Wytrzymałość czasowa korzyści wywołanych wysiłkiem fizycznym w zakresie pamięci zależnej od hipokampa i plastyczności synaptycznej u samic myszy Część 2

2.5. Przygotowanie plasterków hipokampa in vitro

Wkrótce po pozyskaniu OLM myszy znieczulono izofluranem, odcięto im głowy, a mózgi szybko usunięto i zanurzono w lodowatej, natlenionej pożywce do sekcji zawierającej (w mM): 124 NaCl, 3 KCl, 1,25 KH 2 PO 4, 5 MgSO 4, 0 CaCl2, 26NaHCO3 i 10 glukozy.

Wszyscy wiemy, że glukoza jest głównym źródłem energii organizmu, ale czy wiesz, że pomaga poprawić pamięć?

Glukoza doskonale wpływa na funkcjonowanie mózgu, ponieważ jest ona głównym paliwem mózgu. Nasze mózgi wymagają stałego dopływu energii do wykonywania różnych złożonych zadań, takich jak myślenie, funkcje poznawcze i pamięć. Wraz ze wzrostem naszej codziennej aktywności wzrasta również zapotrzebowanie mózgu na energię, dlatego musimy spożywać wystarczającą ilość glukozy, aby mózg mógł funkcjonować.

Ponadto badania pokazują, że glukoza może zwiększać zdolności pamięciowe mózgu. Podczas wykonywania zadań związanych z pamięcią mózg potrzebuje dużych ilości glukozy do obsługi komunikacji i przekazywania informacji pomiędzy dużą liczbą neuronów. Jeśli podaż glukozy jest niewystarczająca, wpływa to na funkcję pamięci mózgu. Dlatego uzyskanie wystarczającej ilości glukozy jest jednym z kluczy do utrzymania zdrowego funkcjonowania mózgu.

Istnieje wiele źródeł glukozy, takich jak zboża, owoce, warzywa i wysokiej jakości węglowodany. Musimy jedynie spożywać te produkty w naszej codziennej diecie w rozsądny sposób, aby uzyskać wystarczającą ilość glukozy, promując w ten sposób zdrowy rozwój mózgu.

Krótko mówiąc, glukoza jest jednym z ważnych czynników utrzymujących zdrowie mózgu i może pomóc nam lepiej zapisywać i zapamiętywać informacje. Dlatego prawidłowe odżywianie i spożywanie wystarczającej ilości glukozy jest nie tylko dobre dla organizmu, ale także niezwykle ważne dla mózgu. Widać, że musimy poprawić naszą pamięć. Cistanche desericola może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche desericola może również regulować równowagę neuroprzekaźników, np. zwiększać poziom acetylocholiny i czynników wzrostu. Substancje te są bardzo ważne dla pamięci i uczenia się. Ponadto mięso może również poprawić przepływ krwi i wspomagać dostarczanie tlenu, co może zapewnić mózgowi odpowiednią ilość składników odżywczych i energii, poprawiając w ten sposób jego witalność i wytrzymałość.

Kliknij i poznaj sposoby na poprawę funkcjonowania mózgu

Skrawki koronalne hipokampa (340 μm) (n=11 (0–0–0), 6 (14–0–{ {12}}), 10 (14–7–0), 8 (14–7–2) wycinków od 6, 3, 5 i 5 myszy) przygotowano przy użyciu wibracyjnej krajalnicy do tkanek Leica (model: VT1000S) przed przeniesieniem do zapis interfejsu zawierający podgrzany sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) o następującym składzie (wmM): 124 NaCl, 3 KCl, 1,25, KH 2 PO 4, 1,5 MgSO 4, 2,5 CaCl 2, 26 NaHCO 3 i 10 glukozy i utrzymywany w temperaturze 31 ± 10C. Plastry perfundowano w sposób ciągły tym roztworem z szybkością 1,75–2 ml/min, podczas gdy powierzchnię plasterków wystawiano na działanie ciepłego, wilgotnego 95% O2 / 5% CO2. Rejestrację rozpoczęto po co najmniej 2 godzinach inkubacji.

