Swertiajaponin hamuje pigmentację skóry za pomocą podwójnych mechanizmów tłumienia tyrozynazy, część 2

Cistanchejest pospolitym ziołem znanym jako „cudowne zioło przedłużające życie”. Jego głównym składnikiem jest cistanozyd, który ma różne działanie, takie jak przeciwutleniacz, działanie przeciwzapalne i promowanie funkcji odpornościowych. Mechanizm między cistanche a wybielaniem skóry polega na działaniu przeciwutleniającym glikozydów cistanche.

Melanina w skórze człowieka powstaje w wyniku utleniania tyrozyny katalizowanego przez tyrozynazę, a reakcja utleniania wymaga udziału tlenu, dlatego wolne rodniki tlenowe w organizmie stają się ważnym czynnikiem wpływającym na produkcję melaniny.Cistanchezawiera cistanozyd, który jest przeciwutleniaczem i może ograniczać wytwarzanie wolnych rodników w organizmie, hamując w ten sposób produkcję melaniny.

Kliknij Cistanche Tubulosa, aby poprawić wybielanie skóry

Zapytaj o więcej:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ponadto,cistanchema również funkcję promowania produkcji kolagenu, co może zwiększyć elastyczność i połysk skóry oraz pomóc w naprawie uszkodzonych komórek skóry.

CistancheGlikozydy fenyloetanolu mają znaczący wpływ obniżający aktywność tyrozynazy, a wpływ na tyrozynazę jest kompetycyjnym i odwracalnym hamowaniem, co może stanowić podstawę naukową do opracowania i wykorzystania składników wybielających w Cistanche.

Dlatego,cistancheodgrywa kluczową rolę wWybielanie skóry. Może hamować produkcję melaniny, aby zmniejszyć przebarwienia i matowość; i promować produkcję kolagenu, aby poprawić elastyczność i blask skóry. Ze względu na powszechne uznanie tych efektów cistanche, wiele produktów wybielających skórę zaczęło dodawać składniki ziołowe, takie jak Cistanche, aby zaspokoić zapotrzebowanie konsumentów, zwiększając w ten sposób wartość handlową Cistanche w produktach wybielających skórę.

Podsumowując, rola cistanche w wybielaniu skóry jest kluczowa. Jego działanie przeciwutleniające i działanie produkujące kolagen może zmniejszyć przebarwienia i matowość, poprawić elastyczność i blask skóry, a tym samym osiągnąćefekt wybielania. Również szerokie zastosowanie Cistanche w produktach do wybielania skóry pokazuje, że nie można lekceważyć jego roli w wartości handlowej.

Swertiajaponina hamuje aktywację MAPK wywołaną przez UVB

Wykazano, że stres oksydacyjny stymuluje melanogenezę poprzez regulację w górę czynnika transkrypcyjnego związanego z mikroftalmią (MITF), czynnika transkrypcyjnego indukującego ekspresję genu tyrozynazy [4, 14]. Zbadaliśmy, czy przeciwutleniające działanie swertiajaponiny może regulować aktywność MITF. Dane Western blotting wykazały, że ekspozycja na UVB zwiększała fosforylowany MITF, aktywną postać MITF, podczas gdy traktowanie swertiajaponiną przy 10 μM zmniejszało ją (ryc. 6A). Konsekwentnie, pośredniczony przez UVB wzrost poziomu białka tyrozynazy został zmniejszony przez traktowanie swertiajaponiną (ryc. 6A). Ponieważ wykazano, że stres oksydacyjny aktywuje MITF poprzez kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK) [15, 16], zbadano, czy swertiajaponina może kontrolować sygnalizację MAPK. Ekspozycja na promieniowanie UVB radykalnie zwiększyła fosforylację ERK, JNK i p38 (ryc. 6B), co jest związane z indukowaną przez UVB produkcją ROS i ONOO- w komórkach B16F10 (ryc. 5C{17}}D). Leczenie Swertiajaponin tylko przy 10 μM zmniejszyło poziomy białka w MAPK (ryc. 6B). Wynik ten jest zgodny z przeciwutleniającą aktywnością swertiajaponiny, ponieważ spadek komórkowego stresu oksydacyjnego indukowanego UVB był wyraźny tylko przy 10 μM swertiajaponiny (ryc. 5C{23}}D).

