Abstrdziałać

Tło: Coraz więcej badań donosi o działaniu terapeutycznym egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), za pomocą których charakteryzują się białka i miRNA. Jednak profile proteomiczne i miRNA egzosomów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pozostają niejasne.

Glikozyd cistanche może również zwiększać aktywność SOD w tkankach serca i wątroby oraz znacznie zmniejszać zawartość lipofuscyny i MDA w każdej tkance, skutecznie wymiatając różne reaktywne rodniki tlenowe (OH-, H₂O₂, itp.) i chroniąc przed uszkodzeniem DNA spowodowanym przez rodniki OH. Glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche mają silne zdolności wymiatania wolnych rodników, wyższą zdolność redukującą niż witamina C, poprawiają aktywność SOD w zawiesinie plemników, zmniejszają zawartość MDA oraz mają pewien wpływ ochronny na funkcję błony plemników. Polisacharydy Cistanche mogą zwiększać aktywność SOD i GSH-Px w erytrocytach i tkankach płuc eksperymentalnie starzejących się myszy wywołaną przez D-galaktozę, a także zmniejszać zawartość MDA i kolagenu w płucach i osoczu oraz zwiększać zawartość elastyny, mają dobry efekt zmiatania DPPH, przedłuża czas niedotlenienia u starzejących się myszy, poprawia aktywność SOD w surowicy i opóźnia fizjologiczną degenerację płuc u doświadczalnie starzejących się myszy Eksperymenty z degeneracją morfologiczną komórek wykazały, że Cistanche ma dobrą zdolność przeciwutleniającą i ma potencjał, aby być lekiem do zapobiegania i leczenia chorób związanych ze starzeniem się skóry. Jednocześnie echinakozyd w Cistanche ma znaczną zdolność do wychwytywania wolnych rodników DPPH i może wychwytywać reaktywne formy tlenu, zapobiegać degradacji kolagenu wywołanej przez wolne rodniki, a także ma dobry wpływ na naprawę uszkodzeń anionów wolnych rodników tyminy.

Kliknij Anti-aging Cistanche Powder Bulk

【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Metody: W tym badaniu wyizolowaliśmy egzosomy z hESC, hiPSC i ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pępowiny (hUC-MSC) poprzez klasyczne ultrawirowanie i filtr 0.{2}} μm, a następnie konserwatywną identyfikację. Tandemowe znakowanie masowe i bezznacznikowa względna ocena ilościowa peptydów razem zdefiniowały ich proteomikę. Przeprowadzono wysokowydajne sekwencjonowanie w celu określenia profili miRNA. Następnie przeprowadziliśmy analizę bioinformatyczną, aby zidentyfikować dominujące procesy biologiczne i szlaki modulowane przez ładunki egzosomów. Na koniec przeprowadzono Western blot i RT-qPCR w celu wykrycia rzeczywistych ładunków białek i miRNA w trzech typach egzosomów.

Wyniki: Na podstawie naszych badań ładunki z trzech typów egzosomów przyczyniają się do skomplikowanych procesów biologicznych. Dla porównania, egzosomy hESC (hESC-Exos) były lepsze w regulacji rozwoju, metabolizmu i przeciwdziałaniu starzeniu, a egzosomy hiPSC (hiPSC-Exos) miały podobne funkcje biologiczne jak hESC-Exos, podczas gdy egzosomy hUC-MSC (hUC-MSC-Exos) przyczyniły się bardziej do regulacji odporności.

Wnioski: Dane przedstawione w naszym badaniu pomagają zdefiniować krajobrazy białek i miRNA trzech egzosomów, przewidzieć ich funkcje biologiczne poprzez systematyczną i wszechstronną analizę sieci na poziomie systemu oraz ujawnić ich potencjalne zastosowania w różnych dziedzinach w celu optymalizacji selekcji egzosomów w badaniach przedklinicznych i klinicznych próby.

