Jak białka naprawcze błony komórkowej regulują transdukcję sygnału czynnika transkrypcyjnego w celu kontrolowania zwłóknienia nerek?

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Haichang Li

Nerkazwłóknienie jest związane z postępem ostregonerkauszkodzenie przewlekłej choroby nerek. Wykazano, że MG53, białko naprawcze błony komórkowej, chroni przed uszkodzeniem komórek nabłonka nerki i ostrym uszkodzeniem nerek. Tutaj oceniliśmy rolę MG53 w modulacjinerkazwłóknienie u starzejących się myszy i myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO), znany model postępującego zwłóknienia nerek. Myszy z ablacją MG53 rozwinęły z wiekiem więcej zwłóknienia śródmiąższowego niż nienaruszone myszy MG53-w tym samym wieku. Podobnie w przypadku braku MG53,nerkazwłóknienie było przesadne w porównaniu z myszami z nienaruszonym MG53 w nerce z zablokowaniem w porównaniu z nerką przeciwstronną bez zablokowania lub nerkami myszy operowanych pozornie. Zatkany moczowódnerkiod myszy z niedoborem MG53 wykazywały również znacznie większy stan zapalny niż nerki z niedrożnością moczowodu od nienaruszonych myszy MG53. Eksperymenty in vitro wykazały, że MG53 może wnikać do jąder proksymalnych komórek nabłonka kanalików i bezpośrednio oddziaływać ze składnikiem p65 czynnika transkrypcyjnego NF-kB, dostarczając możliwego wyjaśnienia nasilenia stanu zapalnego przy braku MG53. Aby to przetestować, myszom poddanym UUO podano wzmocnioną ekspresję MG53 przez zmodyfikowane komórki lub bezpośrednie dostarczanie rekombinowanego białka. Zmniejszyło to aktywację i stan zapalny NF-kB oraz osłabiło zwłóknienie nerek. W związku z tym MG53 może odgrywać terapeutyczną rolę w leczeniu przewlekłego zapalenia nerek, a tym samym zapewniać ochronę przed:zwłóknienieco prowadzi do fenotypu przewlekłej choroby nerek.

Cistanche tubulosa zapobiega chorobie nerek, kliknij tutaj, aby pobrać próbkę

Tłumaczenie Przewlekłe zapalenie prowadzi do przebudowy włóknistej, która może również leżeć u podstaw przejścia od ostrego uszkodzenia nerek do przewlekłej choroby nerek. Aktywacja białkowego zapalnego czynnika transkrypcyjnego jądrowego czynnika kB (NF-kB) bierze udział w patogenezie zapalenia nerek. W tym miejscu przedstawiamy dowody na to, że MG53, wcześniej zidentyfikowane białko naprawcze błony komórkowej, bezpośrednio oddziałuje z NF-kB i zmniejsza jego aktywność transkrypcyjną. Jednocześnie egzogennie podawany MG53 może zmniejszać przebudowę zwłóknieniową nerki w stanie zapalnym. Odkrycia te wskazują na ochronne wzajemne oddziaływanie między MG53 i NF-kB w celu złagodzenia rozwoju zwłóknienia nerek, w którym pośredniczy zapalenie. Farmakologiczne podawanie MG53 może być obiecującym podejściem do leczenia postępującego zwłóknienia nerek.

Dysfunkcja nerek, którą można sklasyfikować jako ostre uszkodzenie nerek (AKI) lub przewlekłą chorobę nerek (CKD), urosła do rozmiarów epidemii w starszych populacjach. W 2017 r. zachorowalność na PChN osiągnęła 14,5% osób w wieku 65 lat i starszych, co spowodowało, że wydatki na Medicare na leczenie przekroczyły 84 miliardy dolarów.^1,2AKI i PChN występują częściej u osób starszych, głównie z powodu zwiększonej podatności na urazy oraz zmniejszonej zdolności do naprawy starzejącej się nerki. Badania kliniczne wykazały, że PChN jest głównym czynnikiem ryzyka AKI i odwrotnie, epizody AKI mogą przyspieszyć progresję PChN w kierunku schyłkowej niewydolności nerek. Obecnie leczenie AKI jest głównie wspomagające, a leczenie utrwalonej przewlekłej choroby nerek koncentruje się na spowolnieniu progresji poprzez hamowanie układu renina-angiotensyna-aldosteron, a obecnie prawdopodobnie poprzez hamowanie kotransportera sodowo-glukozowego-2.^3,4

W zależności od ciężkości uszkodzenia, komórki kanalików proksymalnych, będące głównym celem ostrego uszkodzenia, mogą podlegać zmianom w przebiegu cyklu komórkowego,5,6 metabolizmu,7 wydzielaniu cytokin zapalnych i profibrotycznych białek lub częściowemu przejściu nabłonkowo-mezenchymalnemu,8 które określi, czy przebudowa/naprawa będzie skuteczna, czy nieprzystosowana i spowoduje zwłóknienie nerek, cechę charakterystyczną CKD.

zmniejszone zaopatrzenie naczyń i wytwarzanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i obejmuje utratę komórek nabłonka i akumulację kolagenu, aktyny mięśni gładkich i fibronektyny; ma również wysoką korelację z pogorszeniem funkcji nerek.