Pobudzeniowe potencjały postsynaptyczne (fEPSP) rejestrowano z dendrytów wierzchołkowych warstwy promienistej CA1b przy użyciu pojedynczej szklanej pipety wypełnionej 2 M NaCl (2–3 MΩ) w odpowiedzi na stymulację ortodromową (skręcony drut nichromowy, średnica 65 μm) występów Schaffercollateral-spoidłowych w CA1c warstwa promienista. Podano impulsy o częstotliwości 0,05 Hz przy użyciu prądu, który wywołał 50% maksymalnej odpowiedzi wolnej od impulsów. Po ustaleniu stabilnej linii bazowej trwającej 10–20- minut, indukowano długotrwałe wzmocnienie (LTP), dostarczając pojedynczy epizod 5 impulsów „theta”, każdy impuls składający się z czterech impulsów o częstotliwości 100 Hz i samych impulsów oddzielonych 200 ms ( tj. stymulacja wybuchem theta lub TBS). Intensywność stymulacji nie została zwiększona podczas TBS.

Liczby przedstawiono jako średnią ± SEM. Nachylenie fEPSP mierzono przy spadku nachylenia o 10–90%, a dane liczbowe dotyczące LTP normalizowano do ostatnich 20 minut wartości wyjściowych. Pomiary elektrofizjologiczne analizowano za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA, chyba że w tekście określono inaczej a poziom istotności ustalono na poziomie p mniejszym lub równym 0,05.

2.6. RT-qPCR

Tkankę hipokampa grzbietowego trzymano zamrożoną w temperaturze -80 stopni aż do obróbki. RNA wyizolowano przy użyciu zestawów RNeasy Mini Kit (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta i całkowity RNA (50 ng) poddano odwrotnej transkrypcji. Syntezę cDNA przeprowadzono przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności (Roche AppliedScience). Startery zaprojektowano przy użyciu biblioteki Roche Universal Probe Library; wszystkie startery otrzymano z IDT, a sondy z Roche Universal Probe Library i zastosowano do multipleksowania w maszynie Roche Light-Cycle 480 II (Roche).

Dla transkryptu eksonu VI bdnf i Hprt zaprojektowaliśmy test PrimeTime qPCR (IDT), ponieważ nie był dostępny test Universal Probe Library. Zastosowano następujące startery: bdnf ekson I: starter do przodu (5′–3′): GCATCTGTTGGGGAGACAAG, starter do tyłu (5′–3′): TCACCTGGTG-GAACATTGTG, sonda 56, bdnfexon IV: starter do przodu (5′–3′) : GCTGCCTTGATGTTTTACTTTGA, starter wsteczny (5′–3′): AAGGATGGT-CATCACTCTTCTCA, sonda 31, ekson bdnfVI: starter przedni (5′–3′): CTGGGAGGCTTTGATGAGAC, starter wsteczny (5′–3′): GCCTTCATG-CAACCGAAGTA, sonda: / 56-FAM/AGA CAG/Zen/AAGCGTGA-CAACAAT/3IABkFQ/; bdnf ekson IX: starter do przodu (5′–3′): GCCTTTGGAGCCTCCTCTAC, starter do tyłu (5′–3′): AAGGATGGTCATCACTCTTCTCA, sonda 31. Wszystkie sondy docelowe skoniugowano z barwnikFAM.

Wszystkie wartości normalizowano do ekspresji Hprt, w której zastosowano następujące startery: starter do przodu (5′–3′): TGCTCGAGATGTCATGAAGG, starter do tyłu (5′–3′):CTTTTATGTCCCCCGTT-GAC, sonda: /5HEX/AT CAC ATT G/Zen /T GGC CCT CTGT/3IABkFQ/. Normalizacja wartości jest dostosowana do wyrażenia Hprt. Dane i analizy statystyczne wykonano przy użyciu autorskich algorytmów firmy Roche oraz oprogramowania REST 2009 opartego na metodzie Plaffla (Pfaffl, 2001; Pfaffl i in., 2002).

