Abstrakcyjny:Sarkopenia, która pojawia się podczas starzenia, charakteryzuje się stopniową utratą masy i funkcji mięśni szkieletowych, co skutkuje funkcjonalnym spadkiem zdolności fizycznych. Do wystąpienia sarkopenii przyczynia się kilka czynników, w tym zmniejszona zdolność regeneracyjna, przewlekłe zapalenie o niskim stopniu złośliwości, dysfunkcja mitochondriów i zwiększony stres oksydacyjny, prowadzący do aktywacji szlaków katabolicznych. Aktywność fizyczna i odpowiednia podaż białka są uważane za skuteczne strategie, które mogą zmniejszyć częstość występowania i nasilenie sarkopenii, wywierając korzystny wpływ na poprawę odpowiedzi anabolicznej mięśni podczas starzenia. Tauryna jest nieistotnym aminokwasem, którego ekspresja jest wysoka w tkankach ssaków, a zwłaszcza w mięśniach szkieletowych, gdzie bierze udział w regulacji procesów biologicznych oraz działa jako czynnik przeciwutleniający i przeciwzapalny. Tutaj oceniliśmy, czy podawanie tauryny starym myszom przeciwdziała fizjopatologicznym skutkom starzenia się mięśni szkieletowych. Wykazaliśmy, że w uszkodzonych mięśniach tauryna wzmacnia proces regeneracji poprzez obniżenie odpowiedzi zapalnej i zachowanie integralności włókien mięśniowych. Co więcej, tauryna osłabia wytwarzanie RFT w starzejących się mięśniach poprzez utrzymanie właściwej równowagi redoks w komórkach, działając jako cząsteczka przeciwutleniająca. Chociaż potrzebne są dalsze badania, aby lepiej wyjaśnić mechanizmy molekularne odpowiedzialne za korzystny wpływ tauryny na homeostazę mięśni szkieletowych, dane te pokazują, że podawanie tauryny poprawia mikrośrodowisko, umożliwiając efektywny proces regeneracji i osłabienie szlaków katabolicznych związanych z początkiem sarkopenii.

Glikozyd cistanche może również zwiększać aktywność SOD w tkankach serca i wątroby oraz znacznie zmniejszać zawartość lipofuscyny i MDA w każdej tkance, skutecznie wymiatając różne reaktywne rodniki tlenowe (OH-, H₂O₂, itp.) i chroniąc przed uszkodzeniami DNA spowodowanymi przez rodniki OH. Glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche mają silne zdolności wymiatania wolnych rodników, wyższą zdolność redukującą niż witamina C, poprawiają aktywność SOD w zawiesinie plemników, zmniejszają zawartość MDA oraz mają pewien wpływ ochronny na funkcję błony plemników. Polisacharydy Cistanche mogą zwiększać aktywność SOD i GSH-Px w erytrocytach i tkankach płuc eksperymentalnie starzejących się myszy wywołaną przez D-galaktozę, a także zmniejszać zawartość MDA i kolagenu w płucach i osoczu oraz zwiększać zawartość elastyny, mają dobry efekt zmiatania DPPH, przedłuża czas niedotlenienia u starzejących się myszy, poprawia aktywność SOD w surowicy i opóźnia fizjologiczną degenerację płuc u doświadczalnie starzejących się myszy Eksperymenty z degeneracją morfologiczną komórek wykazały, że Cistanche ma dobrą zdolność przeciwutleniającą i ma potencjał, aby być lekiem do zapobiegania i leczenia chorób związanych ze starzeniem się skóry. Jednocześnie echinakozyd w Cistanche ma znaczną zdolność do wychwytywania wolnych rodników DPPH i ma zdolność wychwytywania reaktywnych form tlenu i zapobiegania degradacji kolagenu wywołanej przez wolne rodniki, a także ma dobry wpływ naprawczy na uszkodzenia anionowe wolnych rodników tyminy.

Kliknij Cistanche Tubulosa

【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Wstęp

Starzenie się charakteryzuje się stopniowym upośledzeniem podstawowych fizjologicznych i biochemicznych funkcji narządów i tkanek i często wiąże się z postępującą utratą masy i siły mięśni szkieletowych, stanem znanym jako sarkopenia [1]. Mechanizmy odpowiedzialne za sarkopenię nie są do końca poznane; niemniej jednak jest prawdopodobnie wynikiem zdarzeń wieloczynnikowych, w tym upośledzonej zdolności regeneracyjnej [2,3], przewlekłego stanu zapalnego [4,5], zwiększonego poziomu stresu oksydacyjnego [5,6] i dysfunkcji mitochondriów [7].