Przewlekły stan zapalny prowadzi do przebudowy włóknistej, która może również leżeć u podstaw przejścia od AKI do PChN.11–13 Zbiorcze badania sugerują udział czynnika transkrypcyjnego jądrowego czynnika kB (NF-kB) w patogenezie zapalenia nerek spowodowanego infekcją, urazem, lub transplantacji.11,12,14 Aktywacja kanonicznego szlaku NF-kB rozpoczyna się aktywacją inhibitora kinazy NF-kB (IkB), co prowadzi do fosforylacji i degradacji IkBa oraz jądrowej translokacji heterodimerów NF-kB.15 Aktywacja sygnalizacji NF-kB w komórkach nabłonka nerki i naciekające komórki odpornościowe może być wywołana przez czynniki patofizjologiczne, takie jak ekspozycja na lipopolisacharydy (LPS) lub uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne.16 Badania profilowania molekularnego ujawniają nfkb1 jako główną przyczynę zwłóknienia nerek.¹⁷Oprócz komórek kanalików nerkowych, do uszkodzenia nerek, zapalenia i przebudowy zwłóknieniowej przyczyniają się również komórki wrodzonej odporności, takie jak makrofagi i komórki dendrytyczne.^13,18–20

cistanche jest skuteczny w leczeniu dysfunkcji nerek

Coraz więcej dowodów sugeruje, że czynniki wydzielnicze pochodzące z mięśni (tj. miokiny) modulują fizjologię ogólnoustrojową poprzez przesłuchy tkankowe, aby wpływać na progresję chorób nerek.²¹MG53 (nazywany również TRIM72) to białko z motywem trójskładnikowym wzbogaconym w mięśnie (TRIM) o krytycznej funkcji w naprawie błony komórkowej.22,23 Białka z rodziny TRIM mają różne funkcje, od regulacji sygnalizacji immunologicznej po naprawę tkanek.²⁴Naprawa błony za pośrednictwem MG53- jest zaangażowana w łagodzenie ostrego uszkodzenia mięśnia szkieletowego,²⁵nerki,²⁶serce,²⁷ płuca,28 mózgów,^29,30i skóry.³¹Nasze poprzednie badania wykazały niski poziom ekspresji MG53 w nerkach, co jest kluczowym elementem ochrony przed AKI, a myszy z niedoborem MG53 (mg53 / ) były bardziej podatne na AKI wywołane stresem.²⁶Niedawno wykazaliśmy również, że utrzymujące się podwyższenie poziomu MG53 w krążeniu wzmaga naprawę i regenerację uszkodzeń tkanek.32 Względna rola nerkowo-specyficznego i zewnętrznego krążącego MG53 w modulowaniu zwłóknienia nerek podczas postępującej PChN jest wciąż nieznana.

Ostatnio rozwinęła się rosnąca rola MG53 w modulowaniu ochrony tkanek poprzez hamowanie stanu zapalnego, zwłaszcza poprzez modulację sygnalizacji NF-kB. Na przykład, MG53 osłabia neurotoksyczność indukowaną przez LPS i stan zapalny układu nerwowego poprzez hamowanie szlaku TLR4/NF-kB33, a sercowy MG53 reguluje ekspresję KChIP2 w celu kontrolowania przebudowy elektrofizjologicznej podczas przerostu sercowo-naczyniowego.34 Ponadto wykazaliśmy podwójną funkcję MG53 w zapobieganie nieprzystosowawczej odpowiedzi hiperzapalnej podczas subletalnej infekcji wirusem grypy A, charakteryzującej się nadmierną produkcją interferonu-b, poprzez tłumienie aktywacji IRF3/NF-kB i hamowanie nieprawidłowej wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2þ w makrofagach.35 Ponadto, po śmiertelnej dawce wirusa grypy A infekcji wirusowej, wykazano, że MG53 zapobiega śmiertelności i uszkodzeniom płuc, nie poprzez bezpośredni wpływ na miana wirusa per se, ale poprzez łagodzenie burzy cytokin (interferon-b, interleukina-6 i interleukina-1b) poprzez regulację ujemną inflamasomu NLRP3 i zapobieganiu piroptozie płuc.36 Ponadto, przewlekłe leczenie wysokimi dawkami egzogennego MG53 było powiązane z supresją NF-kB – mediowane zapaleniem w starszym sercu.37 Badania te sugerują, że MG53 może modulować nieprawidłową sygnalizację NF-kB podczas zapalenia, ale nie zbadano, czy występuje to w kontekście zapalenia nerek.