2.7. Analiza statystyczna

Wielkości próbek w tym badaniu były podobne do tych powszechnie stosowanych w tej dziedzinie, w tym tych podanych w poprzednich publikacjach (np. Butler i in., 2019; Keizer i in., 2021; Kwapis i in., 2018, 2020 ; López i in., 2019; Vogel-Ciernia i in., 2013), chociaż nie zastosowano żadnych metod statystycznych w celu wstępnego określenia wielkości próbek. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowej ANOVA (ryc. 1, 2D, 3B, 4, S1C – F, S2 C – F) lub dwukierunkowej ANOVA (ryc. 2A – C, S1A – B, S2 A – B) a następnie testy t skorygowane przez Tukeya w celu porównania poszczególnych grup. W grupie przeprowadzono proste zaplanowane porównania w celu oceny wyników wskaźnika dyskryminacji (DI), aby porównać trening i test DI za pomocą testu t-Studenta (ryc. 1D). Dwuczynnikowa analiza ANOVA obejmowała czynniki fazy rujowej i stanu wysiłku (ryc. 2A – B), fazę rui i dzień (ryc. 2C) lub stan i dzień wysiłku (ryc. S1 A – B, S2 A – B). Wszystkie statystyki wykonano za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 8. Główne efekty i interakcje wszystkich ANOVA są opisane w tekście. Wszystkie analizy były dwustronne i wymagały istotności o wartości 0,05. Słupki błędów na wszystkich rysunkach przedstawiają SEM.

3. Wyniki
3.1. Ćwiczenia umożliwiają tworzenie pamięci długotrwałej w warunkach podprogowych u samic myszy

Wcześniej wykazaliśmy, że 14 dni ćwiczeń u samców myszy ułatwia uczenie się w podprogowych warunkach akwizycji zadania OLM, co zniosło opóźnienie po 7 dniach siedzącego trybu życia (Butler i in., 2019). Co więcej, podprog 2d reaktywacji ćwiczeń po tym okresie opóźnienia w trybie siedzącym może ponownie wykorzystać początkowe korzyści ćwiczeń 14d, aby wywołać korzyści w zakresie funkcji poznawczych. Na poziomie molekularnym indukowany wysiłkiem fizycznym poziom BDNF w hipokampie również ulega znacznemu zmniejszeniu od 7 do 14 dni po wysiłku i można go ponownie złagodzić podczas kolejnej 2-dniowej sesji jazdy na kołach (Berchtold i in., 2005, Berchtold i in., 2010). Łącznie: paradygmat ćwiczeń składający się z 14 dni ćwiczeń początkowych, 7 dni opóźnionego trybu życia i 2 dni ćwiczeń reaktywacyjnych wydaje się oddawać czasową dynamikę korzyści wywołanych ćwiczeniami u mężczyzn.

Oznacza to, że początkowe ćwiczenie wiąże się z korzyściami poznawczymi, które pomimo tego, że po zakończeniu ćwiczeń stają się uśpione, można je ponownie aktywować poprzez kolejne ćwiczenia na niskim poziomie. Dlatego sprawdzamy, czy podobne parametry ćwiczeń również angażują i utrzymują korzyści poznawcze wynikające z ćwiczeń u kobiet. Poddaliśmy samice myszy różnym schematom ćwiczeń, które składały się z ćwiczeń początkowych (14d lub 0d), po których następował siedzący tryb życia (7d lub 0d) i ćwiczeń reaktywujących (2d lub 0d ) przed akwizycją i testem OLM (ryc. 1A).

Aby zbadać korzystny wpływ ćwiczeń na wydajność pamięci, myszy poddano 3-minutowej sesji akwizycji podprogowej, podczas której poznano różne lokalizacje (A1 i A2) dwóch identycznych obiektów. U samców myszy ten czas trwania treningu wykazano jako podprog kodowania u zwierząt prowadzących siedzący tryb życia (Butler i in., 2019; Intlekofer i in., 2013; Malvaez i in., 2013; McQuown i in., 2011). W dniu testu jeden z obiektów znajdujących się w pierwotnych lokalizacjach został przeniesiony do nowej lokalizacji (A3) i zbadano czas poświęcony na eksplorację lokalizacji każdego obiektu. Biorąc pod uwagę, że myszy wykazują wrodzoną preferencję dla nowości, długoterminowy OLM objawia się większą eksploracją lokalizacji nowego obiektu w porównaniu z obiektem w ustalonej lokalizacji.

