Analiza systemowa VEGFA w raku nerkowokomórkowym: ekspresja, rokowanie, sieć regulacji genów i cele regulacji

edmund.chen@wecistanche.com

Wstęp

Rak nerkowokomórkowy (RCC), najczęstszy nowotwór złośliwy wnerka, jest jednym z 10 najczęstszych nowotworów na świecie.1 Jest przyczyną około 330000 przypadków raka na całym świecie i ponad 140000 zgonów rocznie.2 Wśród heterogenicznych podtypów RCC,nerka nerkowyrak brodawkowaty (KIRP) zajmuje drugie miejsce pod względem zachorowalności, stanowiąc 10–15 procent RCC, ponerka nerkowarak jasnokomórkowy (KIRC) z częstością występowania 75% –80% 0,3Nerkachromofob (KICH) to rzadki podtyp RCC, stanowiący około 4–5 procent RCC.4 Zaawansowany RCC to choroba śmiertelna, z 5-rocznym wskaźnikiem przeżycia wynoszącym zaledwie 11,7%.5 Operacja i terapia celowana są podstawowymi klinicznymi metodami terapeutycznymi dla RCC.6 Odpowiednie badania kliniczne wykazały, że stosowanie inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych w połączeniu z lekami antyangiogennymi jest bardziej skuteczne klinicznie u pacjentów z RCC.7,8 Jednak nowe metody oparte na immunoterapii również stoją przed wieloma wyzwaniami w zastosowaniu klinicznym. Istnieje pilna potrzeba określenia bardziej obiecujących celów terapeutycznych i podejść do leczenia RCC.

Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGFA), krytyczny czynnik angiogenny, jest ważnym czynnikiem specyficznym dla nowotworu u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym i odgrywa kluczową rolę w angiogenezie i progresji nowotworu.9 VEGFA indukuje adhezję i migrację komórek nowotworowych poprzez wiązanie z integryną 9 1.10 Kilka inhibitorów VEGFA jest użytecznych klinicznie.11,12 Sunitynib, nienaczyniowy inhibitor kinazy tyrozynowej VEGF, został zatwierdzony do leczenia pierwszego i drugiego rzutu zaawansowanego RCC. Jednak sunitynib może potencjalnie powodowaćuszkodzenie nereki zaburzenia sercowo-naczyniowe.11 Chociaż uważa się, że VEGFA jest istotnym czynnikiem specyficznym dla nowotworu u pacjentów z RCC, poziom ekspresji, sieć regulacji genów, wartość prognostyczna i cel regulacji VEGFA u pacjentów z heterogenicznymi podtypami RCC (KIRC, KICH, i KIRP) pozostają niewyjaśnione. Dlatego konieczne jest uzyskanie bardziej przydatnych informacji na temat związku między ekspresją VEGFA a występowaniem RCC. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy wiele bezpłatnych internetowych baz danych, aby zidentyfikować poziom ekspresji, sieć regulacji genów, wartość prognostyczną i cel regulacji VEGFA u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym. Ponadto badanie to miało na celu dalsze zbadanie związku między ekspresją VEGFA a występowaniem RCC oraz dostarczenie nowych informacji na temat docelowego leczenia pacjentów z RCC.

Słowa kluczowe:Rak nerkowokomórkowy, rak jasnokomórkowy nerki, chromofob nerki, rak nerkowokomórkowy nerki, VEGFA, sieć regulacji genów, przewidywanie celu