Postulowaliśmy, że MG53 reguluje stan zapalny nerek poprzez modulowanie aktywności transkrypcyjnej NF-kB i w ten sposób może osłabiać zwłóknienie nerek, które występuje w wyniku przewlekłego zapalenia. Niniejsze badanie podjęto, aby odpowiedzieć na tę hipotezę.

cistanche jest skuteczny w leczeniu chorób nerek

METODY

Badania na zwierzętach

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals oraz protokołami zatwierdzonymi przez Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committee. Dopasowany wiekowo typ dziki (WT) lub mg53^-/-Użyto szczepu 129S1/SvImJ, który nie pochodził z tego samego miotu22, aby ustalić rolę MG53 w modulowaniu zwłóknienia nerek zależnego od wieku i wywołanego jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO). Myszy C57B6/J (9-10 tygodni) zakupiono z Jackson Labs.

W badaniach nad uszkodzeniem nerek myszy (9-12 tygodni) poddano UUO w celu wywołania zwłóknienia nerek. Myszy znieczulano izofluranem (1,5% -2,0%), aby zapewnić głęboką płaszczyznę znieczulenia. Procedurę UUO przeprowadzono przez dwukrotne podwiązanie lewego moczowodu za pomocą 5-0 jedwabiu chirurgicznego zgodnie z opublikowanymi protokołami.38 Myszy pozorowane miały tylko nacięcie skóry brzucha. Aby ocenić wpływ rhMG53 na obturacyjne uszkodzenie nerek, 1 grupa myszy UUO otrzymywała rhMG53 (2 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, rozpoczynając natychmiast po operacji UUO (dzień 0), a następnie codziennie przez 7 dni, z 2 dodatkowe dawki w dniach 9 i 11. Grupa kontrolna myszy UUO otrzymywała iniekcje soli fizjologicznej według tego samego schematu. Myszy uśmiercono w 12 dniu po operacji UUO, nerki poddano perfuzji in situ roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i pobrano próbki tkanek z nerki UUO i nerki kontralateralnej do analizy histologicznej i Western blot.

W osobnych badaniach WT i mg53^-/-myszy przeszły operację UUO lub pozorowaną i zostały zabite w 7 dniu po operacji. MG53 podano myszom stosując podejście oparte na terapii komórkowej.39 Makrofagi RAW 264,7 zostały zakażone cząsteczkami wirusa wiśni Ad tPA-MG53-zależnymi od doksycykliny (DOX) przez 24 godziny. Zakażone komórki (w stężeniu {{10}}/100 ml soli fizjologicznej na mysz) wstrzyknięto myszom do żyły ogonowej natychmiast po zabiegu (wstrzyknięcie w dniu 0). Myszy otrzymały 4 wstrzyknięcia komórek RAW transdukowanych Ad-tPA-MG53 w dniach 0, 1, 3 i 6. Natychmiast po wstrzyknięciu komórek w dniu 0, myszy zostały losowo przydzielone do grupy, która otrzymała i grupy, która nie otrzymała DOX (2 mg/ml w 5% roztworze sacharozy) w wodzie pitnej przez 7 dni, a następnie zabite. Próbki tkanek z nerki UUO i nerki przeciwstronnej pobrano do analizy histologicznej, RNA i białek.

Analizy statystyczne Dane wyrażono jako średnie -SD. Porównanie w grupach przeprowadzono za pomocą testu t-Studenta przy porównywaniu 2 eksperymentalnych badań podstawowych H Li i wsp.: MG53 moduluje NF-kB w włóknieniu nerek 2 Kidney International (2021) -, ---grupy oraz 1-analizę wariancji dla więcej niż 2 grup (Graphpad Prism 8.2; GraphPad), a następnie test wielokrotnych porównań Bonferroniego lub Holma-Sidaka ad hoc. Za istotną statystycznie uznano wartość P <>

Metody uzupełniające Pełne metody obejmujące ocenę histologiczną, pomiary kreatyniny w surowicy, konstrukty plazmidowe, hodowlę komórkową i izolację pierwotnych komórek nabłonka kanalikowego, przygotowanie adenowirusa i infekcję komórek, test translokacji jądrowej NF kB p65, immunohistochemię i obrazy konfokalne, test reporterowy NF-kB lucyferazy, cytokiny Test immunoenzymatyczny, frakcjonowanie tkanek, immunoblotting, koimmunoprecypitacja, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (tabela uzupełniająca S1) i wytwarzanie rhMG53 znajdują się w metodach uzupełniających.

ekstrakt z cistanche tubulosa: leczenie choroby nerek

WYNIKI

Myszy z ablacją MG53 rozwijają zależne od wieku zwłóknienie nerek

Porównaliśmy wpływ starzenia na czynność nerek i zwłóknienie w mg53^-/-i myszy WT. Potwierdziliśmy naszą wcześniejszą obserwację, że chociaż poziomy kreatyniny w surowicy młodych myszy (2 miesiące) zi bez MG53 nie różniły się znacząco, starsze (16-20 miesięcy) mg53-/-myszy wykazywały istotnie wyższe stężenie kreatyniny w surowicy niż dopasowane wiekowo kontrole WT (Figura 1a). Na podstawie barwienia trójchromianem stwierdziliśmy, że mg53-/-myszy miały więcej zwłóknienia nerek w porównaniu z myszami WT, zaczynając w wieku 5 miesięcy i trwając do wieku 20 miesięcy (Figura 1b i c). Do oceny wpływu ablacji MG53 na infiltrację leukocytów, monocytów i makrofagów w 2-miesięcznych i 5-miesięcznych nerkach myszy zastosowano barwienie immunohistochemiczne (Figura 1d i e). Nerki młodych myszy WT i mg53-/- miały podobne poziomy leukocytów wewnątrznerkowych, ale znacznie więcej komórek zapalnych znaleziono w mg53/nerki niż nerki WT u 5-miesięcznych myszy.