Parametry ćwiczeń wpłynęły na wydajność pamięci w dniu testu (ryc. 1D; jednoczynnikowa ANOVA, grupa F (3,27)=7.66, p=0.{{10}} 007), gdzie 14 dni początkowych ćwiczeń (14–0–0) doprowadziło do doskonałej wydajności pamięci długoterminowej w porównaniu z siedzącą grupą kontrolną ({{ 22}}–0–0) (ryc. 1D test post hoc Tukeya, str.=0.003). 7-dniowe opóźnienie w prowadzeniu siedzącego trybu życia spowodowało gorszą wydajność w porównaniu z grupą ćwiczącą początkowo 14–0–0 (ryc. 1D test post hoc Tukeya, p =0.007) i nieistotną różnicą w porównaniu z grupą kontrolną (0–0–0) (ryc. 1D post-hoctest Tukeya, s.=0.985).

Aby zbadać, czy korzyści z początkowych ćwiczeń utrzymują się przez cały okres opóźnienia w siedzącym trybie życia, grupę zwierząt poddano 2-dniowemu ćwiczeniu reaktywacyjnemu przed uzyskaniem OLM po opóźnieniu w trybie siedzącym (14–7–2). Myszy w kohorcie ćwiczeń aktywujących (14–7–2) wykazywały znacząco wyższe wyniki DI w porównaniu z obiema grupami kontrolnymi prowadzącymi siedzący tryb życia (0–0–0) (ryc. 1D test post hoc Tukeya, str.=0.019) i kohorty prowadzące siedzący tryb życia (14–7–0) (ryc. 1D test post hoc Tukeya, s.=0.043).

Porównania wewnątrzgrupowe (ryc. 1D, istotność oznaczona symbolem # w słupkach) wyników DI z dnia nabycia w porównaniu z dniem testu ujawniają wyższe wyniki DI podczas testu w porównaniu ze szkoleniem tylko dla 14–0–{{4} } (t (12)=8.449, p=0.00{{20}}1) i grupy 14–7–2 (t (14)= 4.991, p=0.0002), ale nie 0–{{55 }}–0 (t (14)=1.871, p=0.082) lub 14–7–0 grupy (t(14 ) {{30}}.844, s.=0.086), co dodatkowo potwierdza pomyślną długoterminową formację OLM tylko w ćwiczeniu początkowym (14–0–0) i ćwiczeniu reaktywującym (14–7 –2) kohorty. Na wydajność testu nie miały wpływu różnice w czasie eksploracji obiektu w dniu testu (ryc. 1E; jednokierunkowa ANOVA: F (3,27)=2.264, p=0.1038). Co ważne, każda grupa ćwicząca przyzwyczaiła się do kontekstu eksperymentalnego, mierzona poprzez znaczne zmniejszenie przebytego dystansu i średniej prędkości w sesjach przyzwyczajania (rysunek uzupełniający S1 A – B; dzień 1 vs 6 post hoctest Tukeya, p < 0,05 dla 0–0–0 , grupy 14–7–0 i 14–7–2; p=0.07 dla grupy 14–0–0).

