Centralna rola transformującego czynnika wzrostu- (TGF-) w rozwoju zwłóknienia nerek
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
CZĘŚĆ Ⅰ: Rola ludzkich pierwotnych fibroblastów nerek w TGF- 1-urządzenia naśladujące włóknienie, w których pośredniczy
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee i in.
1. Wstęp
Zwłóknienie nerek, ostatni wspólny szlak niezliczonych postępujących chorób nerek, charakteryzuje się wzrostem produkcji białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), spadkiem degradacji macierzy, dysfunkcją interakcji komórka-macierz, transformacją komórek rezydentnych i naciekiem komórek zapalnych.Transformujący czynnik wzrostu-(TGF-) to wielofunkcyjny dimeryczny peptyd, który reguluje procesy biologiczne, takie jak proliferacja i różnicowanie komórek oraz odpowiedzi immunologiczne [1]. Wśród wielu czynników fibrogennych TGF- (Transformujący czynnik wzrostu-) odgrywa kluczową rolę i ma działanie przeciwzapalne. TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)- myszy z niedoborem umierają z powodu masywnego zapalenia. Myszy transgeniczne z nadekspresją TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)są praktycznie zabezpieczone przed rozwojem patologii zwłóknienia nerek, głównie poprzez działanie przeciwzapalne [2]. Właściwości profibrotyczne i przeciwzapalne TGF-(Transformujący czynnik wzrostu-)to miecze obosieczne dotyczące terapeutycznego zastosowania TGF-(Transformujący czynnik wzrostu-)zahamowanie. Podjęto znaczne wysiłki, aby zablokować TGF-(Transformujący czynnik wzrostu-)działanie utrudniające postępnerkowyzwłóknienie[3]. Chociaż do walki wykorzystano wiele podejśćnerkowyzwłóknienieeksperymentalny model oceny obecnie dostępnych leków nie jest idealny.
zapobieganie ziołom cistanchechoroby nerek
Ogólnie rzecz biorąc, badania na zwierzętach odgrywają kluczową rolę w testach przedklinicznych w przewidywaniu farmakokinetyki i skuteczności leków. Istnieją jednak różne różnice między zwierzętami a ludźmi, co skłania nas do kwestionowania dokładności badań skuteczności leków na zwierzętach i testów bezpieczeństwa 4. Poprzednie raporty opierały się na przedklinicznych badaniach na zwierzętach podczas opracowywania leku, aby ocenić nefrotoksyczność i bezpieczeństwo leków. Funkcjonowanie nerek zwierząt jest ponad dwukrotnie wyższe niż nerek człowieka. W związku z tym leki są metabolizowane szybciej u zwierząt niż u ludzi, co utrudnia wyjaśnienie wyników testów toksyczności leków na podstawie badań na zwierzętach. Ponadto wyników eksperymentów na zwierzętach nie można wykorzystać do przewidywania odpowiedzi na leki u ludzi, ponieważ zwierzęta pełnią różne funkcje fizjologiczne. Oparte na zwierzętachzwłóknienie nerekmodele mają trudności z odtworzeniem człowiekazwłóknienie nerek; w związku z tym trwają badania mające na celu pokonanie obecnych przeszkód i zoptymalizowanie platform do odkrywania leków [5].
Technologia „organ-on-a-chip” (OoC) pojawiła się jako nowatorska koncepcja rozwiązania tych problemów. Platforma ta została zaprojektowana z uwzględnieniem obecnych niedociągnięć i okazała się bardzo obiecująca w dziedzinie nefrologii [6]. Ponadto modele OoC mają ogromny potencjał jako zamiennik eksperymentalnych modeli zwierzęcych, zapewniają rozwiązanie różnic międzygatunkowych i mogą pomóc zakończyć debaty na temat okrucieństwa wobec zwierząt i etyki [7]. Istnieje kilka modeli in vitro, które jednocześnie wykorzystują pierwotne fibroblasty nerkowe z komórkami śródbłonka i nabłonka, które są ważnymi komórkami wnerkazwłóknienie. Rola każdej komórki wzwłóknieniejest studiowany oddzielnie; jednak wiedza na temat interakcji komórek jest ograniczona.