Słowa kluczowe: Ludzkie embrionalne komórki macierzyste, Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste, Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste z pępowiny, Egzosomy, Proteomika, miRNA

Wstęp

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to małe pęcherzyki aktywnie wydzielane przez komórki, zawierające głównie egzosomy, mikropęcherzyki (MV) i ciałka apoptotyczne [40, 56, 57]. Są szeroko rozpowszechnione w wielu płynach ustrojowych, takich jak ślina, mleko matki, krew, płyn mózgowo-rdzeniowy, żółć i mocz [57]. Wśród nich egzosomy mają dwuwarstwę lipidową o średnicy 40–200 nm, gęstość wyporu 1,13–1,18 g/ml w gradiencie sacharozy oraz wygląd miseczki pod mikroskopem elektronowym [21, 53]. Różne związki bioaktywne, w tym białka, kwasy nukleinowe i lipidy, zapewniają międzykomórkową funkcję komunikacyjną egzosomów między komórkami [16, 17]. Dwuwarstwa lipidowa stanowi delikatną barierę chroniącą zawartość egzosomów przed degeneracją enzymatyczną płynów ustrojowych [49]. Stabilne egzosomy mogą pośredniczyć w skomplikowanych procesach fizjologicznych i patologicznych poprzez aktywność parakrynną, w tym rozwój narządów i reprodukcję, prezentację antygenu, komunikację neuronalną, odpowiedź immunologiczną, regulację starzenia i proliferację komórek [57, 62].

Tworzenie i uwalnianie egzosomu jest procesem w pełni regulowanym, a sortowanie zawartości kapsułkowanej egzosomu zachodzi poprzez mobilizację różnych białek [22, 47]. Wiele białek ma kluczowe znaczenie dla tworzenia egzosomu, który zawiera endosomalny kompleks sortujący wymagany do transportu (ESCRT), tetraspaniny (CD9, CD63 i CD81), gen związany z apoptozą 2- oddziałujący z białkiem X (Alix) i podatność guza gen 101 (TSG101) [38, 55]. Wewnątrzkomórkowy transport egzosomów jest napędzany przez zbiorową aktywność szeregu białek, w tym molekularnych przełączających GTPaz RAB i białek cytoszkieletu, takich jak aktyna i tubulina [24]. Następnie wydzielanie egzosomu jest uzupełniane przez kompleks SNARE i rodzinę synaptotagmin [22]. Badania wykazały, że pączkowanie i zrzucanie egzosomów zależy od aktywności wapnia i rekrutacji ESCRT [15]. Jako posłaniec, uwalnianie egzosomu bierze udział w przesłuchu komórkowym w odpowiedzi na fizjologię komórkową i zmiany patologiczne, takie jak aktywacja, zmiana pH, niedotlenienie, uszkodzenie popromienne lub stres komórkowy [61].

Aby odkryć składniki egzosomów i ich możliwe funkcje fizjologiczne i patologiczne, często stosuje się techniki proteomiczne, transkryptomiczne i inne do badania RNA i białek egzosomów z różnych gatunków, tkanek i komórek [44]. Analiza proteomiczna egzosomów zazwyczaj obejmuje trzy etapy: izolację, oczyszczanie i charakteryzację egzosomów, identyfikację składników białkowych za pomocą spektrometrii mas oraz analizę surowych danych [14]. Stan komórkowy znacząco wpływa na skład białek i obfitość egzosomów. Obecnie ilościowe techniki proteomiczne do analizy charakterystyki i obfitości białek są wykorzystywane do wyjaśnienia mechanizmu leżącego u podstaw produkcji egzosomów i pogłębienia naszego zrozumienia fizjologicznych i patologicznych ról egzosomów w komórkach [39]. Wśród nich szeroko stosowane są ilościowe technologie proteomiki oparte na spektrometrii mas, w tym głównie metody bezznakowe i znakowane stabilnymi izotopami [13, 42]. miRNA to małe bioaktywne cząsteczki, które są ściśle związane z różnymi czynnościami życiowymi. Wysokowydajna technika sekwencjonowania charakteryzuje się dużą czułością i precyzją oraz ma szerokie zastosowanie w sekwencjonowaniu miRNA (18–30 nt) [6]. Biorąc pod uwagę rozwój obecnej technologii, nie ma przeszkód w analizowaniu profili białek i miRNA egzosomów.