CISTANCHE POPRAWI CHOROBY NEREK/NEREK

Materiały i metody

Analiza UALCANUALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html) to internetowa baza danych wykorzystywana jako narzędzie do ekspresji genów podgrup guzów i analiz przeżycia.13,Do analizy danych dotyczących ekspresji genu TCGA zastosowano moduł „Analiza ekspresji” bazy danych ALCAN, a kryteria przesiewowe ustalono w następujący sposób: (a) gen: VEGFA; b) zbiór danych: KIRC, KICH i KIRP; c) warunki ustalania wartości progowych: wartość odcięcia P =0,05. Do analizy porównawczej wykorzystano test t-Studenta.Analiza profilowania ekspresji genówAnaliza profilowania ekspresji genów (GEPIA) (http://gepia.Cancer-pku.cn/index.html) to bezpłatna platforma internetowa, która dostarcza dane dotyczące ekspresji sekwencjonowania RNA z 9736 guzów i 8587 normalnych próbek do analizy14 różnicowej ekspresji mRNA, metylacji promotora, stadium patologicznego i prognozy korelacyjnej w tym badaniu. Kryteria przesiewowe były następujące: (a) gen: VEGFA; b) zbiór danych: KIRC, KICH i KIRP; c) warunki ustalania wartości progowych: odcięcie wartości P =0,05. Do analizy ekspresji VEGFA i stadium patologicznego RCC wykorzystano test t-Studenta. Do analizy rokowania chorych na RCC wykorzystano krzywą Kaplana-Meiera.cBioPortal analizacBioPortal (http://cbioportal.org) to otwarta internetowa baza danych wykorzystywana do wizualizacji, badania i analizy danych genetycznych dotyczących raka.15 W naszym badaniu analiza zmian genetycznych VEGFA i sąsiadujących z nim genów (pięć najważniejszych {{ 9}} zmienione sąsiednie geny VEGFA) przeprowadzono przy użyciu bazy danych cBioPortal. Kryteria przesiewowe były następujące: (a) przeanalizowano 446, 66 i 274 próbki odpowiednio KIRC, KICH i KIRP; (b) wyniki z-score ekspresji mRNA w stosunku do wszystkich próbek (log RNA Seq V2 RSEM) uzyskano stosując próg z-score ±2,0; (c) gen: VEGFA.Analiza STRINGSTRING (https://string-db.org/cgi/input.pl) to internetowa bezpłatna baza danych służąca do konstruowania sieci interakcji białko-białko (PPI) między docelowymi białkami.16 W tym badaniu zbudowaliśmy interakcję sieci PPI poprzez warunki przesiewowe z niskim poziomem ufności (0.150) i gatunkiem zdefiniowanym jako Homo sapiens.Analiza GeneMANIAGeneMANIA (http://www.genemania.org) to narzędzie analityczne do budowania PPI, generowania hipotez na temat funkcji genów, analizowania list genów i sekwencjonowania genów w celu określenia funkcji.17 W tym badaniu skonstruowaliśmy sieci interakcji w celu zbadania roli VEGFA i 50 najbardziej zmienionych sąsiednich genów.Analiza metascapeMetascape (https://metascape.org) to proste i potężne narzędzie do adnotacji i analizy funkcji genów, które może pomóc użytkownikom w zastosowaniu popularnych obecnie metod analizy bioinformatycznej do analizy partii genów i białek w celu zrozumienia funkcji genów lub białek.18 W badaniu Metascape zbadano funkcję ontologii genów (GO) oraz analizę szlaku wzbogacania VEGFA w encyklopedii genów i genomów Kioto (KEGG) i zmienionych sąsiednich genów w RCC.Analiza ZAUFANIATRUST (https://www.grnpedia.orgtrrust/) to ręcznie wyselekcjonowana baza danych ludzkich sieci regulatorowych transkrypcji, która zawiera 8444 i 6552 relacje regulacyjne czynnik transkrypcyjny-cel 800 ludzkich czynników transkrypcyjnych19. zidentyfikować kluczowy czynnik regulujący ekspresję VEGFA i zmienionych sąsiednich genów u pacjentów z RCC przy użyciu bazy danych TRUST.Analiza LinkedOmicsLinkedOmics (http://www.linkedomics.org) to publiczna platforma internetowa, która zawiera dane multiomiczne dotyczące wszystkich 32 typów nowotworów TCGA.20 Zapewnia metody analizy i porównywania danych multiomicznych nowotworów w obrębie typów nowotworów i między nimi. W naszym badaniu wzbogacenie docelowej kinazy, wzbogacenie docelowej miRNA oraz geny różniące się ekspresją w korelacji z VEGFA przeprowadzono przy użyciu modułu „LinkInterpreter” LinkedOmics. Kryteria przesiewowe ustalono następująco: (a) minimalna liczba trzech genów (rozmiar); (b) typ raka: KIRC, KICH i KIRP; c) symulacja 500; (d) atrybucja wyszukiwania: VEGFA i 50 najbardziej zmienionych sąsiednich genów; e) docelowy zbiór danych: sekwencja RNA (typ danych).Analiza timeraTIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/) to wszechstronne źródło do systematycznej analizy komórek odpornościowych naciekających nowotwór, w tym limfocytów B, limfocytów T CD4 plus, limfocytów T CD8 plus, neutrofili, makrofagów i komórek dendrytycznych 21 W naszym badaniu korelację między poziomem ekspresji VEGFA a naciekiem komórek odpornościowych oceniano za pomocą „modułu genów” TIMER.

Wyniki

Ekspresja VEGFA u pacjentów z RCCPorównaliśmy poziomy ekspresji VEGFA u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym o prawidłowych tkankach ludzkich i stwierdziliśmy, że poziomy transkrypcyjne VEGFA stratyfikowane według typu próbki, płci i stadium patologicznego KIRC były znacząco podwyższone (P < {{0}}="" 001)="" (rysunek="" 1(a)="" do="" (c)).="" podobnie,="" poziom="" ekspresji="" vegfa="" w="" tkankach="" kich="" był="" zwiększony="" w="" zależności="" od="" rodzaju="" próbki,="" płci="" i="" stadium="" 2="" kich="" (p="">< 0,05)="" (figura="" 1="" (d)="" do="" (f)).="" jednak="" poziom="" ekspresji="" vegfa="" w="" tkankach="" kirp="" był="" obniżony="" w="" zależności="" od="" rodzaju="" próbki="" i="" płci="" męskiej="" (p="">< 0,05)="" (rysunek="" 1="" (g)="" i="" (h)).="" ponadto="" oceniliśmy="" korelację="" między="" różnicową="" ekspresją="" vegfa="" a="" stanem="" patologicznym="" u="" pacjentów="" z="" rakiem="" nerkowokomórkowym.="" nasze="" wyniki="" wykazały="" istotną="" korelację="" między="" ekspresją="" vegfa="" a="" stanem="" patologicznym="" u="" pacjentów="" z="" kirc="" (p="0.0471)" i="" kirp="" (p="4.36e-6)" (ryc.="" 2)="" .="" ponadto="" wykorzystaliśmy="" gepia="" do="" oceny="" wartości="" prognostycznej="" ekspresji="" vegfa="" u="" pacjentów="" z="" rcc.="" całkowite="" przeżycie="" było="" dłuższe="" u="" pacjentów="" z="" kirp="" o="" niskim="" raczej="" niż="" wysokim="" poziomie="" ekspresji="" vegfa="" (p="0.00044)" (figura="" 3(c)).="" procent="" przeżycia="" był="" wyższy="" u="" pacjentów="" z="" kirp="" o="" niskim="" niż="" wysokim="" poziomie="" ekspresji="" vegfa="" przed="" 100="" miesiącami="" (p="00,016)" (figura="" 3(f)).="" jednak="" odwrotny="" wynik="" uzyskano="" po="" 100="" miesiącach="" u="" pacjentów="" z="" kirp="" (ryc.="">