Podczas sesji akwizycji myszy we wszystkich grupach wykazywały stosunkowo niskie i podobne wyniki w zakresie wskaźnika dyskryminacji (DI), co wskazuje na brak preferencji dla któregokolwiek dnia szkolenia z zastrzeżeniami w lokalizacjach A1 i A2 (ryc. 1B; jednokierunkowa ANOVA, DI: Grupa F (ryc. 1B; jednokierunkowa ANOVA, DI: Grupa F ( 3,27) =2.604, s.=0.0724). Ogólna eksploracja obiektów była również podobna pomiędzy grupami (ryc. 1C; jednokierunkowa ANOVA, DI: grupa F (3,27)=1.243, p=0.3137), co wskazuje, że preferencje lub różnice w obiektach w eksploracji nie przyczyniają się do zaobserwowanych różnic w wynikach testu. Łącznie dane te pokazują, że 14 dni początkowego ćwiczenia poprawia tworzenie pamięci o lokalizacji obiektu w warunkach akwizycji podprogowej u samic myszy. Efekt ten utrzymuje się przez cały okres opóźnienia siedzącego trybu życia, a korzyści można ponownie uzyskać podczas sesji ćwiczeń 2dreaktywujących.

3.2. Faza rujowa wpływa na dobrowolną aktywność w zakresie jazdy na kołach, ale nie na wydajność OLM

Cykl rujowy samic gryzoni trwa zazwyczaj 4–5 dni, podczas których hormony reprodukcyjne w naturalny sposób podlegają wahaniom (Becker i in., 2017; Becker i Koob, 2016). Rzeczywiście, aktywność jazdy na kółkach zmienia się w trakcie cyklu rujowego, co sugeruje rolę krążących hormonów płciowych w modulowaniu aktywności fizycznej samic gryzoni (Novak i in., 2012; Sherwin, 1998). W związku z tym porównujemy dystans biegu w różnych fazach cyklu rujowego, aby ocenić rolę cyklu rujowego na zachowanie podczas jazdy na kołach.

Jeśli chodzi o uczenie się i pamięć, niektóre badania nie wykazują wpływu fazy rujowej na behawioralną wydajność zadań związanych z pamięcią przestrzenną (Berry i in., 1997; Ter Horst i in., 2013; Keizer i in., 2017), inne sugerują inaczej (Cordeira i in., in., 2018; Hokenson i in., 2021; Milad i in., 2009; Pompili i in., 2010; Tuscher i in., 2015; Warren i Juraska, 1997; Trask i in., 2020), w tym zwiększoną wydajność zadanie OLM w fazie proestrus i rui (Frick i Berger-Sweeney, 2001; Frye i in., 2007; Paris i Frye, 2008; Pompili i in., 2010).

Dlatego też porównujemy również wyniki OLM pomiędzy etapami rui podczas pozyskiwania i dni badania, aby zidentyfikować jakikolwiek wpływ cyklu rujowego na wyniki OLM w grupie. Ze względu na małą wielkość próbki, myszy w fazie proestrus i rui zgrupowano, a myszy w metestrus i diestrus umieszczone w innej grupie w analizie rui po nabyciu i odzyskaniu. W analizie dystansu biegu codzienny bieg został wykreślony z fazami rujowymi załamanymi ze względu na małą wielkość próby i przeanalizowany z rozdzieleniem wszystkich faz podczas oceny średniego dystansu biegu w początkowym okresie 14-dni.

W ocenie codziennego biegu nie zaobserwowano wpływu rui na dystans biegu (ryc. 2A; dwukierunkowa ANOVA, faza F (1,63)=0.10, p=0.748; faza × Dzień F (13 424) =0,66, p=0,798), ale zaobserwowano wpływ fazy rujowej, gdy fazy rujowe zostały oddzielone i oszacowano średni dystans biegu (ryc. 2B; jednokierunkowa ANOVA, faza F(3,511)=2.88, p=0.035), gdzie samice w okresie rui biegały znacznie więcej niż samice w okresie międzystrusowym (ryc. test post hoc Tukeya, p=0 .034), ale nie fazy proestrus (p=0.133) ani metestrus (p=0.949).

Faza rujowa podczas treningu (ryc. 2C; dwuczynnikowa ANOVA, faza F (1,23)=0.11, p=0.738; faza × grupa ćwiczeń F (3,23) {{10 }}.70, p=0.559) lub dzień testu (ryc. 2D; dwuczynnikowa ANOVA, faza F (1,23)=1.79, p=0.193 ; Faza × Grupa ćwiczeń F(3,23)=0.20, p=0.894) nie miała wpływu na wydajność. Łącznie nasze dane wskazują, że zgodnie z innymi raportami na temat rui i dystansu biegu, myszy w okresie rui powodują większy ogólny dystans biegu.