Komórki hESC i hiPSC mają wysoki potencjał różnicowania [36]. Ich bezpośrednie zastosowanie w leczeniu jest jednak ograniczone ze względu na ryzyko złośliwości i kwestie etyczne [31]. Natomiast mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają szersze zastosowanie w interwencjach w wielu chorobach w warunkach klinicznych [8]. Jednak ich bezpośrednie stosowanie nadal napotyka na kilka ograniczeń, w tym niski wskaźnik przeżywalności, odrzucenie immunologiczne i kwestie bezpieczeństwa [8, 43]. Obecnie egzosomom poświęca się wiele uwagi ze względu na ich bioasekurację, stabilność, brak aneuploidii i niską immunogenność [51]. Wcześniejsze badania udokumentowały porównanie składników MSC pochodzących z różnych tkanek i ich egzosomów zawierających profile proteomiczne i miRNA [59]. Gong i in. opisali również sieć regulacyjną pęcherzyków zewnątrzkomórkowych hESC (EV) w kategoriach proteomu, ale tylko w szlakach związanych ze starzeniem, bez skupiania się na innych [19]. Questa i in. utkali atlas proteomiczny EV hiPSC pochodzących z ludzkich fibroblastów napletka (HFF) [45]. Chociaż badania te częściowo opisywały białkowe składniki EV, nie skupiały się one wyłącznie na egzosomach, a ich kompleksowa analiza proteomiczna nie jest jasno sformułowana. W szczególności profile miRNA nie zostały jeszcze opisane. Aby temu zaradzić, w niniejszym badaniu wybrano egzosomy wyizolowane z hESC, hiPSC i hUC-MSC do dalszych badań ukierunkowanych na ich profile proteomu i miRNA, aby uzyskać nowe informacje do ich badań i zastosowań klinicznych.

Metody

Przygotowanie i charakterystyka egzosomów

hESC i hiPSC hodowano w pożywce ncTarget (nr kat. RP01020; Nuwacell. Ltd, Chiny), podczas gdy hUC-MSC trzeciej generacji hodowano w pożywce hMSC bez surowicy (nr kat. RP02010; Nuwacell Ltd, Chiny). Następnie zebrano 350 µl supernatantu komórek w fazie wzrostu logarytmicznego (konfluencja ~80 procent) w celu oczyszczenia egzosomów. Egzosomy ekstrahowano przez serię uznanych wirowań i ultrawirowań, jak opisano wcześniej [34, 52]. W skrócie, kondycjonowane pożywki (CM) zebrano i poddano wirowaniu w gradiencie (300 x g przez 10 min, 2 000 x g przez 15 min, 10, 000 x g przez 30 min) w celu rozdzielenia szczątki komórek. Egzosomy osadzono z zebranych supernatantów przy 100, 000 x g przez 70 minut przy użyciu rotora Ti45 (Beckman Coulter, USA). Następnie zawieszono je ponownie w PBS do następnej filtracji przy użyciu filtra membranowego 0,22-}μm MF-Millipore™ (Sigma, USA). Przesącz poddano ultrawirowaniu przy 100 000 x g przez 70 min. Końcowy osad egzosomu ponownie zawieszono w PBS do następnej analizy. Do pomiaru stężenia i wielkości izolowanych egzosomów zastosowano system dynamicznego rozpraszania światła (DLS) (Wyatt Technology, USA).

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

Skanowanie TEM przeprowadzono w celu opisania morfologii izolowanych egzosomów, jak opisano wcześniej. Ponownie zawieszone egzosomy (1 µg w 10 µl PBS) wysiano na miedzianej siatce pokrytej węglem (200- mesh) i pozostawiono do adsorbowania na niej przez 2 minuty, po czym dwukrotnie przemyto wodą podwójnie destylowaną. Następnie siatki barwiono negatywnie 8 μl 2% roztworu octanu uranylu przez 1 minutę. Po naturalnym wysuszeniu próbki badano za pomocą systemu Tecnai Spirit (Thermo Fisher, USA) przy napięciu 120 kV.