Ponadto immunohistochemia aktyny mięśni gładkich i fibronektyny, 2 białek macierzy zewnątrzkomórkowej powszechnie występujących w obszarach zwłóknienia nerek, wykazała nasilone (3- do 8-krotnie) barwienie w kłębuszkach nerkowych i kanalikach śródmiąższowych nerek z { {4}}Miesięczne myszy mg53-/- w porównaniu z 10-miesięcznymi myszami WT (rysunek uzupełniający S1).

UUO indukuje nasilone zapalenie nerek i zwłóknienie w mg53-/- myszy Poziomy MG53 w nerkach wykryte przez immunoblotting znacznie wzrosły 7 dni po UUO (Rysunek 2a). Nerki mg53- /- UUO wykazywały przesadne zwłóknienie, z 30 procentowym dodatkowym obszarem zabarwionym trichromianem, niż nerki WT UUO (ryc. 2b).

MG53 moduluje aktywację NF-kB i lokalizację jądra p65

Aktywność NF-kB (p65) oceniano w modelu UUO. Liczba całkowitego p65 (t-p65) była znacząco zwiększona w nerkach UUO z WT i mg53 / myszy, ale aktywacja NF-kB, oceniana jako fosforylacja p65, była większa (16-krotnie) w mg53 / UUO nerka niż nerka WT UUO (2-krotnie) w porównaniu ze zwierzętami operowanymi pozornie (Figura 3a). Przeanalizowaliśmy względne poziomy RNA transformującego czynnika wzrostu b1 (TGF-b1), inhibitora aktywatora plazminogenu -1 (PAI-1) i kolagenu typu I alfa 1 (Col1a1) w zablokowanej nerce.40 wykrył niski poziom ekspresji genów u zwierząt pozorowanych i podobną indukcję (TGF-b1, w10-krotność; PAI-1, w40-krotność; Col1a1, w40-krotność) w nerce UUO z WT i mg53/ (Figura 3b). W celu zbadania przestrzennego rozmieszczenia MG53 w korze nerkowej w normalnych warunkach przeanalizowano frakcje tkanki nerkowej. Regularnie otrzymywaliśmy 10-razy więcej całkowitego białka cytozolu niż całkowite wyekstrahowane białko jądrowe. Poziomy t-p65 były porównywalne we frakcji cytozolowej między myszami WT i mg53-/-, ale były większe we frakcji jądrowej myszy mg53-/- (Figura 3c). MG53 wykryto we frakcji cytozolu (z tubuliną jako markerem cytozolu). Nieoczekiwanie, znaczna ilość MG53 została wykryta we frakcji jądrowej (z histonem H3 jako markerem frakcji jądrowej).

Aby potwierdzić to odkrycie, zbadaliśmy również lokalizację MG53 we frakcjach mięśni szkieletowych (rysunek uzupełniający S2). Powtórzyliśmy nasze poprzednie badania, w których MG53 lokalizował się w cytozolu i błonie sarkolemalnej (trifosfataza sodowo-potasowa adenozyny jako marker frakcji błony)22,23,25, ale także wykryliśmy wzbogacony jądrowy MG53 z mięśni szkieletowych.

MG53 oddziałuje z p65 w celu kontrolowania aktywności transkrypcyjnej indukowanej czynnikiem martwicy nowotworu-a Aby potwierdzić nasze wyniki frakcjonowania tkanek, przeprowadziliśmy następujące badania immunohistochemiczne. W hodowanych komórkach nabłonkowych kanalików proksymalnych WT, p65 znaleziono głównie w cytozolu, ale przy braku MG53 zlokalizowane w jądrach (Figura 4a). Gdy komórki te traktowano LPS (5 mg) przez 8 godzin, wydzielanie cytokin prozapalnych było znacznie większe w mg53/komórki niż w komórkach WT (Figura 4b).