Regeneracja mięśni jest skoordynowanym procesem, w którym komórki satelitarne, przedział komórek macierzystych mięśni szkieletowych, są aktywowane w celu utrzymania i zachowania struktury i funkcji tkanki po uszkodzeniu [8].

Pierwsza faza procesu regeneracyjnego charakteryzuje się martwicą włókien mięśniowych spowodowaną napływem zewnątrzkomórkowego wapnia, co prowadzi do proteolizy miofibryli [9,10]. Zdarzenie to powoduje aktywację specyficznej odpowiedzi zapalnej, która prowadzi do sekwencyjnej inwazji mięśni przez różne populacje komórek zapalnych [11]. Po odpowiedzi zapalnej następuje aktywacja komórek satelitarnych i tworzenie regenerujących się włókien, które morfologicznie wyróżniają się charakterystycznymi scentralizowanymi jądrami [12,13]. Jednak skuteczny program regeneracyjny może zostać poważnie naruszony w przypadku starzenia się lub stanów patologicznych, a tworzenie się rozległej tkanki włóknistej może przyczynić się do upośledzenia czynnościowego [14,15]. Ponadto zmiany w cytokinach zapalnych, czynnikach wzrostu i sygnałach metabolicznych w starzejącym się środowisku mięśni szkieletowych mogą wpływać na proliferację i/lub aktywację komórek satelitarnych po uszkodzeniu włókien mięśniowych [16]. Rzeczywiście wiadomo, że starzenie się jest związane ze stanem zapalnym niskiego stopnia, stanem znanym jako stan zapalny, charakteryzującym się nieznacznie zwiększonym poziomem mediatorów prozapalnych w osoczu, takich jak czynnik martwicy nowotworów (TNF) i interleukina 6 ( IL-6), a w konsekwencji aktywacja szlaku NF-κB [13]. Co ciekawe, stwierdzono, że stężenie białka NF-κB jest czterokrotnie wyższe w mięśniach starszych ludzi niż u młodych ludzi; temu zwiększonemu stężeniu towarzyszą deficyty sygnalizacji anabolicznej, powodujące zanik starzejących się mięśni [17].

Zwiększony poziom stanu zapalnego jest ściśle związany z uszkodzeniami oksydacyjnymi i oba są zaangażowane w związaną z wiekiem redukcję masy i siły mięśni. Stres oksydacyjny charakteryzuje się wysokim poziomem reaktywnych form tlenu (ROS) i/lub reaktywnych form azotu (RNS). Może to być spowodowane zmniejszoną zdolnością antyoksydacyjną z powodu upośledzonej aktywności enzymów antyoksydacyjnych i/lub zwiększoną produkcją RFT [18]. Ponadto podwyższone poziomy ROS i RNS mogą również wynikać z dysfunkcji mitochondriów spowodowanej mutacjami, delecjami i uszkodzeniami mitochondrialnego DNA związanymi z wiekiem [19-21]. Wydaje się, że ROS działają jako wtórni przekaźniki dla TNF- w mięśniach szkieletowych, aktywując NF-κB bezpośrednio lub pośrednio [14].