W niniejszym opracowaniu opracowaliśmyzwłóknienie- naśladowanie urządzeń wykorzystujących ludzkie pierwotne fibroblasty. Potwierdziliśmy, że TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)zabieg ma różny wpływ nazwłóknienie nerekModel. Warto zauważyć, że fibroblasty odgrywają kluczową rolę jako komórki efektorowe, sprzyjają tworzeniu mikrośrodowiska sprzyjającego zwłóknieniu oraz wydzielają czynniki wzrostu i cytokiny. W związku z tym, w oparciu o tę nową metodę, fibroblasty mogą stanowić idealny system modelu komórkowego do badania chorób nerek. Oceniliśmy, czy fibroblasty pochodzące z włóknistej choroby nerek wpływają na integralność komórek hodowanych w trzech wymiarach (3D). Na koniec przedstawiamy badanie typu proof-of-principle, które demonstruje potencjał człowiekazwłóknienie nerek-naśladowanie urządzeń jako modelu do przewidywania reakcji człowiekazwłóknienie nerek.
efekty cistanche: leczyć infekcję nerek
2. Wyniki
2.1.Identyfikacja alfa aktyny mięśni gładkich (a-SMA) i keratyny-8(KRT-8)przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)w HK-2 komórkach
We wczesnej fazie zbadaliśmy znane markeryzwłóknienieoraz cytoszkielet w dwuwymiarowych (2D) hodowlach. Przeprowadzono testy barwienia immunofluorescencyjnego w celu oszacowania ekspresji -SMA zwłóknienia i markera przejścia nabłonka kanalikowego do mezenchymalnego (EMT) oraz poziomów KRT8 jako markera cytoszkieletu. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że ekspresja -SMA była początkowo słaba, a poziomy KRT8 były wysokie w jednowarstwowych komórkach nabłonka HK-2. Nie było znaczącej zmiany intensywności fluorescencji przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)(5 ng/ml) lub traktowanie specyficznym inhibitorem komórek nabłonka HK-2 przez 24 godziny (Figura 1).
Rysunek 1. Immunofluorescencja pokazuje, że ekspresja alfa-SMA i keratyny-8(KRT8) została utrzymana przez leczenie TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)lub inhibitor w komórkach HK-2.(A) Ekspresja alfa-SMA i (B)CCK-8 nie miała wpływu na komórki HK-2 przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)(5 ng/ml) lub inhibitor. Komórki pierwotnie wysiano z gęstością 1×10 stopni na studzienkę (ac)nietraktowaną kontrolą i df）stymulowano 5ng/mL TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-) lub（gi）10 μM inhibitor（SB431542） przez 24 godziny i utrwalony 4% paraformaldehydem. Następnie komórki barwiono anty- -SMA i antycytokeratyną-8 przez 20 min. Przeprowadzono wspólne barwienie barwnikiem Hoechst H33342 w celu identyfikacji jąder komórkowych. Słupki skali na mikrografach wskazują 200 um.
proszek cistanche poprawia pracę nerek
2.2. Zmniejszenie ekspresji KRT8 przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)na chipie
Następnie oceniliśmy poziomy ekspresji -SMA i KRT8 w HK hodowanych w 3D -2 i całkowitą długość ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej GFP (HUVEC) poddanych działaniu TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)i specyficzny inhibitor. Aby to osiągnąć, najpierw ustaliliśmy wzór chipów tkankowych obejmujący dwa typy komórek, komórki nabłonkowe HK-2 i komórki GFP-HUVEC. Po potwierdzeniu konstruktu odsłoniliśmy chip tkankowy za pomocą TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)(5 ng/ml) lub swoisty inhibitor (10 µm SB431542) przez 24 godz.