Chociaż swertiajaponina jest głównym związkiem całego ziela Swertia japonica, które było stosowane jako lek japoński, nasze badanie nie wykazało rozstrzygających dowodów na bezpieczeństwo stosowania swertiajaponiny na ludzką skórę. Jednak swertiajaponina nie wykazywała cytotoksyczności w liniach komórkowych Hs27 (ludzki fibroblast), HaCat (ludzki keratynocyt) i B16F10 (mysi czerniak) w naszych warunkach eksperymentalnych. Co więcej, na podstawie obserwacji mikroskopowych nie stwierdzono widocznych oznak cytotoksyczności, w tym tworzenia się szczątków komórek lub oddzielania się komórek, gdy swertiajaponina była traktowana w modelu ludzkiej skóry w stężeniach, które nie wykazywały cytotoksyczności w liniach komórkowych. Biorąc pod uwagę, że kwestie bezpieczeństwa są głównymi problemami obecnie dostępnych związków wybielających skórę, potrzebne są dalsze badania in vivo w celu zbadania ich bezpieczeństwa w fizjologii.

Razem swertiajaponina hamowała akumulację melaniny do zadowalającego limitu zarówno w modelach komórkowych, jak i ludzkiej skóry, poprzez podwójne mechanizmy tłumienia tyrozynazy poprzez bezpośrednie wiązanie i konkurencyjne hamowanie tyrozynazy oraz tłumienie sygnalizacji MAPK / MITF za pośrednictwem stresu oksydacyjnego (ryc. 7). Biorąc pod uwagę niekorzystne skutki i brak długoterminowej skuteczności znanych środków wybielających skórę, takich jak kwas kojowy i arbutyna [17], swertiajaponina może być bezpieczniej stosowana w celu zahamowania pigmentacji skóry i byłaby nowym dodatkiem do kosmetyków wybielających.

MATERIAŁY I METODY

Test aktywności tyrozynazy przy użyciu tyrozynazy grzybowej

Swertiajaponin i kwas kojowy (50 μM) załadowano do mikropłytki 96- (Nunc, Dania) w buforze tyrozynazy (200 μl) zawierającym grzybową tyrozynazę (1000 U), 1 mM roztwór L-tyrozyny i 50 mM fosforan bufor (pH 6,5) [5]. Płytkę inkubowano w 37 stopniach przez 15 minut i oceniano dopachinon za pomocą spektrofotometrii (450 nm). Na podstawie pomiaru obliczono IC50 stosując krzywe logarytmiczno-liniowe i ich równania.

Symulacja dokowania swertiajaponiny i tyrozynazy

AutoDock Vina został użyty do symulacji dokowania białka i liganda in silico. Trójwymiarową strukturę tyrozynazy wykorzystano w strukturze krystalicznej Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X). Predefiniowane miejsce wiązania tyrozyny zastosowano jako kieszeń dokującą. Po przeprowadzeniu symulacji dokowania między tyrozynazą i swertiajaponiną lub kwasem kojowym, oprogramowanie LigandScout 3. 0 zastosowano do przewidywania reszt wiążących między różnymi związkami i tyrozynazą.

Analiza kinetyczna hamowania tyrozynazy przez swertiajaponinę

L-DOPA przygotowano w stężeniach 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 i 0,0625 mM, a swertiajaponina przygotowano przy 20, 40 i 80 μM. Roztwór mieszaniny reakcyjnej przygotowano w 96-płytce z dołkami, w której umieszczono 20 μl substratu tyrozynazy (L-DOPA), 10 μl wodnego roztworu grzybowej tyrozynazy (200 U) i 50 mM bufor fosforanu potasu (pH 6.5) zostały dodane. Szybkość wytwarzania dopachromu w mieszaninie reakcyjnej mierzono przy długości fali 450 nm stosując czytnik mikropłytek. Szybkość hamowania tyrozynazy przez swertiajaponinę została następnie obliczona przy użyciu analizy wykresów Lineweavera-Burka. Stałą Michaelisa (Km) i prędkość maksymalną (Vmax) obliczono również za pomocą wykresów Lineweavera-Burka przy różnych stężeniach substratu L-DOPA [3].

Hodowla komórkowa i test żywotności

Komórki czerniaka B16F10 zakupiono z Korea Cell Line Bank. Komórki hodowano w zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywce Eagle'a (DMEM) z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny, streptomycyny, L-glutaminy i pirogronianu sodu. Komórki utrzymywano w 37 stopniach w nawilżonej atmosferze 95% powietrza/5% CO2. W teście żywotności komórek komórki wysiano na płytkach 96-dołkowych. Komórki czerniaka B16F10 traktowano swertiajaponiną w różnych stężeniach przez 48 godzin. Do każdej studzienki dodano Ez-Cytox (10 μl) i inkubowano przez 2 godziny. Utworzone kryształy formazanu mierzono spektrofotometrycznie przy 450 nm. Żywotność komórek obliczono stosując jako grupę kontrolną komórki bez traktowania swertiajaponiną.

Zawartość melaniny w komórkach B16F10

Poziom melaniny mierzono metodą opisaną wcześniej z niewielkimi modyfikacjami [18]. Komórkom B16F10 pozwolono na wzrost do 70-80 procentowej konfluencji w 6- studzienkowych płytkach. Komórki traktowano wstępnie swertiajaponiną lub kwasem kojowym przez 2 godziny. Następnie MSH lub UVB potraktowano pożywką zawierającą swertiajaponinę lub kwas kojowy i inkubowano przez kolejne 48 godzin. Po przemyciu PBS komórki oddzielono za pomocą trypsyny i rozpuszczono w 90 μl 1 N roztworu NaOH zawierającego DMSO (5 procent). Po inkubacji w 60 stopniach przez 1 godzinę zawartość melaniny oznaczono mierząc absorbancję przy 405 nm. Do ekspozycji komórek B16F10 na promieniowanie UVB zastosowano dostępną w handlu komorę UV (Boteck UV X{16}}, UV-AB, LAB24, Korea).

Western blotting

Próbki białka wyizolowane z komórek B16F1 0 (30 μg) rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylu sodu przy użyciu 10-12 procent żeli akryloamidowych i przeniesiono na membrany z fluorku poliwinylidenu, które następnie natychmiast umieszczono w buforze blokującym ( 5 procent odtłuszczonego mleka) w 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl i 0,1 procent Tween 20. Membranę przemyto w buforze TBS-Tween przez 30 minut, a następnie inkubowano ze swoistymi przeciwciałami pierwotnymi (1: 1 { {24}} rozcieńczenie) wskazane w legendach rysunków w temperaturze 4 stopni przez noc. Po przemyciu buforem TBS-Tween błonę inkubowano z przeciwciałem antymysim sprzężonym z peroksydazą chrzanową (Santa Cruz, 1:10, 000), przeciwciałem przeciwkróliczym (Santa Cruz, 1:10, 000) lub przeciwciałem antykozim (Santa Cruz, 1:10 000) w temperaturze 25 stopni przez 1 godzinę. Immunobloty wizualizowano przy użyciu roztworu Western Bright Peroxide (Advansta, CA, USA) i systemu obrazowania ChemiDoc Touch (Bio-Rad, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. W tym badaniu zastosowano następujące przeciwciała: p-CREB (Santa Cruz{37}}), CREB (Santa Cruz-81486), tyrozynaza (Cell Signaling-104976), pMITF (Abcam{40 }}), MITF (Abcam{41}}), p-p38 (sygnalizacja komórkowa-921L), p38 (sygnalizacja komórkowa-9212S), pERK (sygnalizacja komórkowa-4370L ), ERK (sygnalizacja komórkowa-9201L), pJNK (sygnalizacja komórkowa-9251L), JNK (sygnalizacja komórkowa-9252S) i -actin (Santa Cruz-47778) .

Pomiar poziomów ROS i ONOO-

Aktywność przeciwutleniającą swertiajaponiny badano przy użyciu fluorescencyjnego dioctanu 2,7-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFDA) dla ROS i dihydrorodaminy (DHR) 123 dla ONOO-. Pokrótce, w celu określenia poziomu ROS, DCFDA (25 μM) dodano do homogenatów komórkowych do końcowej objętości 250 ul. Aby zmierzyć poziom ONOO, 10 ul homogenatów komórek dodano do roztworu rodaminy (50 mM bufor fosforanu sodu, 90 mM chlorek sodu, 5 mM kwasu dietylenotriaminopentaoctowego [DTPA] i DHR123). W obu testach fluorescencję mierzono co 5 minut przez 30 minut na fluorescencyjnym czytniku płytek, przy długościach fal wzbudzenia i emisji ustawionych odpowiednio na 485 i 530 nm.

Akumulacja melaniny w modelu ludzkiej skóry

Żywy, odtworzony, trójwymiarowy ludzki naskórek (Neoderm-ME, Tego Science) wykorzystano do zbadania przeciwmelanogennego działania swertiajaponiny na modelu ludzkiej skóry. Model ludzkiej skóry traktowano wstępnie DMSO (nośnik) lub swertiajaponiną przez 1 godzinę i hodowano w pożywce podtrzymującej dostarczonej przez firmę przez 5 dni z traktowaniem DMSO lub swertiajaponiną. Analizę mikroskopową przeprowadzono od dnia 1 do dnia 5 w celu zaobserwowania pigmentacji skóry. Obrazy mikroskopowe analizowano za pomocą oprogramowania Image J w celu półilościowego określenia ciemnienia skóry. W przypadku barwienia metodą Fontana-Masson próbki skóry utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze pokojowej, a próbki analizowano przez firmę dostępną na rynku (Garam Meditech, Korea Południowa).