W mięśniach szkieletowych koaktywator transkrypcyjny aktywowany przez proliferatory peroksysomów koaktywator gamma-1 (PGC{3}}) jest jedną z najważniejszych cząsteczek zaangażowanych w stymulację biogenezy mitochondriów, regulację komórkowej homeostazy oksydacyjno-przeciwutleniającej , tłumienie przewlekłego stanu zapalnego i katabolizmu mięśniowego [22]. PGC{5}} oddziałuje z receptorami jądrowymi i czynnikami transkrypcyjnymi, aby aktywować transkrypcję ich genów docelowych, a jego aktywność jest wrażliwa na wiele bodźców, w tym jony wapnia, ROS, insulinę, hormony tarczycy i estrogeny, niedotlenienie, zapotrzebowanie na ATP i cytokiny [ 23]. W szczególności regulacja biogenezy mitochondriów przez PGC{7}} obejmuje jego interakcję z kilkoma jądrowymi czynnikami transkrypcyjnymi, w tym członkami rodziny PPAR, jądrowym czynnikiem oddechowym (NRF)-1 i NRF-2, czynnikiem wzmacniającym miocyty{ {10}} (MEF2) i białko widełkowe O (FOXO) 1 [24,25]. Aktywacja NRF-12 przez PGC{15}} promuje ekspresję licznych białek mitochondrialnych kodowanych w jądrze, co bezpośrednio stymuluje replikację i transkrypcję mitochondrialnego DNA [23,26,27]. Co więcej, PGC{22}}, we współpracy z czynnikiem transkrypcyjnym MEF2C, może również wpływać na profile fenotypowe włókien mięśniowych, sprzyjając przejściu z szybkiego MHC w kierunku bardziej odpornego wolnego MHC podczas starzenia [28,29].

W ostatniej dekadzie zaproponowano kilka strategii, takich jak aktywność fizyczna i odżywianie, aby potencjalnie złagodzić degradację mięśni szkieletowych podczas starzenia. Rzeczywiście, doniesiono, że ćwiczenia fizyczne łagodzą sarkopenię i zapobiegają gromadzeniu się tkanki tłuszczowej i stanom zapalnym [30–32]. Ponadto interwencje dietetyczne ukierunkowane na spożycie białka lub przeciwutleniaczy mogą mieć pozytywny wpływ na zwiększenie masy i siły mięśniowej [33]. Wiadomo, że utrata masy i funkcji mięśniowej występująca u osób starszych wiąże się ze zmniejszeniem przyjmowania pokarmu, co skutkuje osłabieniem syntezy białek mięśniowych w porównaniu z osobami młodszymi [34]. W związku z tym odżywianie, w szczególności suplementacja aminokwasów, może stanowić ważne podejście do poprawy odpowiedzi anabolicznej mięśni w okresie starzenia [35–39].

Tauryna jest pół-niezbędnym aminokwasem pochodzącym z cysteiny, którego ekspresja występuje w tkankach ssaków. W mięśniach szkieletowych, gdzie jej poziom spada wraz z wiekiem, pełni ważną rolę jako cząsteczka przeciwutleniająca i przeciwzapalna [40,41]. Ponieważ mięśnie szkieletowe zubożone w taurynę wykazują kilka nieprawidłowości w swojej morfologii i funkcji, przypominających te, które występują podczas starzenia [42], suplementacja tauryną może stanowić obiecującą strategię przeciwdziałania negatywnym skutkom starzenia się mięśni szkieletowych.

Tutaj pokazujemy, że dootrzewnowe podawanie tauryny przeciwdziała związanemu ze starzeniem uderzeniu w regenerację mięśni szkieletowych poprzez zmniejszenie stanu zapalnego. Ponadto nasze wyniki potwierdzają rolę tauryny jako cząsteczki przeciwutleniacza zdolnej do poprawy mikrośrodowiska mięśni, przeciwdziałania procesom degeneracyjnym i sprzyjania homeostazie tkanek podczas starzenia.

2. Materiały i metody

2.1. Zwierzęta i zabiegi

Młode (8–10 tygodni) i starsze (18–20 miesięcy) samce myszy C57BL6J trzymano w obiekcie z cyklem światło / ciemność trwającym 12 godzin w stałej temperaturze i wilgotności. Myszom pozwolono karmić się i pić ad libitum. Myszy traktowano zgodnie z wytycznymi Komisji Etyki Katolickiego Uniwersytetu Najświętszego Serca w Rzymie (zezwolenie nr 150/2017-PR włoskiego Ministerstwa Zdrowia) zgodnie z krajowymi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych (dekret włoski nr 26 z dnia 4 marca 2014 r. potwierdzający dyrektywę europejską 2010/63/UE). Taurynę przygotowano w roztworze soli fizjologicznej i podawano w iniekcjach dootrzewnowych w dawce 100 mg/kg/dobę przez pięć kolejnych tygodni [43–45] (Schemat 1). Dawkę tę wybrano na podstawie opublikowanych danych wykazujących działanie antyoksydacyjne na mysich modelach in vivo [46,47]. Myszy kontrolne otrzymywały tylko sól fizjologiczną. Przed wywołaniem uszkodzenia TA za pomocą iniekcji cardiotoxin (CTX), zwierzęta znieczulano przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszanki ketaminy 70 mg/kg i medetomidyny 1 mg/kg, rozcieńczonych w roztworze fizjologicznym. Uszkodzenie lewego mięśnia piszczelowego przedniego (TA) myszy kontrolnych i leczonych tauryną przeprowadzono wzdłuż całej długości mięśnia za pomocą czterech wstrzyknięć CTX (5 µl 10 µM CTX na miejsce) [48,49]. Prawa strona TA została użyta jako odpowiednik kontrolny. Zwierzęta uśmiercono przez zwichnięcie szyjki macicy po znieczuleniu, jak opisano powyżej. Do analiz histologicznych mięśnie TA zatopiono w związku OCT (Miles, Elkhart, IN, USA) i natychmiast zamrożono w izopentanie w temperaturze -80 stopni.