Dynamiczne rozpraszanie światła

Rozkład wielkości egzosomów opisano za pomocą analizy śledzenia nanocząstek przy użyciu dynamicznego rozpraszacza światła (Wyatt Technology, USA) zgodnie z instrukcjami producenta (271-DPN), jak wcześniej informowano [23]. W skrócie, osad egzosomu ponownie zawieszono w 100 μl PBS. Dziesięć 50 μl powyższych egzosomów dodano do 1450 μl PBS i worteksowano przez 30 sekund. Egzosomy (1,5 ml) przeniesiono do jednorazowej kuwety w celu zrównoważenia w 25 stopniach przez 30 sekund. Wartość współczynnika załamania światła środka dyspergującego wynosiła 1,37, a zarówno średnia Z, jak i polidyspersyjność (PDI) określały wielkość cząstek egzosomu. Dla każdej próbki wykonano niezależne od drzewa pomiary.

Tandemowe znakowanie masowe (TMT) i analiza ilościowa względnego peptydu bez znaczników (LFQ).

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100 i p<0.05) and label-free (at least two tests results>0 i p<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), a także istotności statystycznej (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

Analiza profilu miRNA

Całkowity RNA ekstrahowano z izolowanych egzosomów przy użyciu zestawu miRNA Isolation Kit mirVana™ (nr kat. AM1560; Thermo Fisher, USA). Próbki RNA poddano kontroli jakości pod kątem testu mikromacierzy miRNA przeprowadzonego przez LC-Bio Technology Co., Ltd. Analiza surowych danych została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami [9]. MiRNA o różnej ekspresji wybrano jako kandydujące miRNA przy wartości p<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) i maksymalna energia swobodna<−10 (miRanda).

Analiza bioinformatyczna

Surowe dane poddano analizie przy użyciu pakietu oprogramowania Maxquant (wersja 1.6.{2}}), a dane Swiss-Prot{4}}Human zostały ustawione jako odniesienie (20 600 białek) (Proteome ID: UP000005640) . Zidentyfikowane białka zmapowano w Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) w oparciu o terminy analizy KOBAS [60] w celu określenia ich właściwości biologicznych i funkcjonalnych. Oprogramowanie Cytoscape i pakiet igraph w oprogramowaniu R (wersja 3.6.1) zostały użyte do narysowania przeplatanej sieci białek egzosomów lub miRNA między szlakami sygnałowymi.

Analiza statystyczna

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Ilościowa powtarzalność białek i miRNA została podwyższona za pomocą analizy głównych składników (PCA), względnego odchylenia standardowego i współczynnika korelacji Pearsona. Wyniki analizowano za pomocą niesparowanego testu t-Studenta. Dane wyrażono jako średni błąd standardowy średniej (SEM). Wartości P uznano za statystycznie istotne przy *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Wyniki

Izolacja i identyfikacja egzosomów

Hodowlę i identyfikację trzech ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych opisano w dodatkowym pliku 1. Egzosomy wyizolowano z kondycjonowanej pożywki trzech typów komórek macierzystych (dodatkowy plik 1: ryc. S1) i zidentyfikowano na podstawie morfologii, wielkości cząstek, stężenia, i markery powierzchniowe [19]. TEM ujawnił, że te egzosomy miały morfologię w kształcie miseczki (ryc. 1A), a DLS ujawnił, że ich rozkład wielkości mieścił się w zakresie 50–200 nm (ryc. 1B). Western blotting wykazał, że wyizolowane egzosomy zawierały pozytywne markery CD63, TSG101 i HSP70, ale nie negatywny marker kalneksyny (ryc. 1C). Każdy hESC miał podobną wydajność egzosomów jak hiPSC i oba były wyższe niż hUC-MSC (ryc. 1D). Te wyniki wskazują, że reprezentatywne egzosomy zostały zatrzymane, bez różnic w kształcie; stwierdzono jednak różnice między stężeniami egzosomów wyizolowanych z trzech typów komórek macierzystych.