Zmiana genetyczna i poziom metylacji promotora ekspresji VEGFA u pacjentów z RCCZmiany genetyczne VEGFA u pacjentów z RCC oceniano za pomocą TCGA. Nasze wyniki wykazały, że ekspresja VEGFA była zmieniona o 4% u pacjentów z KIRC (rysunek uzupełniający 1(a)). Jednak poziom metylacji promotora ekspresji VEGFA był niższy u pacjentów z KIRC niż u zdrowych ludzi (rysunek uzupełniający 1 (b)). Ponadto stwierdziliśmy 8-procentową zmianę poziomu ekspresji VEGFA u pacjentów z KICH (rysunek uzupełniający 1(c)). Podobnie ekspresja VEGFA była zmieniona o 4% u pacjentów z KIRP (rysunek uzupełniający 1(e)). Jednak poziom metylacji promotora ekspresji VEGFA był wyższy u pacjentów z patologicznym stadium 1 KIRP niż u osób zdrowych (rysunek uzupełniający 1 (f))

Sąsiednie zmiany genów i sieć interakcji VEGFA u pacjentów z RCCSąsiednie geny zmiany ekspresji VEGFA u pacjentów z RCC analizowano za pomocą oprogramowania cBioPortal. U pacjentów z KIRC, KICH i KIRP stwierdziliśmy częstość zmian sąsiednich genów VEGFA większa lub równa 11,11 procent, większa lub równa 20 procent i większa lub równa 9,09 procent (50 najczęściej zmienianych sąsiednich genów). odpowiednio (tabele uzupełniające 1–3). Najczęściej zmienianymi genami sąsiadującymi z VEGFA u pacjentów z KIRC były VHL (72,22 procent), PBRM1 (33,33 procent) i MUC16 (22,22 procent) (tabela uzupełniająca 1). Ponadto TRAP (60.00 procent), PABPC1 (60.00 procent) i MUC5B (60.00 procent) były najczęściej zmienianymi genami sąsiadującymi z VEGFA u pacjentów z KICH (uzupełniająca) tabela 2). Trzy najczęściej zmieniane sąsiednie geny VEGFA u pacjentów z KIRP to BAP1 (27,27 procent), MS4A15 (18,18 procent) i TGM7 (18,18%) (tabela uzupełniająca 3).

Następnie zbadaliśmy potencjalne interakcje między VEGFA a sąsiednimi genami. Sieć PPI została zbudowana przy użyciu oprogramowania STRING. Otrzymaliśmy 43 węzły i 95 krawędzi w sieciach PPI u pacjentów z KIRC (rysunek uzupełniający 2(a)). Co więcej, trimetylacja peptydylolizyny, metylacja peptydylo-lizyny, macierz zewnątrzkomórkowa i glikozylacja związana z białkiem O były głównymi funkcjami VEGFA i sąsiednich genów u pacjentów z KIRC (rysunek uzupełniający 2 (b)). Otrzymaliśmy również 44 węzły i 125 krawędzi w sieciach PPI u pacjentów z KICH (rysunek uzupełniający 2 (c)). VEGFA i sąsiadujące z nim geny pełniły następujące funkcje u pacjentów z KICH: przetwarzanie O-glikanów, światło aparatu Golgiego, glikozylacja związana z białkiem b, utrzymywanie struktury nabłonka i organizacja cytoszkieletu włókien pośrednich (rysunek uzupełniający 2 (d)). Ponadto uzyskano 30 węzłów i 57 krawędzi w sieciach PPI u pacjentów z KIRP (rysunek uzupełniający 2(e)). Rozwój struktury mięśniowej, różnicowanie komórek mięśniowych, rozwój tkanki mięśniowej i rozwój strukturalnego składnika tkanki mięśniowej były podstawowymi funkcjami VEGFA i sąsiednich genów u pacjentów z KIRP (rysunek uzupełniający 2(f)). VEGFA jest połączony z sąsiednimi genami w złożoną sieć interakcji poprzez koekspresję, interakcje fizyczne, przewidywane wspólne domeny białkowe i kolokalizację (rysunek uzupełniający 2 (b) do (f))