2.2. Analiza histologiczna i histochemiczna

Mięśnie TA starych myszy pocięto na skrawki o grubości 10 µm za pomocą kriostatu Leica. Do analizy histologicznej skrawki barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E) przy użyciu standardowych metod [50]. Barwienie esterazą przeprowadzono stosując zestaw do barwienia niespecyficzną esterazą (Bio-Optica, Mediolan, Włochy) zgodnie z instrukcjami producenta.

2.3. Analiza morfometryczna

Na skrawkach próbek TA przeprowadzono barwienie hematoksyliną i eozyną oraz esterazą. W celu morfometrycznej oceny wielkości włókien, analizę przeprowadzono na 4 losowo wybranych polach obrazów w dużym powiększeniu przekrojów poprzecznych całych mięśni dla każdego warunku. Liczba badanych zwierząt wynosiła 3–4 na każde traktowanie. Mikrofotografie włókien analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ, Scion Image (wersja beta 4.0.2; Scion Corporation, Frederick, MD, USA, dostęp 2 maja 2022 r.) w celu oceny pola przekroju poprzecznego włókien . Regenerujące się włókna zostały uwypuklone przez obecność jąder centralnych.

2.4. Analiza immunofluorescencyjna

Zamrożone skrawki utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez 10 min w temperaturze pokojowej, przemywano PBS i przepuszczano przez roztwór zawierający 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) , #A9418), 0,2% Triton-X w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej i blokowane 10% oślej surowicy (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, #D9663) przez 1 hw temperaturze pokojowej. Skrawki inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z przeciwciałami pierwszorzędowymi w odpowiednim rozcieńczeniu. Zastosowano następujące przeciwciała: wolne MHC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, #M8421, 1:500) i 4-}HNE (Alpha Diagnostics International, San Antonio, TX, #HNE{20 }}S, 1:500). Po trzykrotnym przemyciu w PBS skrawki następnie inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej ze specyficznymi drugorzędowymi przeciwciałami. W szczególności zastosowano: AlexaFluor594-sprzężony anty-mysi 1:1000 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA, #A21203) i AlexaFluor488-skoniugowany anty-króliczy 1:1000 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA, #A21206) w PBS zawierającym 1,5% oślej surowicy. Skrawki zamontowano za pomocą ProLong™ Gold Antifade Mountant z DAPI (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, nr P36935) i zbadano za pomocą konfokalnego lasera Leica SP5. Kwantyfikację zmian sygnału 4-HNE w grupach eksperymentalnych przeprowadzono za pomocą analiz densytometrycznych. Po odjęciu tła sygnały związane z włóknami 4-HNE określono ilościowo przez ręczne obrysowanie poszczególnych włókien i pomiar intensywności fluorescencji związanej z włóknami za pomocą oprogramowania ImageJ. Stosunek F/A określa średnią fluorescencję poszczególnych włókien (F) znormalizowaną do całkowitego pola przekroju poprzecznego włókien (A). Ocenę ilościową przeprowadzono na 50 włóknach na grupę (n=3 myszy na grupę).