Ponieważ te dane sugerowały, że MG53 może wchodzić w interakcje z p65 w celu regulacji zapalnej ekspresji cytokin, bezpośrednie oddziaływanie między p65 i MG53 oceniono w testach koimmunoprecypitacji z użyciem komórek HEK293 kotransfekowanych z Flag-p65 i HA-MG53. Zademonstrowaliśmy słabą interakcję (ryc. 4c). Kotransfekcja plazmidów GFP-p65 i RFP-MG53 oraz analiza konfokalna potwierdziły kolokalizację p65 i MG53 (Figura 4d). Następnie określiliśmy ilościowo, czy MG53 wpływa na aktywność transkrypcyjną NF-kB (p65) po stymulacji TNF, mierząc aktywność lucyferazy ze stabilnej transkrypcyjnej linii komórek reporterowych NF-kB/293-GFP-Luc, która została przejściowo transfekowana dowolnym z wektorów pHM6 lub HA-MG53. Komórki reporterowe zawierają transdukowany reporter ekspresji lucyferazy świetlika lentiwirusa kierowany przez minimalny promotor cytomegalowirusa w połączeniu z 4 kopiami konsensusowych elementów odpowiedzi transkrypcyjnej NF-kB (miejsce kB) powyżej. W nieobecności TNF-α w komórkach reporterowych wyrażających białka MG53 wykryto bardzo niską wewnętrzną aktywność lucyferazy. MG53 tłumił aktywność transkrypcyjną NF-kB (p65) wywoływaną przez TNF-a o około 40 procent (Figura 4e).

Nadekspresja MG53 zapobiegała translokacji jądrowej NF-kB p65 po traktowaniu TNF-α NF-kB p65 przeniesiony do jądra po traktowaniu TNF-α w nabłonku kanalików proksymalnych nerki.41 Aby zbadać, czy traktowanie MG53 może osłabiać translokację jądrową NF-kB p65 po stymulacji TNF-α nadekspresjonowaliśmy MG53 w komórkach HKC-8 albo poprzez transdukcję wirusową Ad-tPA-MG53 zależną od DOX, albo przez traktowanie rekombinowanym ludzkim MG53 (rhMG53). Stosując przeciwciało monoklonalne specyficzne dla MG53-, po indukcji zależnej od DOX wykryto MG53 metodą immunoblottingu. MG53 był obecny na bardzo wysokim poziomie w komórkach HKC stransdukowanych Ad-tPA-MG53-8,

odpowiada 1 ng rhMG53/mg lizatu komórkowego. W przeciwieństwie do tego, HKC-8 wychwytywał i wyrażał znacznie mniejszą ilość rhMG53 (rysunek 5a). Wychwyt fluorescencyjnie znakowanego FL rhMG53 przez HKC-8 potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej (rysunek uzupełniający S3). Po traktowaniu TNF-α czas do szczytowej aktywacji p65 wynosił 15 do 30 minut (Figura 5b). W warunkach podstawowych NF-kB p65 znajdował się głównie w cytozolu i nadekspresja MG53 tego nie zmieniła (Figura 5c i d). Jednakże, po stymulacji TNF-α, p65 translokował się do jąder w komórkach HKC-8 nie wykazujących nadekspresji MG53. Dla porównania, translokacja jądrowa p65 spadła o 33 procent (komórki, którym podano rhMG53) do 50 procent (stransdukowane komórki, którym podano DOX) w komórkach z nadekspresją MG53 (Figura 5c i d).

Przeniesienie adaptacyjne zmodyfikowanych komórek RAW do modelu myszy UUO przeprowadzono z komórkami 1 - 106 podanymi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej bezpośrednio po zabiegu UUO. Myszy losowo podzielono na grupę, która otrzymywała normalną wodę pitną (-DOX) i grupę, która otrzymywała DOX (2 mg/ml) w wodzie pitnej. Myszy UUO otrzymywały RAW co drugi dzień, łącznie 4 zastrzyki. Nerki pobrano 7 dni po zabiegu.

Myszy, którym wstrzyknięto zmodyfikowane RAW, a następnie indukowano DOX, wykazywały znacznie zmniejszone (o 30 procent) zwłóknienie nerek w porównaniu z tymi, które nie otrzymały komórek lub te, którym wstrzyknięto zmodyfikowane komórki RAW, ale bez indukcji DOX (66 procent obszaru zwłóknienia; Ryc. 6a i b).

Tylko niewielka populacja RAW/Ad-tPA-MG53 przetrwała nadzór układu siateczkowo-śródbłonkowego do końca eksperymentów. Barwienie immunohistochemiczne potwierdziło, że traktowanie DOX indukowało ekspresję MG53 w nerkach za pośrednictwem RAW (Figura 6c). Co ciekawe, nerki UUO myszy otrzymujących RAW i MG53 indukowanego DOX wykazywały niższy stosunek p-65/t-p65 (o około 40 procent) niż te, które albo nie otrzymały RAW, albo otrzymały RAW bez DOX (Rysunek 6d i e). Zmniejszony poziom p-p65 potwierdzono za pomocą barwienia immunohistochemicznego p-p65 (S536) nerek UUO (Figura 6f). Uważamy, że krążący MG53 dostarczany przez Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX i wychwyt przez komórki kanalików proksymalnych nerki może uczestniczyć w redukcji p-p65 (S536) i zmniejszeniu zapalenia nerek UUO. W porównaniu z nerkami zawierającymi tylko UUO, ekspresja TGF-b1, PAI- 1 i Col1a1 była znacznie zwiększona w nerkach UUO od myszy, którym podano RAW bez DOX (bez indukcji MG53). Podwyższenie tych genów profibrotycznych można przypisać indukcji silnej reakcji przeszczepu allogenicznego z komórek poddanych infuzji do myszy immunokompetentnych. Jednak nerki UUO od myszy, którym podano RAW i którym podano DOX (indukcja MG53) wykazywały znacznie niższy (60-72 procent redukcji) PAI-1 i stosunkowo niższy poziom TGF-b1 i Col1a1 niż myszy bez leczenia DOX (rysunek 6g).

