Badanie wpływu acteozyd (aktywny składnik Cistanche Deserticola) na NAFLD poprzez indukowanie autofagii

Abstrakcyjny:

 

Cel:Aby zbadać funkcję indukującą autofagię aktywnego akteozydu (ACT) w Cistanche Deserticola i jego wpływ na bezalkoholową chorobę wątroby tłuszczowej (NAFLD).

MetodyAby wziąć echinakozyd i działać jako obiekty badawcze, 1 0 0 μmol/l ACT i echinakozyd (ECH) połączono z inhibitorem autofagii-lizosom Bleomycyna A1. Immunoblotting białkowy zastosowano do wykrycia względnego poziomu ekspresji markera autofagii mikrotubuli związanego z białkiem białkowym 1 łańcucha 3 (LC 3- II). Komórki HEPG2 interweniowano z różnymi stężeniami ACT in vitro, a żywotność komórek wykryto za pomocą metody soli tetrazoliowej. Interwencja w witro komórek HEPG2 z różnymi stężeniami ACT w połączeniu z Balofloxacyną A1 i wykrywaniem poziomów ekspresji białka LC 3- II II z użyciem białka białkowego. Model NAFLD skonstruowany in vitro z interwencją leku zastosowano do barwienia kropelek lipidowych przy użyciu metody barwienia czerwonego O i wykrywania poziomów trójglicerydów wewnątrzkomórkowych. Obserwuj lokalizację kropelek białka LC3 i lipidów poprzez technologię immunofluorescencyjną. Wyniki mogą istotnie indukować autofagię w komórkach Hepg2, a poziom ekspresji białka LC 3- II jest znacznie zwiększony w porównaniu z grupą kontrolną (traktowaną samą ACT) (1,36 ± 0. odpowiednio), ze istotnością statystyczną (P0.05). 50 μmol/L działa znacząco indukowane autofagię w komórkach HEPG2, a poziom ekspresji białka LC 3- II był znacznie zwiększony (odpowiednio 1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18). Poziom TG komórek HEPG2 w grupie interwencyjnej ACT (19,11 ± 1,68) był znacznie niższy niż w grupie modelowej komórek in vitro NAFLD (34,15 ± 1,90), a różnice były statystycznie istotne (str.<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Słowa kluczowe:Niealkoholowa choroba wątroby tłuszczowej;Cistanche Deserticola;Acteozyd; Autofagia

 

TCM Herb Cistanche do leczenia bezalkoholowej choroby wątroby (NAFLD)

Kliknij zdjęcie, aby uzyskać więcej szczegółów

 

W ciągu ostatnich kilku dekad tłuszcz bezalkoholowychoroba wątroby(NAFLD) stał się najczęstszymPrzewlekła choroba wątroby, z globalną częstością występowania około 25% dorosłej populacji i jest uważana za ściśle związaną z zespołem metabolicznym [1]. Chociaż prawdopodobieństwo powikłań związanych z wątrobą u pacjentów z NAFLD jest mniejsze niż 10%, NAFLD jest czynnikiem ryzyka chorób związanych z wątrobą, takimi jak marskość wątroby i pierwotny rak wątroby, co nakłada na pacjentów ogromne obciążenie ekonomiczne [2-5}]. Pomimo rosnącej uwagi poświęconej NAFLD, NAFLD jako ważna choroba przewlekła nie zwróciła wystarczającej uwagi. Dlatego dalsze dogłębne zrozumienie patogenezy NAFLD i poszukiwania skutecznych strategii leczenia stały się pilnymi problemami do rozwiązania [6-7].

Ostatnie badania wykazały, że autofagia komórkowa odgrywa ważną rolę w fizjologii i patologii wątroby [8]. Dysfunkcja autofagii lub rozregulowanie jest związane z różnymi chorobami wątroby, takimi jakchoroba wątroby związana z alkoholem[9], NAFLD [10], bezalkoholowe zapalenie stłuszczeni [11] i rak wątrobowokomórkowy [12]. Patologicznymi cechami NAFLD są nadmierne odkładanie trójglicerydów (TG) i innych neutralnych kropelek lipidowych (LD) w hepatocytach przy stymulacji bezalkoholowej. W przypadku wątroby dwa główne szlaki regulujące katabolizm tych LDS to lipoliza i autofagia.
Szlak lipolizy jest regulowany przez cytoplazmatyczne lipazy neutralne, takie jak lipaza wrażliwe na hormony i lipaza TG. W odpowiednim szlaku lipoautofagii LDS można selektywnie pobierać przez bezpośrednio rekrutację białek związanych z autofagią z tworzeniem autofagosomów, a następnie LD kapsułkowane przez autofagosomy są dalej dostarczane do lizosomów i rozkładane przez lipazy kwasowe w liposomach. Dlatego aktywacja lipautofagii w hepatocytach stała się skuteczną strategią zapobiegania i leczenia NAFLD.
Cistanche Deserticola to cenna chińska medycyna ziołowa, która była szeroko stosowana w praktyce klinicznej w tradycyjnych formułach medycyny chińskiej. Jednocześnie od dawna jest stosowany jako suplement zdrowia żywności. Cistanche Deserticola zawiera różnorodne składniki bioaktywne, z których najważniejszym są glikozydy fenyloetanolu Cistanche Deserticola. Jako przedstawiciele glikozydów fenyloetanoidowych, echinakozyd (ECH) i werbasków (ACT) mają wiele ważnych czynności biologicznych, takich jak przeciwutleniacz, neuroprotekcja, immunomodulacja i ochrona wątroby [13]. Jeśli chodzi o ochronę wątroby, badania wykazały, że ECH może chronić wątrobę poprzez zmniejszenie zapalnych mediatorów, hamując transformację czynnika wzrostu i zmniejszenie poziomu ekspresji genów związanych z zwłóknieniem wątroby. ACT ma znaczący wpływ ochronny na uszkodzenie wątroby wywołane chemicznie i leki, takie jak alkohol, tetrachlorowodorek węgla i lipopolisacharyd. ACT zmniejsza stres oksydacyjny spowodowany toksycznymi chemikaliami, usuwa reaktywny tlen zgromadzony w wątrobie i zmniejsza stężenie malondialdehydu. Jednocześnie znacznie zwiększa aktywność dysmutazy nadtlenkowej wątroby i zmniejsza zawartość glutationu oraz znacznie poprawia uszkodzenie histopatologiczne i apoptozę wątroby. Jednak nie ma istotnej literatury o tym, czy glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche Deserticola są zaangażowane w proces autofagii w zakresie ochrony wątroby. Na tej podstawie w tym badaniu wykorzystano konwencjonalne metody biologii komórek i model komórek in vitro do wstępnego zbadania indukującego autofagią efektu glikozydów fenyloetanoidowych Cistanche Deserticola i badało jego możliwe funkcje farmakologiczne, dążąc do zapewnienia naukowego podstaw dla rozwoju leku.

 

1 Materiały i metody

1.1 Materiały

1.1.1 Badawcy ECH i ACT zastosowano jako osoby badawcze.

1.1.2 Materiały Komórki HEPG2 zakupiono od Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (numer partii: B21209) i ACT (numer partii: B20715, czystość HPLC Większa niż 98%) Zakupiono od Buffer Shanghai Yuanye Biological Company, DMEM High Glukozo zakupiono od Hyclone Company, USA, płodowej surowicy bydlęcej (numer partii: 04-002-1 a) zakupiono od BI Company, Israel, penicylinę/streptomycynę (numer partii: SV30010.01) zakupiono od Hyclone Company, USA, MTT (numer partii: M8180) proszek został zakupiony przez Soleba, China, Chiny, TG (Batch (Batch (Batch (Batch (Batch (Batch (Batch. Liczba: BC0625) Zestaw wykrywania został zakupiony od Solebao Company, Pekin, Chiny, Oil Red O (Numer partii: O 0625-100 g), Dimetylosulfotlenek (numer partii: BCBZ1685) zakupiono od Sigma-Aldrich, USA; Inhibitor autofagii-lysosomów Bafilomycyna A1 (BAFA1, numer partii: TLRL-BAF1) zakupiono od Invitrogen, USA; Rapamycyn aktywatora autofagii (numer partii: S17098) został zakupiony od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Chiny; łańcuch lekkiego białka związany z mikrotubulami 1 (LC3, numer partii: L7543, gatunek: królik, stosunek rozcieńczenia: 1: 1 000) i -ctin (liczba partii: Zrb1312, gatunek: królik, stosunek rozcieńczenia: 1: 5 000) Zakupione od Sigma-aldrich, USA; Wtórne przeciwciało z peroksydazą chrzanową (numer partii: 4010-05, gatunek: kozie anty-królowe, wskaźnik rozcieńczenia: 1: 1 000) zakupiono od południowego biotechnologii, amerykańska firma, Alexa fluor fluorescencyjna fluorescencyjna z oznaczonej przez fluorescencyjną fluorescencyjną przeciwciała z fluorescencyjnego fluorescencyjnego z Alexa Fluorescencyjna fluorescencyjna przeciwciała fluorescencyjna z fluorescencyjną fluorescencyjną. Sigma-Aldrich Company, USA i Bodipy 493/501 (numer partii: D3922) zakupiono od Invitrogen Company, USA.

 

1.2 Metody

1.2.1 Kultura komórkowa

Komórki HEPG2 hodowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny i 100 g/ml streptomycyny w 37 -stopniowym inkubatorze dwutlenku węgla. Gdy zbieżność komórkowa osiągnęła 85%, przeprowadzono subkulturę, poszycie, interwencję i inne operacje.

 

1.2.2 Wykrywanie immunoblottingu białkowego

1.2.2.1 Akt i ECH leczenie

LC 3- ⅱ Poziom ekspresji białka w komórkach HEPG2 BAFA1, jako inhibitor pompy protonowej, może powodować, że białko LC 3- ⅱ agregują się w dużych ilościach w komórkach, wzmacniając w ten sposób zdolność indukcji autofagii. Dlatego połączone zastosowanie BAFA1 może być wykorzystane jako system monitorowania autofagii do oceny zdolności indukcji autofagii. Komórki HEPG2 w logarytmicznej fazie wzrostu przeniesiono na 3,5 cm naczyń hodowlanych komórkową dla hodowli nocnej. 100 μmol/L ACT, ECH i BAFA1 zastosowano do interwencji przez 12 godzin. Komórki przemyto wstępnie chłodzonym roztworem buforu fosforanowego (PBS) i natychmiast lizowano w buforze lizy białka RIPA przez 10 minut. Supernatant odwirowano i całkowitą stężenie białka określono za pomocą zestawu testu stężenia białka kwasu bicynchoninowego. Po kwantyfikacji za pomocą buforu dodecylulfanowego sodu próbka ogrzewano w 95 stopnie przez 10 minut w celu denatury białka. Następnie pobrano 30 μl próbki z mikropipetą i elektroforezem na żelu poliakryloamidowym.
Po elektroforezie białko przeniesiono z żelu na błonę nitrocelulozową, zablokowano mlekiem 1 0 przez noc, inkubowano ze specyficznym pierwotnym przeciwciałem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, przemyto buforem fosforanowym zawierającym 0,5% trytonem Triton i inkubowano z określonym drugorzędnym przeciwciałem w temperaturze pokojowej dla 1 hy. Do rozwoju kolorów zastosowano metodę ECL. Zostały one ustawione jako puste grupa kontrolna, grupa rapamycyny, grupa ECH, grupa ACT, Rapamycyna+BAFA1 Group, Ech+Bafa1 Group i Act+Bafa1 Group.

 

1.2.2.2 Różne stężenia ACT interweniowały poziom ekspresji białka LC 3- ⅱ w komórkach Hepg2

Logarytmiczną fazę wzrostu komórki Hepg2 przeniesiono na 3,5 cm naczyń hodowlanych komórkową dla hodowli nocnej, a 25, 50 i 100 μmol/l ACT w połączeniu z BAFA1 zastosowano do interwencji przez 12 godzin, a poziom ekspresji LC 3-} wykryto przez białko białko. Grupa kontrolna (Con Group, Contain Control), Grupa Starvation (Grupa STA, komórki HEPG2 Traktowanie głową), 25, 50 i 100 μmol/l Grupa ACT oraz BAFA1 w połączeniu z grupą 25, 50 i 100 μmol/L ACT.

1.2.3 Metoda MTT w celu wykrycia wskaźnika przeżycia komórek Hepg2 traktowanych różnymi stężeniami ACT przez 24 i 48 godzin
Komórki HEPG2 w logarytmicznej fazie wzrostu zaszczepiono w płytce studzienkowej 96- z umiarkowaną gęstością zaszczepienia i hodowano w inkubatorze przez 12 godzin. 2 0, 40, 60, 80 i 100 μmol/L ACT dodano przez 24 i 48 godzin. 0,5 mg/ml roztworu MTT dodano w ciemnym środowisku i inkubowano w inkubatorze. Po 4 godzinach supernatant odrzucono, do każdej studzienki dodano 100 μl dimetylosulfotlenku, a komórki wstrząsano w stałej wytrząsarce temperaturowej w 37 stopnie przez 10 minut. Wartość gęstości optycznej (OD) przy długości fali 490 nm wykryto za pomocą markera enzymu i obliczono szybkość przeżycia komórek.

 

1.2.4 Konstrukcja in vitro modelu komórek NAFLD

Pewna waga kwasu palmitynowego (PA) zważono i w pełni rozpuszczono w pewnej objętości izopropanolu w celu przygotowania roztworu podstawowego 100 mmol/l PA, który następnie podzielono i przechowywano w lodówce -20 do późniejszego użycia. Roztwór podstawowy PA rozcieńczono do 100 μmol/L przy użyciu całkowitej pożywki hodowlanej i dodano 1% albuminy bez kwasu bezkwasowego surowicy. Komórki inkubowano w 37 stopnie przez 3 godziny w celu przygotowania roztworu indukcyjnego. Komórki HEPG2 w logarytmicznej fazie wzrostu przeniesiono na 3,5 cm hodowlą komórkową z odpowiednią gęstością dla hodowli nocnej, a następnie przygotowano roztwór indukcyjny do interwencji.

 

1.2.5 Interwencja ACT NAFLD Model komórki in vitro wykrywanie TG i barwienie czerwonym olejem O

 

1.2.5.1 Wykrywanie TG

Komórki HEPG2 w logarytmicznej fazie wzrostu przeniesiono na 3,5 cm do hodowli hodowli według hodowli według grupy kontrolnej pustej, grupy modelowej i grupy interwencyjnej ACT. Grupę modelową indukowano roztworem indukcyjnym 100 μmol/L PA, a grupę interwencyjną ACT indukowano za pomocą roztworu indukcyjnego 100 μmol/L PA i dodano jednocześnie ACT 50 μmol/L. Czas interwencji wynosił 24 godziny. Delikatnie usuń starą pożywkę hodowlaną, powoli umyj powierzchnię komórki wstępnie chłodzonym PBS, dodaj 100 μl/naczynie wstępnie chłodzonego roztworu lizy RIPA, w pełni lyse na lodzie przez 15 minut, odśrodkowe w wysokości 4 stopni i 12 000 r/min przez 10 minut, zbieraj supernatant, weź supernatant, Zbierz supernatantu, weź 10 μl detekcji enzymatycznej TG, weź kolejne 10 «12 000 R/min, aby wykryć supernatant. Instrukcje zestawu TG i na koniec poprawić poziom TG na mg białka.

1.2.5.2 Red O Barwienie

Komórki HEPG2 w logarytmicznej fazie wzrostu przeniesiono na 3,5 cm naczynia hodowlane pokryte sterylnym szkiełka nakrywkowym do hodowli nocnej. 100 μmol/l PA indukowało komórki z tworzeniem kropelek lipidowych. W tym samym czasie dodano 50 μmol/L ACT dla interwencji przez 24 godziny.
Szkiełka komórkowe zebrano, przemyto 3 razy wstępnie chłodzonym PBS, utrwalono 4% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 10 minut, umyto powierzchnię komórki PBS, dodano przygotowany roztwór roboczy oleju O, wybarwiono w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut, aspirował roztwór barwiony oleju O, roztworu O, i umył roztwór nadmiernego zabarwienia. i sfotografowane pod mikroskopem.

 

1.2.6 Obserwacja immunofluorescencji autofagosomów i kropel lipidów po obróbce ACT

Komórki HEPG2 w logarytmicznej fazie wzrostu przeniesiono na 3,5 cm naczynia hodowlane pokryte sterylnym szkiełka nakrywkowym do hodowli nocnej. 1 0 0 μmol/L PA zastosowano do indukcji tworzenia kropel lipidów w komórkach. Jednocześnie dodano ACT w celu leczenia interwencyjnego przez 24 godziny. The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed at room temperature for 10 min with 4% formaldehyde, permeabilized at room temperature for 15 min with a permeabilization buffer containing 0.1% saponin, blocked at room temperature for 1 h with goat serum, incubated at room temperature for 1 h with LC3-specific primary antibody, washed 3 times with PBS, and added with Specyficzne wtórne przeciwciało znakowane fluorescencją, inkubowane w temperaturze pokojowej i z dala od światła przez 1 godzinę. Po inkubacji przeciwciała szkiełka przemywano 3 razy PBS, kontrastowo sprzetany sondy specyficzne dla kropli lipidowej bodyppy 493/503 w temperaturze pokojowej przez 10 minut, przemyto PBS i zapieczętowano podłożem uszczelniającym, suszone w ciemności, obserwowane z mikroskopem konfokalnym lasera i rejestrowano. Założono grupę kontrolną pustej grupy leczonej rapamycyny i grupa interwencyjna ACT.

 

1.3 Analiza statystyczna

SPSS25. 0 Oprogramowanie statystyczne zostało wykorzystane do analizy danych. Dane ilościowe wyrażono jako x ± s. Zastosowano jednokierunkową analizę wariancji i testu LSD-T. P<0.05 was considered statistically significant.