2.5. Ekstrakcja białka i analiza Western Blot

Mięśnie TA uzyskane od myszy wycięto, zmielono i homogenizowano z buforem do lizy (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA, nr 98 0 3) zawierającym fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA, #8553) i kompletny koktajl inhibitorów proteazy (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA, #5872). Zastosowano test Bradford Protein Assay (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) i Varioskan™ LUX kontrolowany przez Thermo Scientific™ SkanIt™, dla czytników mikropłytek (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, wersja oprogramowania 4.1) do określenia równej ilości białek zgodnie z instrukcjami producenta. Białka rozdzielono za pomocą SDS/PAGE (prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN® TGX™ lub prefabrykowane żele PAGE bez plam Mini-PROTEAN TGX; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) i przeniesiono na membranę nitrocelulozową ( Trans-Blot® Turbo™ Mini nitrocelulozowe pakiety transferowe #1704158; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Wiązanie niespecyficzne blokowano w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) uzupełnionej 0,1% Tween{17}} i zawierającej 5% odtłuszczonego mleka w proszku (Bio-Rad Laboratories Inc. , Hercules, CA, USA #1706404) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Stosowanymi pierwszorzędowymi przeciwciałami były: mysie monoklonalne anty-SOD{23}} (1:500, Santa Cruz Biotechnology Dallas, Texas 75220, USA, sc{27}}); królicze monoklonalne anty-fosfo-mTOR (1:1000, #2971, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); królicze monoklonalne anty-mTOR (1:1000, #2972, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); mysie monoklonalne anty-slow-MHC (1:500, Sigma-Aldrich, #M8421); mysią anty-miozynę monoklonalną (Skeletal, Fast) (1:500, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, #M4276); królicze monoklonalne anty-fosfo-NF-κB p65 (Ser468) (1:1000, #3039, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); królicze monoklonalne anty-NF-κB p65 (1:250, #3034, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); mysie monoklonalne anty-G6PD (1:300, Santa Cruz Biotechnology Dallas, Texas 75220 USA, sc{67}}) i mysie monoklonalne anty-GP91[phox]. Następnie bloty inkubowano z następującymi przeciwciałami drugorzędowymi z Bio-Rad Laboratories: kozie anty-królicze IgG (1:3000, koniugat HRP, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA, #1706515) i kozie anty-mysie IgG (1:3000, koniugat HRP, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA, nr 1706516) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sygnały zostały przechwycone przez system obrazowania ChemiDoc™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) przy użyciu ulepszonego systemu chemiluminescencyjnego (substrat chemiluminescencyjny SuperSignal, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA). Analizy densytometryczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Image Lab™ Touch, wersja oprogramowania 5.2.1 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA).

2.6. Analiza PCR w czasie rzeczywistym

Mięśnie TA uzyskane od myszy wycięto i przeprowadzono ekstrakcję całkowitego RNA za pomocą lizera tkankowego (QIAGEN) w TriReagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) zgodnie z protokołem producenta. Dwuniciowy cDNA zsyntetyzowano za pomocą zestawu QuantiTect Reverse Transcription (QIAGEN Srl, Mediolan, Włochy). Analizy informacyjnego RNA przeprowadzono na ABI PRISM 7500 SDS (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) przy użyciu specyficznych testów TaqMan (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). W szczególności zastosowano następujące testy: GPX1: mm_00656767_g1; MEF2C: mm_00600423_m1; PGC1- : mm_01280835_m1; SOD1: mm_01344233_m1; i KOT: mm_00437992_m1. Względne oznaczenie ilościowe przeprowadzono przy użyciu endogennej kontroli Hprt1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono stosując preparaty RNA od trzech do pięciu różnych zwierząt dla każdej grupy, jak określono na rysunkach. Wyrażenie względne obliczono metodą 2−∆∆Ct.

2.7. Analiza statystyczna

Wielokrotne porównania statystyczne między grupami przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA. Tam, gdzie wskazano w legendach, zastosowano test sumy rang Manna-Whitneya lub niesparowany test t-Studenta. Każdy słupek reprezentuje średnią ± SEM (błąd standardowy średniej).

