazały, że po interwencji ACT poziom TG i liczba tłustych kropel lipidów w komórkach Hepg2 były znacznie niższe niż w grupie modelowej, co wskazuje, że ACT ma aktywność zmniejszania TG w modelu komórek NAFLD indukowanych przez PA. W celu dalszego zbadania związku między aktywnością obniżającą lipidy ACT a autofagią komórkową, w tym badaniu wykorzystano specyficzne przeciwciała białkowe LC 3-} i sondy fluorescencyjne Bodipy, aby wspierać autofagosomy i krople lipidowe. Zaobserwowano, że liczba autofagosomów w komórkach HEPG2 po interwencji ACT była znacznie zwiększona w porównaniu z grupą kontrolną, co było zgodne z wynikami immunoblottingu białkowego w tym badaniu, co dodatkowo potwierdza, że ​​ACT ma aktywność indukującą autofagię w komórkach HEPG2. Ponadto, po interwencji leku, wewnątrzkomórkowe autofagosomy i kropelki lipidowe, co wskazuje, że wpływ ACT na poprawę degeneracji tłuszczowej indukowanej przez PA może obejmować zaangażowanie autofagii komórkowej. Jednak w modelu komórek NAFLD, czy ACT wywiera swoją aktywność farmakologiczną zmniejszania wewnątrzkomórkowego poziomu TG poprzez szlak lipofagiczny, nadal należy wyjaśnić blokowanie procesu autofagii wewnątrzkomórkowej.
Podsumowując, spośród dwóch związków glikozydowych fenyloetanolu Cistanche Deserticola, ACT ma znaczącą zdolność do indukcji autofagii w komórkach HEPG2. Jednocześnie w indukowanym przez PA modelu komórek stłuszczenia wątroby CT znacznie zmniejszył poziom TG w komórkach Hepg2. Po interwencji ACT autofagosomy i kropelki lipidowe w komórkach HEPG2 miały pewien związek kolokalizacji, co wskazuje, że autofagia może być nowym szlakiem związanym z procesem farmakologicznym ACT w zakresie ochrony wątroby. Patrz ryc. 5. W kolejnych badaniach mechanizm działania ACT w obniżaniu lipidów zostanie szczegółowo zbadany przy użyciu blokerów autofagii w celu położenia fundamentu na przyszłe nowe leki.