Analiza wzbogacania szlaków GO i KEGGZa pomocą oprogramowania Metascape zbadano funkcję GO i analizę wzbogacania szlaku KEGG VEGFA i 50 najbardziej zmienionych sąsiednich genów u pacjentów z RCC. Nasze wyniki wykazały, że komponenty komórkowe związane z VEGFA i sąsiednimi genami u pacjentów z KIRC były głównie zaangażowane w błonę podstawną, kaweolę, połączenie przylegające, część plemnika i część włókna kurczliwego (rysunek uzupełniający 3 (a)). Co więcej, morfogeneza naczyń wieńcowych, rozwój kardiomiocytów, pozytywna regulacja rozszerzenia aksonów i heterofilna adhezja komórka-komórka za pośrednictwem cząsteczek adhezyjnych komórek błony komórkowej były głównymi biologicznymi procesami ekspresji VEGFA i zmienionych sąsiednich genów u pacjentów z KIRC (rysunek uzupełniający 3b). Molekularne funkcje VEGFA i jego 50 najbardziej zmienionych sąsiednich genów u pacjentów z KIRC obejmowały głównie składnik strukturalny macierzy zewnątrzkomórkowej, wiązanie cząsteczek adhezyjnych komórek i aktywność katalityczną, a także działanie na RNA (rysunek uzupełniający 3 (c)). Szlak KEGG VEGFA i sąsiadujące z nim geny w KIRC były głównie zaangażowane w szlak sygnalizacyjny AGE-RAGE w powikłaniach cukrzycowych oraz szlak sygnalizacyjny PI3K-Akt (rysunek uzupełniający 3 (d)). Światło aparatu Golgiego, macierz zewnątrzkomórkowa, kompleks ATPazy i dysk Z były komponentami komórkowymi związanymi z ekspresją VEGFA i sąsiednich genów u pacjentów z KICH (rysunek uzupełniający 3 (e)). Ponadto głównymi procesami biologicznymi obejmującymi ekspresję VEGFA i jego 50 najbardziej zmienionych sąsiednich genów u pacjentów z KICH były utrzymanie nabłonka przewodu pokarmowego, ujemna regulacja organizacji komponentów komórkowych i gojenie się ran (rysunek uzupełniający 3 (f)) . Molekularnymi funkcjami VEGFA i sąsiadujących z nim genów u pacjentów z KICH była aktywność ATPazy, wiązanie filamentów aktynowych i wiązanie proteazy (rysunek uzupełniający 3(g)). Transportery kasety wiążącej ATP (ABC) i zakażenie ludzkim wirusem 1 białaczki komórek T były zaangażowane w analizę szlaku KEGG VEGFA i jego 50 najbardziej zmienionych sąsiednich genów u pacjentów z KICH (rysunek uzupełniający 3 (h)). Ponadto komponenty komórkowe związane z VEGFA i sąsiednimi genami u pacjentów z KIRP były głównie zaangażowane w światło aparatu Golgiego i centriolę (rysunek uzupełniający 3 (I)). Ponadto homeostaza tkanek, homeostaza komórek szpiku, przetwarzanie O-glikanów i odpowiedź komórkowa na lipidy były głównymi procesami biologicznymi zaangażowanymi w ekspresję VEGFA i zmienionych sąsiednich genów u pacjentów z KIRP (rysunek uzupełniający 3 (j)). Molekularne funkcje VEGFA i jego 50 najbardziej zmienionych sąsiednich genów u pacjentów z KIRP obejmowały głównie aktywność koaktywatora transkrypcji, aktywność peptydazy typu cysteiny i wiązanie kalmoduliny (rysunek uzupełniający 3 (k)). Zakażenie Vibrio cholerae, kardiomiopatia rozstrzeniowa i zakażenie ludzkim cytomegalowirusem były zaangażowane w analizę szlaku KEGG VEGFA i jego zmienionych sąsiednich genów u pacjentów z KIRP (rysunek uzupełniający 3(l)).

CISTANCHE POPRAWI INFEKCJE NEREK/NEREK

Docelowe czynniki transkrypcyjne VEGFA u pacjentów z RCCPotencjalne cele czynnika transkrypcyjnego, kinazy i miRNA VEGFA u pacjentów z RCC uzyskano za pomocą oprogramowania TRRUST (Tabela 1). Podjednostka alfa czynnika 1 indukowanego niedotlenieniem (HIF1A), czynnik transkrypcyjny AP-2 alfa (TFAP2A) i receptor estrogenowy 1 (ESR1) były kluczowymi czynnikami transkrypcyjnymi zaangażowanymi w sieć VEGFA i sąsiednich genów u pacjentów z KIRC (P < 0.05).="" rora,="" setd2,="" vegfa="" i="" vhl="" mają="" regulowane="" geny="" hif1a.="" ponadto="" tfap2a="" regulował="" funkcje="" adra1a="" i="" vegfa.="" nr5a2="" i="" vegfa="" mają="" regulowane="" geny="" esr1.="" co="" więcej,="" kluczowymi="" celami="" czynnika="" transkrypcyjnego="" zaangażowanymi="" w="" sieć="" vegfa="" i="" sąsiednich="" genów="" były="" przetwornik="" sygnału="" i="" aktywator="" transkrypcji="" 3="" (stat3),="" czynnik="" jądrowy="" wzmacniacza="" genu="" lekkiego="" polipeptydu="" kappa="" w="" komórkach="" b="" 1="" (nfkb1)="" oraz="" homeodomena.="" oddziałująca="" kinaza="" białkowa="" 2="" (hipk2)="" u="" pacjentów="" z="" kich="" (p="">< 0.01).="" regulowanymi="" genami="" stat3="" były="" a2m,="" muc4,="" muc5b,="" tp53="" i="" vegfa.="" ponadto="" nfkb1="" regulował="" funkcje="" a2m,="" muc5b,="" muc6,="" tnc,="" tp53="" i="" vegfa.="" tp53="" i="" vegfa="" mają="" regulowane="" geny="" hipk2.="" ponadto,="" forkhead="" box="" o3="" (foxo3),="" tfap2a="" (aktywujące="" białko="" wiążące="" wzmacniacz="" 2="" alfa)="" i="" homolog="" 1="" wirusa="" erytroblastozy="" e26="" wirusa="" v-ets="" (ets1)="" były="" kluczowymi="" celami="" czynnika="" transkrypcyjnego="" dla="" vegfa="" i="" sąsiednich="" genów="" u="" pacjentów="" z="" kirp="" (="" p="">< 0,05).="" ponadto="" bcl2l11="" i="" vegfa="" mają="" regulowane="" geny="" foxo3.="" dodatkowo="" tfap2a="" regulował="" funkcje="" muc4="" i="" vegfa.="" casp1="" i="" muc4="" to="" geny="" regulowane="" przez="">