3. Wyniki

3.1. Podawanie tauryny przeciwdziała starzeniu się związanemu z regeneracją mięśni szkieletowych

Aby zbadać wpływ podawania tauryny na regenerację mięśni szkieletowych, wywołaliśmy uszkodzenia za pomocą zastrzyków CTX w mięśniach TA kontrolnych (nośnik) i starych myszy traktowanych tauryną. Analizy morfologiczne i morfometryczne wykazały, że przy braku urazu (ryc. 1A, B: panele a, b i ryc. 1C) włókna mięśniowe myszy traktowanych tauryną wykazywały nieznacznie zwiększone pole przekroju poprzecznego w porównaniu z kontrolami. Ponieważ homeostaza białek w mięśniach szkieletowych opiera się na równowadze między syntezą białek a degradacją białek, przeanalizowaliśmy następnie poziomy zarówno fosfo-mTOR, jako głównego regulatora syntezy białek, jak i Atrogin-1, jako jednego z głównych regulatorów uczestniczy w katabolizmie białek poprzez układ ubikwityna-proteasom [40]. Nasze wyniki pokazały, że poziomy fosfo-mTOR były znacząco zwiększone w ekstraktach mięśniowych myszy leczonych tauryną, podczas gdy w tym stanie nie ujawniono znaczącej modulacji Atrogin -1 (FBXO32) (Rysunek 1D – F). Dane te pokazują udział szlaku zależnego od mTOR we wpływie tauryny na obserwowany wzrost CSA włókien mięśni szkieletowych. Ponadto, po 1 tygodniu uszkodzenia mięśni, przekrój poprzeczny włókien u myszy traktowanych nośnikiem (CTX) wykazał zwyrodnienie z towarzyszącym ostrym stanem zapalnym i martwicą, a także obecność małych włókien regenerujących, zidentyfikowanych przez jądra centralne ( Rysunek 1G, H: panel c). Z drugiej strony, w uszkodzonych mięśniach starych myszy traktowanych tauryną pojawiły się większe regenerujące się włókna mięśniowe i mniej włókien martwiczych (ryc. 1G, H: panel d), wraz z mniejszą liczbą nacieków. Analiza tych wyników, przedstawiona na diagramach na rycinie 1I, ujawniła, że ​​podawanie tauryny wpłynęło na rozkład wielkości włókien, sprzyjając gromadzeniu się większych włókien regenerujących w porównaniu z kontrolnym uszkodzonym mięśniem. Podsumowując, wyniki te sugerują, że tauryna może stymulować proces regeneracji, pełniąc rolę ochronną w utrzymaniu integralności włókien mięśni szkieletowych oraz sprzyjając przyspieszeniu tworzenia nowych włókien mięśniowych.

3.2. Suplementacja tauryną moduluje odpowiedź zapalną w starzejących się mięśniach

Starzeniu towarzyszy przewlekły ogólnoustrojowy stan zapalny o niskim stopniu złośliwości [51], który może być odpowiedzialny za upośledzoną zdolność regeneracyjną mięśni szkieletowych [52]. Aby zweryfikować, czy zwiększona odpowiedź regeneracyjna obserwowana w uszkodzonych mięśniach myszy leczonych tauryną była związana z modulacją procesu zapalnego, zbadaliśmy obecność makrofagów przez barwienie esterazą. Ryc. 2A, B pokazują, że w wyniku wstrzyknięć CTX wszystkie sekcje mięśni wykazywały zwiększoną liczbę jednojądrzastych komórek zapalnych w porównaniu z odpowiednikami nieuszkodzonymi; jednakże duża liczba makrofagów esterazo-dodatnich obecnych w starym uszkodzonym mięśniu (Figura 2A: panel c i Figura 2B) była znacząco osłabiona w obecności suplementacji tauryną (Figura 2A: panel d i Figura 2B). Wpływ tauryny na zmniejszenie nasilenia stanu zapalnego podczas procesu regeneracyjnego oceniano również poprzez analizę poziomu fosforylowanej izoformy czynnika transkrypcyjnego NF-kB, ponieważ wiadomo, że jej aktywacja w mięśniach szkieletowych prowadzi do degradacji określonych białek mięśniowych , wywołuje stan zapalny i włóknienie oraz blokuje regenerację włókien mięśniowych po urazie [53–55]. Jak pokazano na rycinie 2C, D, fosfo-NF-kB było wykrywalne na bardzo niskich poziomach zarówno w nieuszkodzonych mięśniach kontrolnych, jak i traktowanych tauryną, podczas gdy wysokie poziomy fosfo-NF-kB wykrywane w mięśniach uszkodzonych przez CTX były dramatycznie zmniejszone w mięśni starych myszy, którym podawano taurynę. Całkowite poziomy NF-kB i stosunek między fosfo-NF-kB i NF-kB zostały przeanalizowane i wykazano, że wzrosły, choć nie znacząco, z uszkodzeniami wywołanymi przez CTX, podczas gdy tauryna zapobiegała temu efektowi (ryc. 2C, E, F) . Wyniki te pokazują, że tauryna łagodzi stan zapalny w uszkodzonym mięśniu, zmniejszając poziomy zarówno całkowitego NF-kB, jak i fosfo-NF-kB.