Jak pokazano na Rysunku 2A-C, ekspresja -SMA nie została specyficznie zmieniona przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)lub specyficzne leczenie inhibitorem. Jednak ekspresja KRT8 została zmniejszona w dwukomórkowym chipie współhodowanym. Ponadto dodanie inhibitora TGF-ß1 zwiększyło ekspresję KRT8.
Zbadaliśmy tworzenie się trójwymiarowej sieci przypominającej rurkowate naczynia włosowate przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)leczenie w komórkach HUVEC, ponieważ komórki śródbłonka mogą spontanicznie tworzyć trójwymiarową sieć przypominającą rurkowate naczynia włosowate. Zgodnie z naszymi warunkami kulturowymi powstawanie grubych linii uległo znacznemu ograniczeniu. Jednak cienkie linie przypominające kapilary zostały zwiększone w TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)poddane obróbce GFP-HUVEC. W przypadku TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)traktowanie inhibitorem na chipie z hodowli 3D, całkowita długość grubych i grubych linii wykazała odwrotną tendencję do TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)leczenie. Zaobserwowano wzrost długości grubej linii w porównaniu z nietraktowaną grupą kontrolną. Podobny wzór zaobserwowano w średnicy grubej linii w GFP-HUVEC po TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)leczenie i leczenie inhibitorami. Średnica GFP-HUVEC została stłumiona przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)leczenia, ale wzrosła niezależnie od grubości linii przez inhibitor w porównaniu zarówno z kontrolami, jak i TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-). Całkowita długość i średnica grubej linii znacznie się zwiększyły po leczeniu inhibitorem TGF- 1 w porównaniu z nietraktowaną kontrolą i leczeniem TGF- 1. Warto zauważyć, że uzyskane wyniki wskazały na zwiększoną gęstość drobnych naczyń w TGF-(Transformujący czynnik wzrostu-)leczonej grupie w porównaniu do ich nieleczonych odpowiedników. Natomiast gęstość grubych naczyń w TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)leczona grupa była niższa niż w nieleczonej grupie kontrolnej (Figura 2D, E).
Rysunek 2. Ekspresja KRT8 w HK-2 oraz całkowita długość i średnica komórek HUVEC.(A) Immunofluorescencja pokazuje, że ekspresja -SMA została utrzymana, a ekspresja KRT8 dramatycznie obniżona przez leczenie TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)w Hongkongu-2. Komórki wysiano i stymulowano 5 ng/ml TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)lub 10 μm inhibitor （SB 431542） przez 24 godziny i utrwalony 4% paraformaldehydem. Komórki barwiono anty- -SMA i antycytokeratyną-8 przez 20 min. Przeprowadzono wspólne barwienie barwnikiem Hoechst H33342 w celu identyfikacji jąder komórkowych. Ekspresja -SMA(ac) nie uległa zmianie, ale KRT8(df) w komórkach HK-2 i GFP w ekspresji HUVEC (gi) zostały znacząco zmienione przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)(5 ng/mL) i inhibitor (B, C). Na całej długości HUVEC cienkie naczynie zostało powiększone, ale grube naczynie zostało zmniejszone przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-). Zwiększono średnicę zarówno w naczyniach cienkich, jak i grubych. Wyniki te zostały odwrócone przez inhibitor SB431542 (D, E). Słupki skali na mikrografach wskazują 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
do czego służy cistanche: leczenie przewlekłych chorób nerek
2.3. TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)Wpływa na trzy typy komórek chipa o strukturze wieloprzedziałowej
Aby studiować TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)odpowiedzi proponowanego chipa 3D, przeprowadziliśmy immunobarwienie na każdym kompartmencie oddzielnie (ryc. 3). W analizie tej wykorzystano pierwotne ludzkie fibroblasty nerek. Próbki analizowano przy użyciu FACS i potwierdzono, że są pozytywne dla przeciwciała markera fibroblastów. Po inkubacji trzech typów komórek z TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)przez 24 godziny przeprowadzono immunobarwienie w celu oceny ekspresji -SMA i KRT8. Ekspresja a-SMA była podwyższona przez leczenie TGF-1, a przeciwne wyniki zaobserwowano w przypadku TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)leczenie inhibitorem. Odwrotnie, ekspresja KRT8 została obniżona przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)i wykazał przeciwną odpowiedź na TGF-(Transformujący czynnik wzrostu-)inhibitor (Figura 4A-C).