Ogólnoustrojowe podawanie rhMG53 łagodzi aktywację NF-kB i rozwój zwłóknienia u myszy poddanych UUO

Zbadaliśmy, czy rhMG53 wykazywał podobny efekt przeciwwłóknieniowy jak opisana wcześniej terapia komórkami RAW. Nasze wcześniejsze dane farmakokinetyczne wskazywały na krótki okres półtrwania w krążeniu (około 90 minut u gryzoni) rhMG53.42 Myszy tolerowały przewlekłe podawanie od 2 do 6 mg/kg

rhMG5326,37 dobrze, więc zastosowano strategię administracyjną pokazaną na rysunku 7a. Myszom UUO losowo podawano nośnik (sól fizjologiczna) lub rhMG53 (2 mg/kg) codziennie przez pierwsze 7 dni po zabiegu, a następnie co drugi dzień, aż do zabicia 12. dnia. oraz poziomy ekspresji fibronektyny, przy czym poziomy p-p65 nieznacznie wzrosły w nerkach przeciwstronnych w porównaniu z nerkami pozorowanymi. Po UUO wzrósł t-p65 w nerkach. W porównaniu ze zwierzętami, którym podawano sól fizjologiczną, stosunek p{-65/t-p65 w nerkach UUO zwierząt, którym podawano rhMG53- był zmniejszony o około 37 procent, podczas gdy IkBa wzrósł o około 27 procent (Figura 7b i c). Ponadto fibronektyna zmniejszyła się o około 33 procent (ryc. 7b i c). Immunohistochemia potwierdziła obecność rhMG53 w nerkach UUO po leczeniu (Figura 7d). Całkowite zwłóknienie zostało zmniejszone w nerkach UUO leczonych rhMG53-(Figura 7e). Jednak ekspresja RNA TGF-b1, PAI-1 i Col1a1 była podobna u myszy traktowanych solą fizjologiczną lub rhMG53 (Figura 7f).

cistanche jest skuteczny w leczeniu dysfunkcji nerek

DYSKUSJA

MG53 to białko TRIM wzbogacone w mięśnie, początkowo zidentyfikowane jako ważny składnik maszynerii naprawczej błony plazmatycznej.22,26,42,43 Jednak działania MG53 nie ograniczają się do mięśni szkieletowych, a MG53 może być uwalniany do krążenia jako miokina.32 Wcześniej wykazaliśmy, że MG53 może kontrolować stan zapalny podczas uszkodzenia tkanek w odległych narządach.27,29,33,35-37 Niniejsze badanie rozszerza zakres ochrony narządów za pośrednictwem MG53-na nerki. Wnioskujemy, że MG53 może łagodzić zapalenie wewnątrznerkowe i zwłóknienie nerek poprzez blokowanie wywołanej przez cytokiny aktywacji prozapalnego i profibrotycznego czynnika transkrypcyjnego NF-kB. Ten wniosek jest oparty na następujących obserwacjach: (i) genetyczne usunięcie MG53 u zdrowych myszy.

skutkowało pogorszeniem funkcji nerek w miarę starzenia się myszy, któremu towarzyszyło nasilenie zwłóknienia nerek i naciekania nerek przez leukocyty i makrofagi; (ii) w mysim modelu uszkodzenia nerek UUO niedrożność nerek myszy z niedoborem MG53-wykazywała więcej zwłóknień i stanów zapalnych niż myszy z niedoborem MG53-; (iii) wytwarzanie TNF-α i interleukiny-6 przez traktowane LPS proksymalne komórki nabłonka kanalików były osłabione w obecności MG53; (iv) traktowanie lub nadekspresja MG53 w linii komórek nabłonka proksymalnego kanalika zmniejszało aktywację NF-kB indukowaną przez TNFα przez blokowanie translokacji jądrowej składnika p65 z kB (stwierdzono, że MG53 wiąże się bezpośrednio z p65, aczkolwiek słabo); i (v) fosforylacja p65, niezbędny etap aktywacji NF-kB, została zmniejszona w zablokowanych nerkach myszy UUO leczonych rekombinowanym MG53 indukowanym do nadekspresji MG53 w makrofagach. Ponadto, inhibitor aktywacji NF-kB, IkBa, był zwiększony w zablokowanych nerkach myszy UUO, którym wstrzyknięto rekombinant MG53.