Bioinformatyka białek współdzielonych i ładowanych od góry

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (test bez etykiet). Ostatecznie wybrano 554, 437 i 911 nasion do analizy profili białkowych odpowiednio hESC-Exos, hiPSC-Exos i hUC-MSC-Exos (dodatkowy plik 1: ryc. S3A). Następnie tych kandydatów poddano testowi diagramu Venna w celu wybrania wspólnych białek (dodatkowy plik 1: ryc. S3B). Analiza bioinformatyczna ujawniła, że ​​303 wspólne białka zdominowały regulację tych szlaków sygnałowych, w tym regulację cytoszkieletu aktynowego, adhezję ogniskową, PI3K-AKT, metabolizm węgla itp. (Dodatkowy plik 1: ryc. S3C). Analiza GO wykazała również, że wspólne białka zostały wzbogacone w zewnątrzkomórkowy egzosom, błonę, wiązanie białek i region zewnątrzkomórkowy (dodatkowy plik 1: ryc. S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (test bez znaczników) (ryc. 2A). Na podstawie tych wyników przeszukano białka 163, 187 i 451 odpowiednio w hESC-Exos, hiPSC-Exos i hUC-MSC-Exos (dodatkowy plik 1: ryc. S3E). Następnie opisaliśmy krzywą obfitości ekspresji trzech typów egzosomów i zidentyfikowaliśmy dziesięć najważniejszych symboli genów załadowanych białek w egzosomach (ryc. 2B). CzWysoko obciążone białka poddano bioinformatyce opartej na algorytmie KOBAS. Wszystkie proteomy trzech typów egzosomów były zaangażowane w złożoną sieć regulacyjną szlaku sygnałowego, a 20 najlepszych szlaków zostało następnie posortowanych na podstawie wartości -log10 (wartość P) (ryc. 2C – E). Wszystkie proteomy zostały wzbogacone o interakcje między macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) a receptorem oraz szlaki sygnałowe PI3K-AKT. Analiza interakcji białko-białko (PPI) wykazała, że ​​białka ładowane od góry zarówno w hESC-Exos, jak i hiPSC-Exos byływzbogacone w cykl komórkowy i szlak metaboliczny, podczas gdy białka ładowane od góry w hUC-MSC-Exos zostały wzbogacone w szlaki związane z regulacją odporności (ryc. 2F – H).

Porównanie parami proteomiki egzosomów

Aby ocenić różnicę między każdymi dwoma proteomami egzosomów, skonstruowaliśmy diagram Venna, aby rozpoznać unikalne i nakładające się klastry genów kodujących białka. Wspólne geny kodujące białka poddano następnie analizie wulkanu i mapy termicznej oraz GSEA, a białka o różnej ekspresji filtrowano w P<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

Porównanie hESC-Exos i hUC-MSC - 1: ryc. S4 D) ujawniło, że unikalne klastry genów kodujących białka hESC-Exos były głównie zaangażowane w EGFR, TGF-, cykl komórkowy, regulację pluripotencji i Wnt sygnalizacji (Dodatkowy plik 1: rys. S4E). W przeciwieństwie do tego, unikalne klastry hUC-MSC-Exos zostały wzbogacone w wiele szlaków sygnałowych związanych z immunoregulacją, takich jak układ dopełniacza, regulacja stanu zapalnego i infekcja drobnoustrojami (dodatkowy plik 1: ryc. S4F). Nakładające się klastry były silnie wzbogacone w interakcję ECM-receptor, kaskady dopełniacza i krzepnięcia oraz sygnalizację PI3K-AKT (ryc. 3D). Wykres wulkanu przedstawia różnice między hESC-Exos i hUC-MSC-Exos (ryc. 3E). Regulowane w górę białka w hUC-MSC-Exos (klaster 1) były głównie zaangażowane w odpowiedź dopełniacza, aktywność komórek NK oraz sygnalizację Rap1 i PPAR. W przeciwieństwie do tego, białka regulowane w górę przez hESC-Exos były głównie zaangażowane w sygnalizację PI3K-AKT, MAPK i AMPK (ryc. 3F). GSEA potwierdził wyższą zdolność regulacyjną hiPSC-Exos w pluripotencji (dodatkowy plik 1: ryc. S6A i D) oraz hESC-Exos w immunoregulacji, w tym cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK (dodatkowy plik 1: ryc. S6B i E) i regulacji dotyczących COVID{37}}SARS-CoV2 (dodatkowy plik 1: ryc. S6C i F).

