Obecny stan neuroprotekcji we wrodzonych chorobach serca Część 2

Obrazy mikroskopowe poddano następnie obliczeniom obrazu przy użyciu oprogramowania ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Sygnał Hsp60 pomnożono przez „x”.

Hsp60 to ważna cząsteczka białka, która odgrywa ważną rolę biologiczną w organizmie człowieka. Badania ostatnich lat wykazały, że obecność Hsp60 jest ściśle powiązana z ludzką pamięcią.

Hsp60 to molekularne białko opiekuńcze, które bierze udział głównie w fałdowaniu, rozwijaniu, stabilizacji i degradacji białek. Procesy te są bardzo ważne dla prawidłowego metabolizmu i funkcjonowania komórek organizmu człowieka. Jednocześnie Hsp60 ma również działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i immunomodulujące oraz odgrywa ogromną rolę w utrzymaniu zdrowia człowieka i równowadze układu odpornościowego.

Badania wykazały, że Hsp60 odgrywa kluczową rolę w tworzeniu i utrzymywaniu pamięci. Podczas procesu uczenia się i zapamiętywania komórki mózgowe wytwarzają dużą liczbę cząsteczek Hsp60. Cząsteczki te mogą chronić komórki przed zakłóceniami i uszkodzeniami ze środowiska zewnętrznego, aby zapewnić płynny postęp uczenia się i zapamiętywania. Ponadto Hsp60 może również wpływać na myślenie i zachowanie człowieka, zmieniając przekazywanie sygnału w komórkach mózgowych i rozwój neuronów, a także ma pozytywny wpływ na funkcje poznawcze i odporność na stres.

Chociaż rola Hsp60 wykazała pozytywny wpływ na organizm ludzki, ludzie muszą również zdać sobie sprawę, że zarówno nadmiar, jak i niedobór Hsp60 mogą mieć negatywny wpływ na zdrowie człowieka. Dlatego powinniśmy aktywnie eksplorować i badać mechanizm Hsp60 w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych organizmu ludzkiego, aby lepiej zrozumieć pozycję i rolę Hsp60 w zdrowiu człowieka. Widać, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche desericola może znacząco poprawić pamięć, ponieważ Cistanche desericola ma działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i przeciwstarzeniowe, co może pomóc zmniejszyć utlenianie i reakcje zapalne w mózgu, chroniąc w ten sposób zdrowie układu nerwowego. Ponadto Cistanche Deserticola może również promować wzrost i naprawę komórek nerwowych, poprawiając w ten sposób łączność i funkcjonowanie sieci neuronowych. Efekty te mogą pomóc poprawić pamięć, zdolność uczenia się i szybkość myślenia, a także mogą zapobiegać rozwojowi dysfunkcji poznawczych i chorób neurodegeneracyjnych.

Kliknij Wiedz, aby poprawić pamięć krótkotrwałą

Wartość „x” określono w następujący sposób: odjęcie złożonego „x” sygnału Hsp60 od sygnału mitochondrialnego DNA w grupie kontrolnej dało wartość mitochondrialnego DNA mniejszą lub równą zero. Sygnał histonu H2B pomnożono przez „y”.

Wartość „y” określono w następujący sposób: odjęcie złożonego „y” sygnału histonu-H2B od sygnału jądrowego DNA w grupie kontrolnej dało wartość jądrowego DNA mniejszą lub równą zeru. Jeśli w wyniku mnożenia sygnał tła stanie się wysoki, kontrast zwielokrotnionego obrazu można dostosować do tych samych warunków we wszystkich próbkach.

Do późniejszej analizy wykorzystano obraz barwienia dsDNA minus skorygowany obraz pomnożonego Hsp60 i histonu H2B. Przy użyciu funkcji „Adjust-Threshold” obrazy te poddano binaryzacji. Wybraliśmy dsDNA puncta o wielkości od 2 do 20 µm2 (kolistość 0,1–1,0) i zliczono je za pomocą funkcji „Analiza-Analiza cząstek”.

2.3. Mikroskopia elektronowa

Dzień przed transfekcją komórki HeLa wysiano na płytki z gęstością 600 komórek/µl. Ekspresję interesujących genów wyciszono w komórkach HeLa przy użyciu siRNA Stealth RNAi (Thermo Fisher Scientific) w odczynniku transfekcyjnym Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) zgodnie z instrukcją producenta (przy końcowym stężeniu RNA 10 nM).

Cztery dni po knockdown siRNA komórki poddano utrwalaniu. Próbki hodowli komórkowych utrwalono 2% PFA i 2% aldehydem glutarowym w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,4, w temperaturze 37°C, a następnie umieszczono w 4 ◦C do lodówki na 30 min. Próbki utrwalono w 2% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze fosforanowym przez noc w temperaturze 4°C. Próbki przemywano trzykrotnie 0,1 M buforem fosforanowym przez 30 minut i utrwalano 2% czterotlenkiem osmu w 0,1 M buforze fosforanowym w temperaturze 4°C przez 1 godzinę.

Próbki odwodniono roztworami etanolu, przeniesiono na żywicę (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokio, Japonia) i polimeryzowano w temperaturze 60°C przez 48 godzin. Spolimeryzowane żywice pocięto na ultracienkie skrawki 70-nm za pomocą diamentowego noża przy użyciu ultramikrotomu (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy), a następnie zamontowano na miedzianych siatkach.