Genetyczna delecja MG53 u normalnych myszy pozwalała na niekorzystne skutki starzenia się nerek. Sugeruje to, że obecność endogennego MG53 zapewnia podstawowy poziom ochrony podczas starzenia. Podobnie utrata endogennego MG53 pogorszyła AKI z powodu niedrożności. Nerki UUO akumulowały MG53, prawdopodobnie odzwierciedlając odległą aktywność miokin z mięśni szkieletowych. Pozostaje niejasne, w jaki sposób mięsień MG53 może być rekrutowany do nerek podczas urazu; jednak uszkodzona nerka często rozwija niedotlenienie i ulega stresowi oksydacyjnemu,^44,45sygnały, które mogłyby służyć do rekrutacji MG53. Jeśli tak, ta oś „komórka mięśniowo-nerkowa-odporna” może zostać wykorzystana do złagodzenia uszkodzenia nerek.²⁶a podczas ostrego lub przewlekłego urazu produkcja MG53 może być zwiększona.

NF-kB jest ważnym czynnikiem transkrypcyjnym zapalenia i zwłóknienia w uszkodzeniu nerek i starzeniu się.^14,17,47,48Zostaliśmy poproszeni o zbadanie, czy w działaniu MG53 może pośredniczyć NF-kB, ponieważ obecność MG53 w kompartmencie jądrowym homogenatów nerek sugerowała możliwość interferencji transkrypcyjnej. Nuklearna lokalizacja MG53 nie jest bezprecedensowa. W modelu transgenicznym z nadekspresją MG53 w mięśniu sercowym jądrowy MG53 regulował ekspresję receptora alfa aktywowanego przez proliferatory peroksysomów na poziomie transkrypcyjnym i wpływał na metabolizm lipidów serca. poprzez redukcję cytokin prozapalnych, apoptozy i stresu oksydacyjnego w starzejących się kardiomiocytach.³⁷

Mechanizm molekularny modulowania mobilizacji jądrowej/cytoplazmatycznej p65 przez MG53 pozostaje niejasny. MG53 nie zawiera sygnału lokalizacji jądrowej, ale zawiera 3 przypuszczalne sygnały eksportu jądrowego bogate w N-końcową leucynę, motyw rozpoznawany przez eksportynę białka eksportującego jądrowego.⁵⁰Bezpośrednia interakcja między MG53 i p65 była raczej słaba jako jedyny lub główny destrukcyjny efekt MG53 na aktywację NF-kB. Chociaż wydaje się, że MG53 wpływa na dynamiczny transport nukleocytoplazmatyczny kluczowych składników NF-kB, dokładne mechanizmy pozostają do ustalenia.

Wydaje się, że krytycznym wynikiem renoprotekcji za pośrednictwem MG53- jest zmniejszenie przebudowy zwłóknienia poprzez osłabienie zapalenia, w którym pośredniczy NF-kB. Zwłóknienie nerki jest złożonym procesem obejmującym patologiczne odkładanie się różnych białek ECM.51 Wydaje się, że MG53 ma wyraźny wpływ na białko ECM, fibronektynę. Fibronektyna wzrosła w nerkach UUO z niedoborem MG53 i zmniejszyła się u myszy UUO leczonych MG53. Ekspresja innych białek ECM w obecności i pod nieobecność MG53 jest trudniejsza do zrozumienia. Wcześniej wykazaliśmy, że rhMG53 ujemnie reguluje sygnalizację TGF-b1/Smad i hamuje syntezę białek ECM w badaniu in vitro.31 In vivo transkrypty TGF b1, PAI-1 i Col1a1 nie wzrosły w nerkach UUO z mg53 / zwierzęta z niedoborem. Transkrypty te zmniejszyły się u zwierząt UUO indukowanych do nadekspresji MG53 poprzez podawanie myszy indukowanej wirusem

makrofagi, ale gdy podano rekombinowany MG53, nie zaobserwowano żadnego efektu. Może to być po prostu przypadek wystarczającego dawkowania, ponieważ osiągnięte wewnątrznerkowe poziomy MG53 były znacznie większe u zwierząt, biorąc pod uwagę wektor makrofagów, w przeciwieństwie do rekombinowanego MG53. Ponadto nie mierzono poziomów białka, a zdarzenia potranskrypcyjne mogły modyfikować ECM w UUO. Potrzebne są dalsze badania w celu wyjaśnienia pojawiającej się roli MG53 w modulowaniu określonych białek ECM. Podsumowując, badanie to wykazało, że miokina może pomóc w regulacji stanu zapalnego w odległym narządzie, takim jak nerka, a w przypadku uszkodzenia nerek może pomóc złagodzić i kontrolować stan zapalny. Rysunek 8 przedstawia roboczy model roli MG53 w renoprotekcji. Podczas stymulacji wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMP, takich jak TNF-a) i wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP, takich jak LPS) i stresu niedokrwiennego, w nerkach aktywowany jest sygnałosom NF-kB. MG53 chroni nerki, hamując fosforylację i aktywację sygnalizacji NF-kB, stabilizując IkBa i zmniejszając mobilizację jądra p65, blokując aktywację programów prozapalnych. Chociaż endogenny MG53 może pośredniczyć w tych efektach, sugerujemy, że można zapewnić bardziej solidną ochronę przy użyciu MG53 terapeutycznie, co jest wykonalne w oparciu o zdolność egzogennego MG53 do zmniejszania uszkodzeń w UUO. Dalsze badania są uzasadnione, aby zrozumieć, w jaki sposób ta miokina może być wykorzystywana klinicznie.

korzyści płynące z cistanche: chronią wątrobę i zapobiegają zwłóknieniu

UJAWNIENIE

JM posiada udziały kapitałowe w firmie TRIM-edicine, Inc., która opracowuje rhMG53 do leczenia chorób u ludzi. Patenty na użycie MG53 są w posiadaniu Rutgers University i Ohio State University. Wszyscy pozostali autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów.