Cele kinazy i miRNA VEGFA u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym Za pomocą LinkedOmics uzyskaliśmy również trzy najlepsze cele kinazowe i cele miRNA sieci VEGFA (Tabela 2). Sieć celów miRNA VEGFA w KIRC była powiązana z ATAAGCT MIR-21 (P < 0.05).="" ponadto="" kinazowymi="" celami="" vegfa="" były="" kinazy="" atm="" u="" pacjentów="" z="" kich="" (p="">< 0.05).="" ponadto="" kinaza="" cdk1="" i="" kinaza="" aurkb="" były="" kinazami="" docelowymi="" vegfa="" u="" pacjentów="" z="" kirp="" (p="">< 0,05).="" celami="" mirna="" dla="" vegfa="" były="" (tcgatgg)="" mir-213,="" (tctgatc)="" mir-383="" i="" (caggtcc)="" mir-492="" u="" pacjentów="" z="" kirp="" (p=""><>

Korelacja genów o zróżnicowanej ekspresji i ekspresji VEGFA u pacjentów z RCCUzyskaliśmy dane z sekwencjonowania mRNA od 533 pacjentów z KIRC w bazie danych TCGA firmy LinkedOmics. Jak pokazano na rysunku uzupełniającym 4(a), 20158 genów było blisko spokrewnionych z VEGFA. Wśród nich 11417 i 8741 genów wykazywało odpowiednio dodatnią i ujemną korelację z ekspresją VEGFA. Ponadto 50 znaczących genów było dodatnio i ujemnie skorelowanych z ekspresją VEGFA u pacjentów z KIRC (P < 0,05)="" (rysunek="" uzupełniający="" 4="" (b)="" i="" (c)).="" ponadto="" ekspresja="" vegfa="" miała="" silny="" pozytywny="" związek="" z="" notch4="" (współczynnik="" korelacji="" pearsona="0.7023," p="2.076e-80)" (rysunek="" uzupełniający="" 5(a)),="" gpr4="" (korelacja="" pearsona{="" {19}}0.702,="" p="2.63e–80)" (rysunek="" uzupełniający="" 5(b))="" i="" trib2="" (korelacja="" pearsona="0.6972," p="8.902e–79" )="" (rysunek="" uzupełniający="" 5(c))="" wyrażenia.="" ponadto="" przeanalizowaliśmy="" dane="" z="" sekwencjonowania="" mrna="" 66="" pacjentów="" z="" kich="" w="" bazie="" danych="" tcga="" i="" stwierdziliśmy,="" że="" 19="" 216="" genów="" było="" blisko="" związanych="" z="" ekspresją="" vegfa.="" wśród="" nich="" 8820="" i="" 10="" 396="" genów="" wykazało,="" odpowiednio,="" dodatnią="" i="" ujemną="" korelację="" z="" ekspresją="" vegfa="" (rysunek="" uzupełniający="" 4(d)).="" zidentyfikowaliśmy="" również="" 50="" znaczących="" genów,="" które="" były="" dodatnio="" i="" ujemnie="" skorelowane="" z="" ekspresją="" vegfa="" u="" pacjentów="" z="" kich="" (rysunek="" uzupełniający="" 4="" (e)="" i="" (f)).="" ponadto="" ekspresja="" vegfa="" była="" dodatnio="" związana="" z="" ckmt2="" (korelacja="" pearsona="0.6474," p="4.236e–9)" (rysunek="" uzupełniający="" 5(d)),="" rragd="" (korelacja="" pearsona="0" 0,6279,="" p="1.673e–8)" (rysunek="" uzupełniający="" 5(e))="" i="" ppargc1a="" (korelacja="" pearsona="0.6086," p="5.93e–8)" (rysunek="" uzupełniający="" 5(f))="" wyrażenia.="" na="" koniec="" przeanalizowaliśmy="" dane="" z="" sekwencjonowania="" mrna="" 290="" pacjentów="" z="" kirp="" w="" bazie="" danych="" tcga.="" ponadto="" 20="" 023="" geny="" były="" blisko="" spokrewnione="" z="" ekspresją="" vegfa.="" wśród="" nich="" 11="" 130="" i="" 8893="" genów="" wykazało,="" odpowiednio,="" dodatnią="" i="" ujemną="" korelację="" z="" ekspresją="" vegfa="" vegfa="" (rysunek="" uzupełniający="" 4(g)).="" zidentyfikowaliśmy="" 50="" znaczących="" genów,="" które="" były="" dodatnio="" i="" ujemnie="" skorelowane="" z="" ekspresją="" vegfa="" u="" pacjentów="" z="" kirp="" (rysunek="" uzupełniający="" 4="" (h)="" i="" (i)).="" ekspresja="" vegfa="" była="" dodatnio="" związana="" z="" flt1="" (korelacja="" pearsona="0.8184," p="2.909e-71)" (rysunek="" uzupełniający="" 5(g)),="" c6orf223="" (korelacja="" pearsona="0)." 7779,="" p="4.606e-60)" (rysunek="" uzupełniający="" 5(h))="" i="" esm1="" (korelacja="" pearsona="0.7602," p="6.983e-56)" (rysunek="" uzupełniający="" 5="" (i))="">