3.3. Tauryna moduluje ekspresję PGC{2}} i MEF2C w mięśniach TA starszych myszy

Aby lepiej zbadać mechanizmy molekularne zaangażowane w pozytywny wpływ tauryny na homeostazę mięśni szkieletowych, oceniliśmy rolę koaktywatora transkrypcji PGC-1. PGC{2}} jest ważnym czynnikiem promującym środowisko przeciwzapalne w mięśniach. Ponadto doniesiono, że PGC-1 może poprawiać nie tylko funkcję mięśni, ale także morfologię i integralność włókien mięśniowych, co wskazuje na potencjalną rolę PGC-1 w naprawie i regeneracji włókien. Wykazano, że we współpracy z czynnikiem transkrypcyjnym MEF2C, PGC{7}} reguluje określanie typu włókien mięśni szkieletowych, promując przejście z włókien glikolitycznych na bardziej odporne na utlenianie [56,57].

Tak więc, stosując analizę RT-PCR, oceniliśmy poziomy ekspresji mRNA PGC{1}} i MEF2C w ekstraktach TA młodych, starych i starych myszy traktowanych tauryną, aby określić, czy podawanie tauryny indukowało zmiany transkrypcyjne wyżej wymienionych czynników w porównaniu z tym, co zaobserwowano pod jego nieobecność. Młode myszy w zdrowych warunkach wykorzystano do oceny poziomów ekspresji tych czynników. Jak pokazano na rycinie 3A, B, przy braku tauryny nie zaobserwowano zmian w poziomach PGC-1 i jedynie niewielki spadek poziomów MEF2C w ekstraktach starych myszy w porównaniu z młodymi, podczas gdy poziomy mRNA obu cząsteczek były znacząco podwyższone u starych myszy poddanych dootrzewnowym iniekcjom tauryny. Wykazano, że wolnokurczliwe włókna oksydacyjne typu I (wyrażające wolnokurczliwą izoformę łańcucha ciężkiego miozyny, wolne MHC) są bardziej odporne na uszkodzenia i różnorodne warunki zanikowe niż szybkokurczliwe włókna glikolityczne typu IIb [29]. W przypadku kilku patologii mięśni, w tym sarkopenii, fenotyp mięśni najszybszych jest poważniej upośledzony w porównaniu z mięśniami wolnokurczliwymi, a większa wrażliwość włókien typu IIb może wynikać z mniejszej zawartości PGC-1 w porównaniu z włóknami włókien oksydacyjnych [58,59]. Tutaj pokazaliśmy za pomocą analizy Western blot, że mięśnie TA starych myszy wyrażały bardzo niskie poziomy izoformy wolnego MHC w porównaniu z ekstraktami mięśniowymi pochodzącymi z młodych; jednak ekspresja powolnego MHC wzrosła w ekstraktach mięśni myszy traktowanych tauryną (ryc. 3C, D). Ponadto analiza Western blot izoformy fast-MHC wykazała, że ​​w obecności tauryny jej ekspresja była znacznie zwiększona w porównaniu z tym, co zaobserwowano w ekstraktach TA pochodzących od starych myszy, którym nie podawano tauryny (Rysunek 3F) . Konsekwentnie, obniżone poziomy MHC (MF20) wykryte w ekstraktach mięśniowych starych myszy, w porównaniu z tymi u młodych myszy, wzrosły po podaniu tauryny. Wyniki te sugerują, że pozytywny wpływ tauryny na homeostazę mięśni szkieletowych starszych myszy może być pośredniczony przez stymulację szlaku PGC1-/MEF2C, sprzyjając możliwemu przesunięciu metabolicznemu włókien mięśniowych w kierunku fenotypu oksydacyjnego i zachowaniu bardziej wrażliwe włókna glikolityczne.

【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】