Rysunek 3. Przykładowy obraz ze schematem urządzenia pokazującym wykonanie i harmonogram eksperymentów.(A) Dwa górne obrazy przedstawiają układ. Lewy obraz przedstawia ogólne zdjęcie z góry na dół urządzenia. Dolne zdjęcia pokazują przekrój. Schematyczny widok z wyszczególnieniem wymiarów prowadnic cieczy. (B)Ten rysunek opisuje harmonogramy eksperymentalne dlazwłóknienie- naśladowanie urządzeń. Czteroetapowy proces ładowania dla każdego dołka. Lokalizacja każdego obszaru modelowania hydrożelu, a także umieszczenie pożywki w przekroju od góry do dołu i w przekroju izometrycznym. (1) Łącznie 1,5 ul hydrożelu 1 jest spontanicznie kierowane do kanału centralnego. (2)Kanał centralny jest wypełniony 5uL hydrożelu. (3) Łącznie 10 µl hydrożelu 3 jest wzorowane na dnie zbiornika. （4） Dozuje się łącznie 200 μl pożywki. Czerwona podziałka =9 mm.
Jak pokazano na rysunku 4D-G, długość cienkiej linii przypominającej kapilary została znacznie zwiększona przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)leczenie w GFP-HUVEC. Jednak grubość grubej linii została zmniejszona w TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)poddane obróbce HUVEC. Średnio zmniejszono średnicę cienkich i grubych naczyń w komórkach HUVEC. W przypadku TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)traktowanie inhibitorem na chipie z hodowli 3D, całkowita długość grubych i grubych linii wykazywała tendencję przeciwną do traktowania TGF- 1. Ponadto długość grubej linii została zwiększona w porównaniu z nietraktowaną grupą kontrolną.
Rycina 4. Zmiany hodowanych w 3D HK-2 i HUVEC z pierwotnymi fibroblastami nerek.Całkowite komórki wysiano z gęstością 5×10 stopni na chip 3D i stymulowano 5 ng/mL TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)lub 10 μm inhibitor （SB 431542） przez 24 godziny i utrwalony 4% paraformaldehydem. (A) Komórki w chipie 3D wybarwiono anty-o-SMA i antycytokeratyną -8. Ekspresja -SMA (ac) została zwiększona, a ekspresja KRT8(df) została znacząco obniżona przez TGF- 1(5 ng/ml). Całkowita długość HUVEC; cienkie naczynia były dramatycznie powiększone, a grube zmniejszyły się przez TGF-ß1(Transformujący czynnik wzrostu-)（D, E). Zmniejszono średnicę naczyń cienkich i grubych (F, G). Wyniki te zostały odwrócone przez inhibitor SB431542. Słupki skali na mikrografach wskazują 100 μm.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 moduluje mediator stanu zapalnego i czynniki wzrostu
Następnie zbadaliśmy cytokiny zapalne i czynniki wzrostu w supernatancie; IL-1, FGF-2, TGF- 2(Transformujący czynnik wzrostu-)i TGF- 3(Transformujący czynnik wzrostu-)Wydzielanie białka było dramatycznie wyższe w chipach hodowanych w 3D niż w dobrze hodowanych fibroblastach 2D, mimo że miały one taką samą całkowitą liczbę komórek. Jednak TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-) poziomy były podobne, ponieważ modele z hodowli 2D lub 3D były leczone podobnymi stężeniami TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)(Rysunek 5A-E). W szczególności uwalnianie FGF-2 z ludzkich pierwotnych fibroblastów nerkowych wynosiło 20,9 ± 0,4 pg/dzień/5 × 10 stopni komórek jednowarstwowej hodowli 2D i 3094,8±0,2 pg/dzień/5x10 stopni komórek, w tym komórek HUVEC i HK-2 z chipa hodowanego w 3D w nietraktowanej kontroli. Wydzielanie FGF-2 przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)stymulacja wyniosła 31.0±0.2pg/dzień/5×10 komórek stopnia dla hodowli 2D i 3683,9±0,8 pg/dzień/5×10 stopni dla hodowli 3D -chip hodowlany. Temu wzrostowi produkcji białka FGF-2 w jednowarstwowej hodowli 2D towarzyszył wzrost modelu chipa w hodowli 3D przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)leczenie (Figura 5B).