CISTANCHE POPRAWI BÓL NEREK/NEREK

Naciek komórek immunologicznych i ekspresja VEGFA u pacjentów z RCCAby dodatkowo ujawnić związek między naciekiem komórek układu odpornościowego a ekspresją VEGFA u pacjentów z RCC, zbadaliśmy korelację między naciekiem komórek układu odpornościowego a ekspresją VEGFA za pomocą oprogramowania TIMER. Poziom ekspresji VEGFA u pacjentów z KIRC był dodatnio związany z infiltracją limfocytów T CD8 plus (Cor=0.197, P=3.36e-5), limfocytów T CD4 plus ( Cor= 0.301, P=4.41e-11) i neutrofili (Cor =0.223, P= 1.44e -6) (rysunek uzupełniający 6(a)). Ponadto przeanalizowaliśmy korelację między naciekiem komórek układu odpornościowego a ekspresją VEGFA u pacjentów z KICH. Infiltracja B (Cor=0.349, P=4.39e-3), CD8 plus T (Cor= 0.398, P=1.03e -5), a komórki dendrytyczne (Cor=0.253, P=4.18e-2) były dodatnio związane z ekspresją VEGFA (rysunek uzupełniający 6(b)) . Wreszcie, poziom ekspresji VEGFA u pacjentów z KIRC był dodatnio związany z naciekiem B (Cor= 0.16, P=1.04e-2), CD8 plus T (Cor{ {41}}.179, P=0.384e-3) i CD4 plus limfocyty T (Cor=0.157, P=1.14e-2 ) (rysunek uzupełniający 6(c)). Jednak infiltracja makrofagów (Cor=-0,226, P=3.22e-4) była ujemnie związana z ekspresją VEGFA (rysunek uzupełniający 6(c)).

Dyskusja

VEGFA, członek rodziny VEGF, jest ważną cytokiną i wiodącym induktorem angiogenezy.22 Badania przedkliniczne wykazały nadekspresję VEGFA u pacjentów z RCC.23,24 Jednak poziom ekspresji VEGFA u pacjentów z RCC pozostaje kontrowersyjny .25,26 Angiogeneza guza odgrywa istotną rolę w progresji RCC. Leki ukierunkowane na angiogenezę nowotworową są stosowane w leczeniu RCC od prawie 20 lat.27 Jednak efekty terapeutyczne tych leków wciąż nie są idealne, a ich działania niepożądane należy ograniczyć. Dążyliśmy do ujawnienia sieci regulacji genów, wartości prognostycznej i przewidywania docelowego VEGFA u pacjentów z RCC.

Ponadto zbadaliśmy poziom ekspresji VEGFA i korelację między różnicową ekspresją VEGFA a stanem patologicznym u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym. Ekspresja VEGFA była podwyższona raczej u pacjentów z KIRC i KICH niż u osób zdrowych. Niemniej jednak pacjenci z KIRP mieli obniżoną ekspresję VEGFA. Wyniki te były podobne do wyników wcześniejszych badań u pacjentów z KIRC, KICH i KIRP,26,28 i były sprzeczne z wynikami poprzednich badań u pacjentów z KICH.25 Próbowaliśmy wyjaśnić sprzeczne wyniki poprzez zmianę genu i metylację promotora u pacjentów z RCC. Odkryliśmy, że zmiany genetyczne wystąpiły odpowiednio u 4%, 8% i 4% pacjentów z KIRC, KICH i KIRP. Ponadto poziom metylacji promotora VEGFA był niższy u pacjentów z różnymi stadiami KIRC niż u osób zdrowych; przeciwnie, poziom metylacji promotora VEGFA był wyższy u pacjentów w stadium 1 KIRP. Nie stwierdzono jednak różnic w poziomie metylacji promotora VEGFA między pacjentami z KICH a osobami zdrowymi. Dlatego zakładamy, że genetyczna zmiana i metylacja VEGFA może być główną przyczyną różnych ekspresji VEGFA u pacjentów z RCC. Ekspresja VEGFA i stadia patologiczne KIRC i KIRP. Ponadto przeżycie pacjentów z KIRP o niskim poziomie ekspresji VEGFA było dłuższe niż pacjentów z KIRP o wysokim poziomie ekspresji VEGFA. Warto zauważyć, że uzyskaliśmy przeciwne wyniki po 100 miesiącach u pacjentów z KIRP na podstawie krzywych przeżycia wolnego od choroby. Zatem poziom ekspresji VEGFA może być wskaźnikiem prognostycznym u pacjentów z KIRP. Niektóre badania wskazują, że ekspresja VEGF może być istotną cechą zaawansowanego RCC. Wykrycie koekspresji CD147/VEGF może pomóc przewidzieć rokowanie pacjentów z zaawansowanym RCC.29