Porównanie hiPSC-Exos i hUC-MSC-Exos (dodatkowy plik 1: ryc. S4G) ujawniło, że unikalny zestaw genów kodujących białko hiPSCExos był istotnie związany z niehomologicznym łączeniem końców, TGF- i metabolizmem witaminy B6 (dodatkowe plik 1: ryc. S4H), podczas gdy hUC-MSC-Exos był głównie zaangażowany w szlaki związane z immunoregulacją (dodatkowy plik 1: ryc. S4I). Ich nakładające się białka uczestniczyły również w regulacji interakcji ECM-receptor, kaskadach dopełniacza i krzepnięcia oraz sygnalizacji PI3K-AKT (ryc. 3G). Wykres wulkanu przedstawia białka o różnej ekspresji (ryc. 3H). Białka klastra 1 na mapie cieplnej wskazywały, że hUCMSC-Exos regulował głównie odpowiedź immunologiczną i szlak sygnałowy AMPK, podczas gdy hiPSC-Exos regulował głównie cykl komórkowy i szlaki sygnałowe insuliny, Hippo i mTOR (ryc. 3 I). GSEA dodatkowo wspierała dominującą rolę hiPSC-Exos w regulacji procesów rozwojowych (dodatkowy plik 1: ryc. S7A i D) i utrzymaniu pluripotencji (dodatkowy plik 1: ryc. S7B i E), podczas gdy hUC-MSC-Exos były głównie zaangażowany w proces immunoregulacji (dodatkowy plik 1: ryc. S7C i F).

Bioinformatyka nakładających się proteomów

Następnie zbadaliśmy wspólne proteomy trzech typów egzosomów. W sumie 309 genów kodujących białka (ryc. 4A) poddano analizom GO i KEGG. Wyniki wskazują, że wspólne zestawy genów kodujących białka wśród trzech typów egzosomów były głównie zaangażowane w aktywność pozakomórkową i procesy biologiczne, w tym procesy metaboliczne białek komórkowych, wiązanie receptora sygnalizacyjnego, wiązanie ATP, wiązanie NAD, gojenie się ran i procesy metaboliczne lipidów (ryc. 4B). Przyczyniły się również do budowy złożonych sieci regulacyjnych szlaków sygnałowych, takich jak PI3K-AKT, glikoliza/glukoneogeneza, hipopotam, oksytocyna, HIF -1, cykl komórkowy i szlaki AMPK (ryc. 4C). Istniały skomplikowane relacje regulacyjne między tymi proteomicznymi i kanonicznymi szlakami sygnałowymi (ryc. 4D). Wykres bąbelkowy pokazuje różną obfitość każdego klastra białek w kanonicznej ścieżce sygnałowej. Podczas gdy hESC-Exos i hiPSC-Exos mogą mieć silniejsze zdolności regulacyjne niż hUC-MSC-Exos pod względem cyklu komórkowego i szlaków sygnałowych AMPK, hUC-MSC-Exos może mieć znaczący wpływ regulacyjny na szlaki sygnałowe VEGF i NF-κB (dodatkowe plik 1: ryc. S8).

Analiza mapy termicznej ujawniła ponadto różnice w ekspresji wspólnych białek (ryc. 4E). W klastrze A białka zaangażowane w szlaki sygnałowe receptora PI3K-AKT, Hippo, VEGF i komórek B zostały wzbogacone w hUC-MSCExos i hESC-Exos. Białka w klastrze B uczestniczyły głównie w regulacji sygnalizacji PPAR, metabolizmie cholesterolu i wytwarzaniu IgA i zostały wyczerpane w hESC-Exos. hUC-MSC-Exos zawierał głównie białka Cluster C, które regulowały odpowiedź dopełniacza, infekcję bakteryjną, sygnalizację HIF{9}}, sygnalizację MAPK, szlaki metaboliczne i szlak NF-κB. Białka w klastrze d, które zostały wzbogacone w hiPSC-Exos, uczestniczyły w regulacji sygnalizacji Ras, fosforylacji oksydacyjnej i sygnalizacji mTOR. Białka w klastrze e były bardziej obfite zarówno w hiPSC-Exos, jak i hESC-Exos niż w hUC-MSCExos i były zaangażowane w wiele procesów metabolicznych, takich jak cykl cytrynianowy, cykl komórkowy, sygnalizacja insuliny, metabolizm kwasów tłuszczowych i sygnalizacja AMPK . Białka w klastrze f uczestniczyły w regulacji wchłaniania zwrotnego wapnia, glikolizy / glukoneogenezy, sygnalizacji adrenergicznej i metabolizmu pirogronianu i zostały wyczerpane zarówno w hUC-MSCExos, jak i hiPSC-Exos. Białka w różnych klastrach są wymienione w dodatkowym pliku 4.