Rycina 5. Porównanie modeli z hodowlą 2D i 3D jako platform naśladujących zwłóknienie nerek.Komórki wysiano z gęstością 5×10 stopni na studzienkę 2D lub chip 3D i stymulowano 5ng/mL TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)lub 10 µm inhibitor (SB 431542) przez 24 godz. Pierwotne ludzkie fibroblasty nerek zastosowano w modelu hodowli 2D i hodowli 3D. Wykorzystano fibroblasty o gęstości 8x10* hodowane z HUVEC i HK-2. Pierwotny stosunek ludzkich fibroblastów nerkowych do HUVEC lub stosunek F:H wynosił 1:5 do ocenyzwłóknienieZastosowano komórki .HK-2 przy gęstości 2×104. Wykrywanie (A)IL-1, (B)podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-2) i (CE)TGF-beta 1, 2 i 3 w supernatancie przeprowadzono przez analizę multipleksową test immunologiczny na cytokiny i multipleks perełkowy. Każdy słupek reprezentuje średnią ± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Transformujący czynnik wzrostu-).
Cistanche tubolosa korzyści: leczenie chorób nerek
Ponadto oszacowaliśmy ekspresję mRNA cytokin prozapalnych, takich jak IL-1 , IL-6, IL-8 i TNF- . Wyniki zostały znacznie obniżone przez rekombinowany ludzki TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)zabieg w chipie z hodowli 3D jako przeciwzapalne właściwości TGF-(Transformujący czynnik wzrostu-). Odkryliśmy, że ekspresja mRNA była podwyższona przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)inhibitor (SB431542). Ponadto, ekspresja IL-6, IL-8, w której pośredniczy inhibitor, i TNF- była specyficznie obniżona w porównaniu z nietraktowaną kontrolą (Figura 6A-D). Poziom mRNA VEGF, czynnika włóknistego, został znacznie zwiększony przez TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)leczenie. Poziom mRNA VEGF został obniżony przez inhibitor TGF- 1 (Figura 6E), podczas gdy ekspresja mRNA IL-10 o działaniu przeciwzwłóknieniowym była obniżona w stanach zwłóknienia wywołanych przez TGF- 1 . W przeciwieństwie do tego, ekspresja I-10mRNA została zwiększona przez traktowanie inhibitorem TGF- 1 (Figura 6F).
Rysunek 6. Real-time PCR pokazuje ogólną ekspresję mRNA na chipie 3D.Komórki wysiano z gęstością 5×10 stopni na chip 3D i stymulowano 5 ng/mL TGF- 1(Transformujący czynnik wzrostu-)lub 10 µm inhibitora (SB431542) przez 24h. Całkowity RNA wyekstrahowany z chipa hodowanego w 3D. Ekspresja mRNA (A)IL-1 ,(B)TNF-,(C)IL-6 i (D)IL-8 reprezentuje przeciwzapalne działanie TGF{ {10}}(Transformujący czynnik wzrostu-)leczenie. Ekspresja (E)VEGF jako czynnika angiogennego była zwiększona. Ekspresja (F)IL-10 jako czynnika przeciwwłóknieniowego została znacząco obniżona przez TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Transformujący czynnik wzrostu-).