PODZIĘKOWANIE

Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR i P-HL) oraz NIH R01-AG062896 (P-HL i BHR). Projekt ten był również częściowo wspierany przez fundusz stacjonarny Lockwood z Uniwersytetu Stanowego Ohio (P-HL) oraz nagrodę od National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS; P-HL, numer nagrody UL1TR002733). Za treść odpowiadają wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentują oficjalne poglądy NCATS lub NIH.

WKŁAD AUTORSKIHL,

PD, P-HL, JM i BHR opracowali i/lub zaprojektowali badania; HL, PD, P-HL, ZL i XZ przeprowadzili eksperymenty, zebrali dane i wykonali analizę danych; PD, P-HL i BHR zinterpretowały wyniki; a P-HL i BHR opracowały, poprawiły i zatwierdziły rękopis. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję.

MATERIAŁ UZUPEŁNIAJĄCY

Plik uzupełniający (PDF) Metody uzupełniające.

Tabela S1.Sekwencje starterów. Rysunek S1. mg53-/- myszy wykazują zwiększone odkładanie białka ECM. Dopasowane wiekowo (w wieku 10 miesięcy) tkanki nerki typu dzikiego (WT) i mg53- /- wybarwiono 40 6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI; niebieski, lewe panele), a- aktynę mięśni gładkich (SMA; zielony, drugie panele), fibronektynę (czerwony, trzecie panele) i połączone (prawy panel). Pręt ¼ 25 mm. Ilościowa ocena obszaru zwłóknienia nerki (n=3 na grupę). Dane przedstawiono jako średnie -SD. Test t-Studenta. ***P <>

Rysunek S2.Dystrybucja mięśnia szkieletowego MG53 między jądro a cytoplazmę. Mięśnie szkieletowe pochodzące od myszy typu dzikiego (WT) ormg53-/- poddano frakcjonowaniu i poddano immunoblottingowi za pomocą wykonanego na zamówienie przeciwciała anty-MG53 (3 mg lizaty) i markerów przedziału komórkowego (20 mg lizatów). Trifosfatazy sodowo-potasowe adenozyny są wykorzystywane jako marker błony komórkowej, histon H3 jako marker jądrowy, a tubulinę jako marker cytozolu.

Rysunek S3.Komórki kanalików proksymalnych nerki HKC-8 specyficznie wychwytują rhMG53 znakowane AlexaFluor 647. rhMG53 (Trimmedicine) i albuminę surowicy bydlęcej (BSA; ThermoFisher Scientific) znakowano zestawami do znakowania przeciwciał Alexa Fluor(AF) (Life Technologies) zgodnie z protokołem producenta. Komórki HKC-8 hodowano na szklanym naczyniu Delta TPG ze szklanym dnem (Bioptechs Inc.) w pożywce Eagle w modyfikacji Dulbecco (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w obecności znakowanych białek, BSA-AF647 (po lewej ) i rhMG53-AF647 (po prawej), przez 24 godziny. Obrazy typu Z-stack zostały wykonane z mikroskopu konfokalnego LSM780 (Zeiss). Obrazy pokazują komórki na dnie szalek. Pręt ¼ 25 mm.

Rysunek S4.Inżynieria komórek RAW w celu pośredniczenia w indukowanej sekrecji MG53. (A) Komórki RAW infekowano Ad-tPA-MG53 przez 24 godziny i traktowano bez (doksycykliny [Dox]) lub Dox (þDox, 1 mg/ml) przez dodatkowe 24 godziny w celu indukcji ekspresji tPA-MG53. Obrazy konfokalne wykazały indukcję ekspresji MG53 (na zamówienie przeciwciało anty-MG53, czerwone, dolne panele) z makrofagopodobnych komórek RAW (barwienie F4/80, zielone, górne panele). Pręty ¼ 25 mm. (B, C) Analiza Western blot lizatów komórkowych (w ilości 0,6, 3 i 6 mg) pod kątem indukowanej ekspresji tPA-MG53 i MG53 z zakażonych komórek RAW (B) i odpowiedniej hodowli koncentraty pożywek (w objętościach 2, 5 i 10ml) (C). Jako wzorce załadowano różne ilości rhMG53 (w ilości 0.2, 1, 0,05 i 0,025 ng). Mw, markery masy cząsteczkowej.