3.3. Wzmocnione wysiłkiem fizycznym LTP w hipokampie utrzymuje się przez cały czas braku aktywności

Jak pokazano powyżej, nasze paradygmaty ćwiczeń ułatwiają długoterminowe OLM po 14 dniach ćwiczeń i 2 dniach ćwiczeń reaktywujących. Dlatego zapytaliśmy, czy plastyczność synaptyczna hipokampa również uległa poprawie w wyniku uczenia się wspomaganego ćwiczeniami u tych samych zwierząt (ryc. 1A). Pobrano ostre wycinki hipokampa i przetworzono je w celu zmierzenia nagrań wzbudzeniowych potencjałów postsynaptycznych pola (fEPSP) z warstwy promienistej CA1b w odpowiedzi na stymulację projekcji poboczno-spoidłowych Schaffera w warstwie promienistej CA1c.

Aby zbadać zmiany w plastyczności synaptycznej po uczeniu się, zastosowaliśmy pojedynczy ciąg stymulacji 5 impulsami teta (TBS) w celu wywołania długotrwałego wzmocnienia (LTP) w wycinkach zebranych podczas okna konsolidacji pamięci, 1 godzinę po pozyskaniu OLM. Donoszono wcześniej, że ta zależna od BDNF forma stymulacji indukuje stabilne wzmocnienie u myszy (Acharya i in., 2019; Keizer i in., 2021; Kramár i in., 2004; Kwapis i in., 2018; Vogel-Ciernia i in., 2013; White i in., 2016). Dwadzieścia minut po TBS nachylenie fEPSP zaczyna się stabilizować, gdy LTP wchodzi w fazę konsolidacji, podczas której zachodzą dynamiczne zdarzenia synaptyczne w celu utrzymania długoterminowej siły synaptycznej (G. Lynch, 1998).

W skrawkach przygotowanych od wszystkich myszy TBS powodował natychmiastowe silne wzmocnienie, które zanikało, a następnie stabilizowało się w ciągu kolejnych 20 minut (ryc. 3A). Stabilny LTP, mierzony 50–60 min po TBS, zaobserwowano w warunkach ćwiczeń (ryc. 3B; jednokierunkowa ANOVA F (3,31) =9.32, p=0.0002), gdzie wszystkie grupy poddane ćwiczeniom wykazywały wzrost średniego wzmocnienia w stosunku do kontroli siedzącego trybu życia (14–0–0: p=0.003, 14–7–0: p {{21} }.0002, 14–7–2: p=0.033), co wskazuje na zwiększoną plastyczność synaptyczną. Aby sprawdzić, czy to wzmocnienie synaptyczne było spowodowane zmianami w podstawowej funkcji neuronów w hipokampie, wygenerowaliśmy krzywe wejścia/wyjścia i zmierzyliśmy zmiany w facylitacji sparowanych impulsów.

Nie było znaczącej różnicy między grupami pod względem nachylenia krzywych dla odpowiedzi nachylenia fEPSP w odniesieniu do wielkości siateczki włókien (ryc. 3C; jednokierunkowa ANOVA F (3,31)=0.35, p= 0. 79) lub facylitacja impulsów sparowanych (ryc. 3D; dwukierunkowa ANOVA, grupa: F (3,31)=1.49, p =0.24, interakcja: F (6,62) 1,70, s.=0.13). Łącznie dane te sugerują, że początkowy okres ćwiczeń zwiększa plastyczność synaptyczną hipokampa, która utrzymuje się nawet po zaprzestaniu ćwiczeń i po reaktywującej sesji ćwiczeń bez zmiany podstawowych funkcji neuronalnych. Warto zauważyć, że to długotrwałe wzmocnienie LTP w hipokampie jest niespójne ze zmniejszoną wydajnością OLM obserwowaną po siedzącym trybie życia, o którym mowa w dyskusji.

For more information:1950477648nn@gmail.com