Profile miRNA trzech typów egzosomów

Aby zbadać profile miRNA trzech typów egzosomów, całkowity RNA wyizolowano z egzosomów, aby połączyć końce 5 'i 3' w celu późniejszej odwrotnej transkrypcji. Otrzymany cDNA wykorzystano do konstrukcji biblioteki i szeroko zakrojonych testów. Liczba integralności RNA (RIN) wynosiła odpowiednio 2,7, 2,6 i 2,6 w hESC-Exos, hiPSC-Exos i hUC-MSC-Exos (dodatkowy plik 1: ryc. S9A). Określenie stężenia RNA ujawniło, że hESC-Exos dominował w ładunku RNA, a następnie hiPSC-Exos i hUC-MSCExos (dodatkowy plik 1: ryc. S9B). Współczynnik korelacji Pearsona (dodatkowy plik 1: ryc. S9C) i PCA (dodatkowy plik 1: ryc. S9D) zastosowano do ilościowej oceny powtarzalności miRNA. Mapy cieplne wykorzystano do przedstawienia miRNA o różnej ekspresji w trzech typach egzosomów (dodatkowy plik 1: ryc. S9E) oraz liczby miRNA o różnej ekspresji w P<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

Aby zbadać miRNA zaangażowane w procesy biologiczne, najlepsze miRNA filtrowano w P<0.05 and read count>1000 dla dalszego przewidywania docelowego genu. Wzbogacone geny poddano następnie analizom GO i KEGG. Wyniki wskazują, że miRNA hESC-Exos znacząco wpłynęły na następujące procesy: Rap1, PI3K-AKT, wapń, Hippo, cAMP, ErbB, Foxo, cykl komórkowy, szlak sygnałowy AMPK itp. (Analiza KEGG) (ryc. 5D) oraz cykl komórkowy, rozwój wielu organizmów, transdukcja sygnału wewnątrzkomórkowego, różnicowanie komórek, starzenie się, sygnalizacja Wnt i metabolizm kwasów tłuszczowych. (proces biologiczny) (ryc. 5G). Wzbogacenie genów docelowych miRNA hiPSC-Exos wskazało, że następujące procesy były znacząco regulowane: szlak sygnałowy PI3K-AKT, Rap1, Ras, Calcium, Hippo, cAMP i cGMP-PKG itp. (analiza KEGG) oraz cykl komórkowy, rozwój wielu organizmów, fosforylacja, różnicowanie komórek, migracja komórek i odpowiedź na niedotlenienie. (proces biologiczny) (ryc. 5H). W sieci regulatorowej miRNA hUC-MSC-Exos najbardziej prawdopodobnymi procesami biologicznymi były: Rap1, Ras, PI3K-AKT, wapń, cAMP, Hippo, cykl komórkowy, szlak sygnałowy JAK-STAT i HIF{19}} . (analiza KEGG) (ryc. 5F) i fosforylacja, transdukcja sygnału wewnątrzkomórkowego, wiązanie ATP, podział komórek, metabolizm lipidów, kostymulacja komórek T, gojenie się ran, wiązanie NF-κB i odpowiedź zapalna. (proces biologiczny) (ryc. 5 I). Przedstawiono również sieć pięciu najlepszych miRNA i ich szlaków regulacyjnych (dodatkowy plik 1: ryc. S10).

【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】