Skrawki barwiono 2% octanem uranylu w temperaturze pokojowej przez 15 minut i przemywano wodą destylowaną, a następnie ponownie barwiono roztworem barwiącym ołowiem (Sigma-Aldrich, Tokio, Japonia) w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.

Siatki obserwowano pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokio, Japonia) przy napięciu przyspieszającym 80 kV (mózg danio pręgowanego) lub 100 kV (ogniwo), a obrazy rejestrowano przy użyciu kamery CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) .

2.4. Mikroskopia immunoelektronowa

Próbki na złotych krążkach zamrożono w ciekłym propanie w temperaturze -175°C. Po zamrożeniu próbki zamrożono 1% kwasem garbnikowym w etanolu i 2% wodą destylowaną w temperaturze -80°C przez 24 godziny.

Próbki następnie trzymano w temperaturze -20°C przez 4 godziny, a następnie inkubowano w temperaturze 4°C przez 1 godzinę. Następnie próbki odwadniano w bezwodnym etanolu 3 razy przez 30 min. za każdym razem, a następnie infiltracja mieszaniną 50:50 etanolu i żywicy (biały LR: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) w temperaturze 4°C przez 1 godzinę. Próbki przenoszono na świeżą 100% żywicę i inkubowano w temperaturze 4°C przez 30 minut, po czym proces ten powtarzano trzykrotnie.

Próbki przeniesiono na świeżą 100% żywicę i poddano polimeryzacji przy 50 ◦CO/N. Spolimeryzowane żywice pocięto na ultracienkie skrawki przy długości fali 90 nm za pomocą noża diamentowego przy użyciu ultramikrotomu (Ultracut UCT; Leica), a skrawki umieszczono na siatkach niklowych. Siatki inkubowano z przeciwciałem anty-dsDNA (35I9 DNA) (1/800, Abcam, nr kat. ab27156, RRID: AB_470907) w 1% BSA/PBS przy 4°CO/N, a następnie trzykrotnie przemywano 1% BSA/PBS przez 1 minutę każdy.

Następnie inkubowano je z przeciwciałem wtórnym skoniugowanym z cząsteczkami złota o długości {{0}} nm (poliklonalne przeciwciało koziej anty-mysiej IgG) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu PBS siatki umieszczono w 2% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze kakodylanowym.

Następnie siatki wysuszono, a następnie barwiono 2% octanem uranylu przez 15 minut i roztworem barwnika ołowiowego (Sigma-Aldrich) w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Siatki obserwowano pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (JEM-1400 plus; JEOLLtd.) przy napięciu przyspieszającym 100 kV. Obrazy cyfrowe uzyskano kamerą CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Wyniki

3.1. Zmniejszony TFAM lub GBA powoduje wzrost ektopowego mitochondrialnego DNA

Najpierw pokazaliśmy przykład detekcji cytoplazmatycznego DNA pochodzącego z mitochondriów w komórkach HeLa, w których białko TFAM zostało zniszczone przez siRNA (ryc. 1A). TFAM jest kluczowym mitochondrialnym czynnikiem transkrypcyjnym, który pełni także funkcję w replikacji i naprawie mitochondrialnego DNA [20] .

Donoszono, że polimorfizm sekwencji w tym genie jest powiązany z chorobą Parkinsona [21,22]. Po 3 dniach eliminacji białka TFAM w cytoplazmie komórek HeLa wykryto wiele kropek dwuniciowego DNA.

Histony są dodatnimi markerami DNA pochodzenia jądrowego w cytoplazmie oraz negatywnymi markerami DNA mitochondrialnego i DNA pochodzenia mitochondrialnego w cytoplazmie [23]. Kropki te nie kolokalizują się z histonami, co sugeruje, że nie pochodzą one z DNA jądrowego. Co więcej, niektóre z tych cytoplazmatycznych, ektopowych kropek DNA nie kolokalizowały się z Hsp60, markerem macierzy mitochondrialnej, co wskazuje, że znajdowały się one poza mitochondriami (Rysunek 1B, C).

Mikroskopia elektronowa wykazała również, że ektopowy DNA wyciekł z mitochondriów (ryc. 2A, B). Podsumowując, wzrost ektopowego DNAdots w cytoplazmie w wyniku knockdown TFAM był spowodowany wyciekiem mitochondrialnego DNA z mitochondriów. Po drugie, pokazaliśmy kolejny przykład wykrywania cytoplazmatycznego DNA pochodzącego z mitochondriów w komórkach HeLa, w których białko GBA zostało zniszczone przez siRNA (Rysunek 1A).

GBA jest genem powodującym chorobę Gauchera, ale heterozygotyczna mutacja GBA jest również czynnikiem ryzyka choroby Parkinsona [24]. Po 3 dniach eliminacji białka GBA w cytoplazmie komórek HeLa wykryto wiele kropek dwuniciowego DNA. Niektóre kropki DNA znajdowały się w pobliżu histonów, co sugeruje, że pochodzą one z DNA jądrowego.

Inne kropki DNA nie były zlokalizowane razem z histonami, co sugeruje, że nie był to DNA pochodzenia jądrowego, ale DNA pochodzący z mitochondriów (Rysunek 1D). Podsumowując, wzrost ektopowej liczby kropek DNA w cytoplazmie w wyniku knockdown GBA był przynajmniej częściowo spowodowany wyciekiem mitochondrialnego DNA z mitochondriów.

For more information:1950477648nn@gmail.com