Co więcej, 50 najczęstszych genów sąsiadujących z VEGFA zostało zmienionych u pacjentów z RCC zgodnie z następującymi częstościami: większe lub równe 11,11 procent (KIRC), większe lub równe 20 procent (KICH) i większe lub równe 9,09 procent (KIRP). Następnie zbadaliśmy potencjalne interakcje i funkcje VEGFA i sąsiednich genów; okazało się, że mają one złożone i szczelne sieci połączeń. U pacjentów z KIRC geny te były głównie zaangażowane w metylację białek. Jednak u pacjentów z KICH sąsiadujące geny VEGFA działały w glikozylacji białek i utrzymaniu struktury komórkowej. Ponadto sąsiadujące geny VEGFA były głównie związane ze wzrostem i różnicowaniem włókien mięśniowych u pacjentów z KIRP. Dynamiczne zmiany w metylacji białka są niezbędne do określenia losu komórki i rozwoju komórki. Metylacja białka zachodzi głównie w łańcuchach bocznych reszt Lys i Arg.30 Na przykład metylacja histonów jest często obserwowana w nowotworach z metylacją przy resztach Lys i Arg.31 Nieprawidłowa metylacja i O-glikozylacja są powszechnymi epigenetycznymi modyfikacjami nowotworu. Nieprawidłowa O-glikozylacja przyczynia się do rozwoju raka poprzez bezpośrednią indukcję właściwości onkogennych w komórkach nowotworowych.32 KIRP jest nowotworem złośliwymnerkowymiąższ o brodawkowatej lub rurkowatej strukturze brodawkowatej z włóknistą osią naczynia. Występowanie KIRP może być związane z występowaniem RCC ze zrębem naczyniakomięśniako-podobnego (znanym również jako podścielisko mięśni gładkich lub mięśniaka gładkokomórkowego), ze względu na znaczne podobieństwo ich fenotypów immunohistochemicznych.33 Powyższe dowody wskazują, że sąsiednie geny VEGFA mogą wpływać na występowanie i progresja RCC.

CISTANCHE POPRAWI DIALIZACJĘ NEREK/NEREK

Ponadto analiza wzbogacania GO wykazała, że ​​funkcje VEGFA i sąsiadujących z nim genów u pacjentów z KIRC są głównie związane z wiązaniem cząsteczek adhezyjnych i aktywnością katalityczną, a także z działaniem na RNA. Cząsteczka adhezyjna komórek nabłonkowych (EPCAM) zwróciła ostatnio uwagę jako białko kandydujące do diagnozowania, prognozowania i leczenia różnych nowotworów. EPCAM jest niezależnym prognostycznym markerem molekularnym w RCC i może dostarczać informacji pomocniczych dla lepszego rokowania.34 Stwierdziliśmy, że aktywność ATPazy, wiązanie filamentów aktynowych i wiązanie proteazy były funkcjami molekularnymi VEGFA i sąsiednich genów u pacjentów z KICH. Wiadomo, że u pacjentów z KICH35 występują mitochondrialne zmiany morfologiczne i czynnościowe; Zmiana aktywności ATPazy może być potencjalnym mechanizmem patogenicznym. Jednak potrzebne są dalsze badania, aby potwierdzić ten mechanizm. W naszym badaniu funkcje molekularne VEGFA i zmienionych sąsiednich genów u pacjentów z KIRP obejmowały głównie aktywność koaktywatora transkrypcji, aktywność peptydazy typu cysteiny i wiązanie kalmoduliny. Kalmodulina jest wszechobecnym wewnątrzkomórkowym białkiem wiążącym wapń, podobno związanym z cyklem komórkowym. Wiadomo, że pacjenci z RCC wykazują dodatnią korelację między zawartością kalmoduliny w guzie a tempem wzrostu guza.36 Stwierdziliśmy, że szlak sygnałowy AGE-RAGE w powikłaniach cukrzycowych, szlak sygnałowy PI3K-Akt, działanie transportera ABC i ludzki wirus białaczki T-komórkowej 1 infekcja była głównie zaangażowana w analizę szlaku KEGG VEGFA i sąsiednich genów u pacjentów z RCC; procesy te są ściśle związane z występowaniem i progresją nowotworu.37 Zatem regulacja tych szlaków sygnałowych może być potencjalnym celem leczenia RCC.