Analiza statystyczna

Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Różne grupy porównano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji, a następnie post-testu Dunnetta. P < 0, 05 uznano za istotne statystycznie.

KONFLIKT INTERESÓW

Brak konfliktów interesów do zadeklarowania.

FINANSOWANIE

Ta praca była wspierana przez Grant K17281 z Koreańskiego Instytutu Medycyny Orientalnej, Ministerstwa Edukacji, Nauki i Technologii (MEST), Republika Korei.

BIBLIOGRAFIA

1. Bradford PT. Rak skóry w kolorze skóry. Pielęgniarki Dermatol. 2009; 21: 170-7, 206.

2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Chemiczne i instrumentalne podejście do leczenia przebarwień. Komórki Pigmentu Res. 2003; 16: 101-10.

3. Kang KH, Lee B, Son S, Yun HY, Moon KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Moon HR, Chung HY. (Z)-2-(benzo[d]tiazol{2}}ylamino)-5- (podstawione benzylideno)tiazol-4(5H)-onowe pochodne jako nowe inhibitory tyrozynazy. Biol Pharm Bull. 2015; 38: 1227-33.

4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P i in. (Z)-5-(2,4-dihydroksybenzylideno)tiazolidyna- 2,4-dion zapobiega melanogenezie wywołanej promieniowaniem UVB i powstawaniu zmarszczek poprzez tłumienie stresu oksydacyjnego w HRM{{7} } bezwłose myszy. Oxid Med Cell Longev. 2016; 2016: 2761463.

5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR i in. Kwas (2R/S,4R)-2-(2,4-dihydroksyfenylo)tiazolidyno{6}}karboksylowy zapobiega powstawaniu zmarszczek wywołanych promieniowaniem UV poprzez hamowanie stanu zapalnego, w którym pośredniczy NF-kappaB. J Dermatol Sci. 2015; 79: 313-6.

6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Flavonols z Heterotheca obejmuje: aktywność hamującą tyrozynazę i kryteria strukturalne. Bioorg Med Chem. 2000; 8: 1749-55.

7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Identyfikacja reszt miejsc aktywnych zaangażowanych w wiązanie kofaktora metalu i rozpoznawanie stereospecyficznego substratu w tyrozynazie ssaków. Implikacje dla cyklu katalitycznego. Biochemia. 2002; 41: 679-86.

8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flawonoidy jako grzybowe inhibitory tyrozynazy: badanie wygaszania fluorescencji. J Rolnictwo Chem. 2006; 54: 935-41.

9. Orhan IE, Khan MT. Pochodne flawonoidów jako silne inhibitory tyrozynazy - przegląd ostatnich odkryć między 2008-2013. Curr Top Med Chem. 2014; 14: 1486-93.

10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Badania nad składnikami Swertia japonica. II. Izolacja i struktura nowego flawonoidu, swertiajaponiny. Chem Pharm Bull (Tokio). 1967; 15: 1567-72.

11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Wpływ ekstraktu Swertia japonica i jego głównego związku swertiamaryny na opróżnianie żołądka i motorykę przewodu pokarmowego u myszy. Fitoterapia. 2011; 82: 827-33.

12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. Hamujący wpływ 2-metylo-nafto[1,2,3-de]chinoliny-8-on na transport melanosomów i pigmentację skóry. Przedstawiciel nauki 2016; 6: 29189.

13. Cotelle N. Rola flawonoidów w stresie oksydacyjnym. Curr Top Med Chem. 2001; 1: 569-90.

14. Sim MO, Ham JR, Lee MK. Młode liście trzciny pospolitej (Phragmites communis) hamują melanogenezę i stres oksydacyjny w komórkach czerniaka B16F10. Firma Biomed Pharmacother. 2017; 93: 165-71.

15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Szlaki sygnałowe w melanogenezie. Int J Mol Sci. 2016; 17.

16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. Dihydromyricetyna z Ampelopsis grossedentata hamuje melanogenezę poprzez regulację w dół szlaków sygnałowych MAPK, PKA i PKC. Chem Biol Interact. 2016; 258: 166-74.

17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Wyciąg z grzybni Ganoderma formosanum jako bardzo silny inhibitor tyrozynazy. Przedstawiciel nauki 2016; 6: 32854.

18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP{1}} stymuluje ekspresję genu tyrozynazy i melanogenezę w zróżnicowanych melanocytach. Komórki Pigmentu Res. 2001; 14: 328-36.