Przeanalizowaliśmy również cele i regulatory VEGFA u pacjentów z RCC. Najpierw zbadaliśmy docelowe czynniki transkrypcyjne VEGFA i sąsiednich genów u pacjentów z RCC i odkryliśmy, że HIF1A, TFAP2A i ESR1 były kluczowymi czynnikami regulacyjnymi u pacjentów z KIRC. HIF-1 jest kluczowym regulatorem genu biorącym udział w odpowiedzi komórkowej na niedotlenienie. Nadekspresja HIF-1 jest związana z patogenezą RCC; ponadto funkcjonalny polimorfizm HIF1A może prowadzić do podatności na RCC, a polimorfizm HIF1A może wpływać na nawrót, progresję i przeżycie RCC.38 Jednak TFAP2A i ESR1 nie były zgłaszane u pacjentów z RCC. Odkryliśmy również, że STAT3, NFKB1 i HIPK2 były istotnie regulowanymi czynnikami u pacjentów z KICH. Białka STAT3 są kluczowymi czynnikami transkrypcyjnymi, które są nieprawidłowo aktywowane w różnych nowotworach złośliwych, w tym RCC.39 Hamowanie STAT3 może utrudniać migrację i inwazję komórek RCC.40

NFKB1 jest związany z patogenezą wielu nowotworów złośliwych, w tym RCC. Funkcjonalny polimorfizm promotora NFKB1 wiąże się ze zwiększonym ryzykiem RCC.41 HIPK2 odgrywa wyjątkową rolę w regulacji apoptozy i proliferacji komórek, a także w naprawie uszkodzeń DNA i innych podstawowych procesach; w ten sposób HIPK2 przyciąga coraz większą uwagę. Fosforylacja FOXM1 przez HIPK2 promuje aktywność transkrypcyjną i proliferację komórek FOXM1 u pacjentów z RCC, co może być potencjalnym mechanizmem leczenia RCC.42 W naszym badaniu stwierdzono, że FOXO3, TFAP2A i ETS1 są kluczowymi celami czynnika transkrypcyjnego VEGFA i sąsiednich genów u pacjentów z KIRP. Ekspresja fosfofruktokinazy-M, w której pośredniczy FOXO3- hamuje wzrost, migrację i inwazję komórek RCC,43 FOXO3 może być stosowany jako nowy biomarker jako nowy cel terapeutyczny w leczeniu RCC.44 ETS1 wydaje się być kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym w zewnątrzkomórkowych przebudowa macierzy podczas angiogenezy; może brać udział w angiogenezie RCC.45 Zbadaliśmy dalej cele kinazy związane z VEGFA (ATM w KICH, a także CDK1 i AURKB w KIRP) oraz cele miRNA związane z VEGFA (MIR-21 w KIRC; MIR{ {23}}, MIR-383 i MIR-492 w KIRP). W ciągu ostatniej dekady wiele badań wykazało, że zaburzenia kinazy białkowej lub mutacje odgrywają przyczynową rolę w występowaniu raka. Badania nad rakiem wykazały kluczową rolę wielu kinaz białkowych w onkogenezie człowieka i progresji raka, czyniąc te cząsteczki skutecznymi kandydatami do nowych terapii celowanych.46 Inhibitory kinaz zrewolucjonizowały leczenie niektórych typów nowotworów złośliwych.47 miRNA to klasa nie- kodujące RNA, które odgrywają zasadniczą rolę w regulacji ekspresji genów. Inhibitory miRNA zmniejszają ekspresję genów docelowych poprzez interakcję z nieulegającym translacji regionem 3' genów docelowych. Ich ważna rola w regulowaniu ekspresji genów supresorowych nowotworów i ekspresji onkogenów zwiększa ich rolę w onkogenezie.48 Odkrycie docelowych miRNA może ostatecznie wyjaśnić mechanizmy leżące u podstaw nowotworzenia i opracowywania leków przeciwnowotworowych.49 Badanie to stanowi punkt odniesienia i podkreśla znaczenie dalszych analizy czynników regulowanych, kinaz i miRNA jako potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu RCC.

Zbadaliśmy korelację między genami o zróżnicowanej ekspresji a ekspresją VEGFA u pacjentów z RCC. Ponad 10000 genów było skorelowanych dodatnio i ujemnie z ekspresją VEGFA u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym. Wśród nich u pacjentów z RCC stwierdzono geny o najwyższej korelacji z VEGFA: NOTCH4, GPR4 i TRIB2 w KIRC; CKMT2, RRAGD i PPARGC1A w KICH; oraz FLT1, C6orf223 i ESM1 w KIRP. Jednak ukierunkowanie na te geny związane z rakiem może zapewnić terapię adiuwantową dla RCC. Immunoinfiltracja RCC jest ściśle związana z rokowaniem klinicznym.50 Transport komórek odpornościowych do miejsc nowotworowych odbywał się głównie przez naczynia krwionośne. Zgodnie z oczekiwaniami stwierdziliśmy, że ekspresja VEGFA u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym była dodatnio związana z naciekiem komórek układu odpornościowego, w tym limfocytów T CD8 plus, limfocytów T CD4 plus, makrofagów, neutrofili i komórek dendrytycznych. Mamy nadzieję poprawić infiltrację komórek odpornościowych w RCC poprzez opracowanie leków działających na cele regulacyjne związane z VEGFA lub VEGFA. Podsumowując, badając poziom ekspresji i sieć regulacji genów VEGFA u pacjentów z RCC, dostarczyliśmy więcej informacji na temat badania i leczenia RCC. Ponadto zidentyfikowaliśmy nowe cele terapeutyczne i prognostyczne biomarkery do dokładnego przewidywania przeżycia pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym.