Wpływ naringeniny na profile miRNA-mRNA w komórkach HepaRG

Aby uzyskać więcej informacji, skontaktuj się z:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakcyjny: naringenina, naturalnaflawonoidpowszechnie występujący w owocach cytrusowych, posiada właściwości przeciwutleniające, przeciwzapalne i chroniące wątrobę jako naturalny suplement diety. Jednak mechanizm regulacyjny naringeniny w ludzkiej wątrobie pozostaje niejasny. W niniejszym badaniu sekwencjonowanie informacyjnego RNA (mRNA-seq), sekwencjonowanie mikroRNA (miRNA-seq) i qPCR w czasie rzeczywistym zastosowano w celu odróżnienia różnic w ekspresji między komórkami HepaRG kontrolnymi i traktowanymi naringeniną. Otrzymaliśmy 1037 mRNA o zróżnicowanej ekspresji i 234 miRNA. Zgodnie z przewidywaniem celu i analizą integracji in silico, znaleźliśmy 20 potencjalnych par miRNA-mRNA zaangażowanych wwątrobametabolizm. Niniejsze badanie jest pierwszym, które zapewnia perspektywę interakcji miRNA-mRNA w regulacji naringeniny poprzez zintegrowaną analizę mRNA-seq i miRNA-seq w komórkach HepaRG, co dodatkowo charakteryzuje wartość nutraceutyczną naringeniny jako dodatku do żywności.

Słowa kluczowe: naringenina; sekwencja mRNA; sekwencja miRNA; komórki HepaRG

kliknij, aby uzyskać więcej informacji o produkcie

1. Wstęp

Naringenin, naturalny flawonoid, występuje obficie w owocach cytrusowych i innych jadalnych owocach, takich jak grejpfruty, pomarańcze, bergamotka, pomidory i figi [1]. Po podaniu doustnym naringenina jest szeroko rozpowszechniona w przewodzie pokarmowym i wątrobie [2,3] i ze względu na swoją strukturę molekularną wykazuje bezpośrednie właściwości antyoksydacyjne poprzez działanie wymiatające wolne rodniki oraz indukuje endogenny układ antyoksydacyjny w wątrobie [4]. Coraz więcej dowodów z badań in vitro i in vivo wskazuje na różne właściwości ochronne naringeniny, takie jak:przeciwzapalny[5], przeciwutleniacz [6], przeciwwłóknieniowy [Z] i hepatoprotekcyjny 4,8| zajęcia. Zdolności te sugerują, że dietetyczna naringenina może być stosowana w zapobieganiu zespołowi metabolicznemu i chorobom nowotworowym, w tym piorunującemu zapaleniu wątroby,choroba wątroby, zwłóknienie itp. 19,10]. Istnieje jednak niewiele szczegółowych badań dotyczących regulacyjnego wpływu naringeniny na ogólne geny wątroby [4].

MikroRNA (miRNA) to klasa niekodujących jednoniciowych cząsteczek RNA o długości 18-26 nukleotydów kodowanych przez geny endogenne, które wykazują szeroki zakres biologicznych funkcji regulacyjnych w filogenezie, różnicowaniu, proliferacji i apoptozie [11]. miRNA, wiążąc informacyjne RNA (mRNA) poprzez rozpoznanie specyficzne dla sekwencji, ujemnie reguluje ekspresję genów na poziomie potranskrypcyjnym poprzez degradację docelowych mRNA [12]. Pod wpływem stymulacji egzogennej zmienia się ekspresja miRNA, a następnie reguluje się ekspresję docelowego mRNA. Ostatecznie rozległe funkcje fizjologiczne ulegają zmianie, aby sprostać wyzwaniom powodowanym przez stymulację egzogenną [13]. Bardziej wiarygodną metodą przewidywania relacji docelowych miRNA-mRNA jest równoczesna integracja analizy mRNA-seq z analizą miRNA-seq przy użyciu konkretnego kontekstu przetwarzania in silico [14].

Dlatego naszym celem było zbadanie wpływu naringeniny na globalne geny i podkreślenie możliwego mechanizmu regulacyjnego par miRNA-mRNA w wątrobie. W niniejszym badaniu zmiany ekspresji mRNA i profile ekspresji miRNA zostały zbadane w komórkach HepaRG poprzez wykonanie mRNA-seq, miRNA-seq, analiz bioinformatycznych i qPCR w czasie rzeczywistym, aby dostarczyć dowodów na potencjał naringeniny jako naturalnego suplementu diety.

2. Wyniki

2.1.Analiza sekwencjonowania transkryptomu w odpowiedzi na naringeninę

Aby zidentyfikować zmiany ekspresji mRNAkomórki HepaRGw odpowiedzi na naringeninę, osiem komplementarnych bibliotek DNA(cDNA) w grupie kontrolnej (CK-1, CK-2, CK-3 i CK-4) oraz grupie eksperymentalnej (T-1, T-2, T-3 i T-4) skonstruowano z całkowitego RNA i poddano sekwencjonowaniu Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou , Chiny). Przegląd wyników sekwencjonowania i składania dla grupy kontrolnej i grupy doświadczalnej przedstawiono w Tabeli 1. Zmiany ekspresji genów analizowano porównując grupy leczone i kontrolne. Jak pokazano na Figurze la, grupa eksponowana na naringeninę eksprymowała 1037 genów (DEG) o zróżnicowanej ekspresji w porównaniu z grupą kontrolną. Mapa cieplna 1037 DEG pokazała analizę skupień grupy kontrolnej i grupy z naringeniną (Rysunek 1b; 381 genów regulowanych w górę i 656 w dół; Tabela S1, Materiały uzupełniające).

Zgodnie z systemem klasyfikacji Gene Ontology (GO), 1037 DEG podzielono na trzy główne kategorie funkcjonalne (proces biologiczny, komponent komórkowy i funkcja molekularna) i 61 podkategorii (Rysunek 2). Wśród procesów biologicznych najczęściej reprezentowany był proces komórkowy (731), a następnie proces w jednym organizmie (672) i regulacja biologiczna (595). W kategorii komponentu komórkowego znaczna część skupisk została przypisana do komórki (727), części komórki (721) i organelli (580). Geny zaangażowane w grupy wiążące (666) i katalityczne (238) były w szczególności reprezentowane w kategorii funkcji molekularnej.

Klasyfikacja Kioto Encyclopedia of Gens and Genomes (KEGG) została znaleziona dla 1037 DEG, które zostały następnie sklasyfikowane w pierwszej dwudziestce szlaków biochemicznych zgodnie z najmniejszą wartością q i największą liczbą Genów w adnotacji szlaku (ryc. 3). Liczba genów i stosunek genów z adnotacjami w pięciu głównych szlakach to toczeń rumieniowaty układowy (33,8,4%), alkoholizm (38,9,67%), nieprawidłowa regulacja transkrypcji w nowotworach (22,5,6%), szlak sygnałowy PI3K-Akt (34, 8,65 proc.) oraz kaskady dopełniacza i krzepnięcia (12, 3,05 proc.). Wśród pięciu ścieżek było ponad 10 wzbogaconych genów. Ogólnie rzecz biorąc, leczenie naringeniną miało znaczący wpływ na globalny profil ekspresji genów komórek HepaRG. Wyniki te sugerowały, że geny zaangażowane w te szlaki mogą odgrywać kluczową rolę w regulacji naringeniny.

2.2. Analiza poziomów transkrypcji miRNA w odpowiedzi na naringeninę

W tym badaniu staraliśmy się ustalić, czynaringeninaekspozycja zmienia poziomy ekspresji miRNA w komórkach HepaRG. Po ekspozycji zebraliśmy małe RNA i zmierzyliśmy ich względną obfitość przy użyciu Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou, Chiny). Jak pokazano w Tabeli 2, po usunięciu odczytów zanieczyszczeń wygenerowano odpowiednio czyste odczyty ośmiu próbek. Przegląd odczytów sekwencjonowania małych RNA od surowych danych do wysokiej jakości i z filtrowaniem wysokiej jakości przedstawiono w Tabeli 2. Rozkłady długości małych RNA były podobne wśród bibliotek, ponieważ 21-23 nt RNA były najliczniejsze (Rysunek 4 ).

Wszystkie małe RNA zostały dopasowane w bazie danych GeneBank (wydanie 209.0) i bazie danych Rfam (11.0) w celu identyfikacji i usunięcia rybosomalnego RNA (rRNA), małego warunkowego RNA (scRNA), mały jąderkowy (snoRNA), mały jądrowy (snRNA) i transferowy RNA (tRNA). Zgodnie z genomem referencyjnym, te małe RNA zmapowane na eksony, introny i sekwencje powtórzeń również zostały usunięte. Filtrujące małe RNA przeszukano w bazie danych miRBase (wydanie 21), aby zidentyfikować miRNA. Mapa cieplna 3373 miRNA pokazuje analizę skupień grupy kontrolnej i grupy naringeniny na Ryc. 5a. Profilowanie Illumina HiSeq2500 3373 miRNA analizowanych w ekspozycji na naringeninę w porównaniu z próbkami kontrolnymi wykazało, że łącznie 234 miRNA o zróżnicowanej ekspresji (DEM, 174 w górę i 60 w dół regulowane; Tabela S2, Materiały uzupełniające) były wykrywalne w komórkach HepaRG (Rysunek 5b) .

2.3.Przewidywanie celów i analiza integracji profili ekspresji mRNA i miRNA w odpowiedzi na naringeninę

Działając na poziomie posttranskrypcyjnym, miRNA wyciszają i/lub zmniejszają ekspresję genów komórkowego mRNA poprzez rozszczepienie docelowego RNA. Aby przewidzieć docelowe geny 234 DEM, przeprowadziliśmy analizy obliczeniowe przy użyciu RNAhybrid (v2.1.2) plus świetlik (v6 .01), Miranda (v3.3a) i TargetScan (wersja:7.0). Jednoczesne profilowanie 234 DEM i 1037 stopni poziomów in silico może zidentyfikować przypuszczalne docelowe mRNA miRNA. Wybraliśmy przecięcie DEG i genów docelowych DEM, a następnie przeprowadziliśmy analizę bioinformatyczną tych genów przecięcia. W sumie uzyskano 5607 ujemnych par miRNA-mRNA do leczenia naringeniną, z udziałem 216 DEM i 681 DEG (Tabela S3, Materiały uzupełniające). Zgodnie z systemem klasyfikacji GO, 681 DEG zostało zaklasyfikowanych do 58 podkategorii (Rysunek 6). Pierwsze trzy podkategorie nie zmieniły się w trzech głównych kategoriach funkcjonalnych w porównaniu z analizą sekwencjonowania transkryptomu (ryc. 2 i 6).

Analiza wzbogacenia szlaku dla 681 stopni z 5607 ujemnych par miRNA-mRNA zidentyfikowała dwadzieścia najlepszych szlaków zgodnie z najmniejszą wartością q i największą liczbą genów w adnotacji szlaku po ekspozycji na naringeninę (ryc. 7): ze ścieżką sygnalizacyjną PI3K-Akt (25 8,96 procent )jest ósmą ścieżką i drugą pod względem obfitości.

2.4. Walidacja qPCR w czasie rzeczywistym regulacji naringeniny w metabolizmie wątroby i potencjalnych parach miRNA-mRNA regulatorowych

Zgodnie z komentarzami globalnej funkcji genów, przeglądem literatury i ich potencjalnym związkiem z miRNA reagującymi na naringeninę, 19 DEG (ALOX15, CA9, TH, HKDC1, NDUFA4L2, RRM2, ACSL5, PLA2G4C, LIPT2, UGDH, FTCD, ABAT, AZIN2, HS6ST3 , B4GALT6, GUSB, DCT, ALAS2 i MAT1A) zostały ręcznie wybrane jako reprezentanci ze względu na ich potencjalną rolę w metabolizmie wątroby. Ponadto, szlak sygnałowy PI3K-Akt został znacząco wzbogacony (czwarty w analizie KEGG sekwencji RNA, Figura 3; ósmy w analizie KEGG sekwencji miRNA-RNA, Figura 7); w związku z tym zbadano 11 DEG (PDGFRB. CSF1R. FGFR2, IL2RG, IL7R, ITGB4, GNG4, PCK1, CREB3L3, CREB3L1 i NFkB1) wśród szlaków sygnałowych PI3K-Akt.

Opisaliśmy tutaj interakcję między 30 DEG i 11 ludzkimi miRNA (hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR{{9 }}p, hsa-miR-6837-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR{{19} }a-3p, hsa-miR-7-5p i hsa-miR-200a-5p), w tym 20 negatywnych interakcji miRNA-mRNA (Rysunek 9). Jak pokazano na Figurze 9, pojedyncze miRNA może regulować wiele docelowych mRNA i odwrotnie (np. ABAT HS6ST3, B4GALT6 i DCT mogą być jednocześnie regulowane przez hsa-miR-429; HS6ST3 może być jednocześnie regulowane przez hsa-miR -429, hsa-miR-100-3p,hsa-miR-519a-3p, hsa-miR-676-3p, hsa-miR-7-5 p i hsa-miR-194-5p; niektóre DEG nie miały sparowanych DEM-ów). Profile ekspresji 19 DEG związanych z metabolizmem wątrobowym i 11 DEG wśród szlaku sygnałowego PI3K-Akt zostały dodatkowo zweryfikowane przy użyciu qPCR w czasie rzeczywistym (Figura 9a, b). Poziom ekspresji 11 ludzkich miRNA (dwa regulowane w górę i dziewięć w dół) oceniano dalej pod kątem zmian indukowanych przez naringeninę za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym zgodnie z wynikami sekwencjonowania (Figura 9c). Chociaż istniały pewne ilościowe różnice między dwiema platformami analitycznymi, podobieństwa między danymi sekwencji RNA i PCR w czasie rzeczywistym sugerowały, że dane sekwencji RNA były powtarzalne i wiarygodne.

3. Dyskusja i wnioski

Omówione tu odkrycia ujawniają pierwsze szczegółowe informacje dotyczące równoległych zmian ekspresji mRNA i miRNA w komórkach HepaRG w odpowiedzi nanaringenina. Przeprowadziliśmy analizę integracyjną tych danych, w tym 234 DEM i 1037 DEG indukowanych przez naringeninę, które zapewniają globalny wgląd w interakcje miRNA-mRNA naringeniny w mechanizmie regulacyjnym. Zgodnie z adnotacjami dotyczącymi funkcji genów i przeglądem literatury, przebadano 19 DEG związanych z metabolizmem. W szczególności, szlak sygnałowy PI3K-Akt został znacząco wzbogacony zarówno w analizie sekwencjonowania transkryptomu (trzeci pod względem ilości i na czwartej pozycji), jak i w analizie integracji profili ekspresji miRNA-mRNA (drugi pod względem występowania i ósmy). w odpowiedziach na naringeninę. Ponadto 11 DEG w ścieżce sygnałowej PI3K-Akt poddano dalszej walidacji za pomocą analizy qPCR w czasie rzeczywistym. W ramach tej pracy zbudowaliśmy sieć regulacyjną miRNA-mRNA zgodnie z zestawami danych DEM i DEG oraz informacjami o ukierunkowaniu na miRNA. Niektóre badania wykazały, że sieć regulacyjna miRNA-mRNA reaguje na:uszkodzenie wątroby, w tym raka wątrobowokomórkowego i stresu oksydacyjnego [15]. Chociaż zidentyfikowano kilka zjawisk aktywacji RNA indukowanych przez miRNA [16], w większości przypadków ujemna korelacja między miRNA a ich docelowymi mRNA jest często uważana za wsparcie celowania w miRNA [17]. Ostatecznie zidentyfikowano 20 par ujemnych korelacji miRNA-mRNA z udziałem metabolizmu wątrobowego i szlaku sygnałowego PI3K-Akt.

W odniesieniu do genów globalnych odpowiedzieliśmy na nasze konkretne pytanie badawcze, wykorzystując analizę ścieżki, aby wyróżnić 19 DEG związanych z klastrami funkcjonalnymi: metabolizm, w tym metabolizm lipidów (ALOX15, ACSL5, PLA2G4C i B4GALT6), metabolizm energetyczny (CA9 i NDUFA4L2) , Metabolizm kofaktorów i witamin (TH, LIPT2 i FTCD), Metabolizm aminokwasów (RRM2, AZIN2, DCT, ALAS2 i MAT1A), Biosynteza i metabolizm glikanów (HS6ST3 i GUSB) oraz Metabolizm węglowodanów”(HKDC1, PCK1, UGDH i ABAT). Te 19 DEG wzbogacone w metabolizm są głównie zaangażowane we wrażliwość na insulinę, akumulację lipidów, magazynowanie glikogenu i wydatkowanie energii. Wcześniejsze badania wykazały, że obniżenie poziomu ALOX15 w uszkodzeniu wątroby myszy wywołanym alkoholem [18], CA9 u myszy BALB/C [19], THin niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) [20], HKDC1 [21] oraz regulacja w górę UGDH [22] mogą znacząco złagodzić stres oksydacyjny, akumulację lipidów i uszkodzenie wątroby. Powalenie akumulowanego ROS tłumionego przez NDUFA4L2 apoptozy w komórkach raka wątrobowokomórkowego (HCC) [23]. Wyciszanie RRM2 hamowało proliferację komórek NCI-H929 [24], a nadekspresja FTCD hamowała proliferację komórek poprzez promowanie uszkodzenia DNA i indukowanie apoptozy komórek w komórkach HCC [25]. Ablacja ACSL5 poprawiła wrażliwość na insulinę, zwiększyła wydatek energii i opóźniła wchłanianie triglicerydów u myszy [26]. Suplementacja DCT poprawiła związane z wiekiem stłuszczenie wątroby i stany zapalne [27]. Tworzenie kropelek lipidów po stymulacji kwasami tłuszczowymi i wirusem zapalenia wątroby typu C w komórkach z knockdown PLA2G4C było upośledzone [28]. Regulacja w dół LIPT2 hamowała syntezę kwasów tłuszczowych [29]. Zwiększenie aktywności ABAT [30], AZIN2 [31], B4GALT6 [32], HS6ST3 [33] i GUSB [34] może sprzyjać rozkładowi kwasów tłuszczowych i glikogenu. Nadekspresja ALAS2 mogła poprawić wydolność hematopoetyczną wątroby [35l, a ekspresja MAT1A w hepatocytach utrzymywała zróżnicowany stan tych komórek [36]. Zgodnie z odkryciami opisanymi powyżej, regulacja tych genów metabolicznych w naszych wynikach może być korzystna dla poprawy metabolizmu w odpowiedzi na naringeninę.

Szlak sygnałowy PI3K-Akt może dostarczyć wskazówek dotyczących mechanizmu molekularnego zaangażowanego w metabolizm, stan zapalny i stres oksydacyjny [37], który odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi na naringeninę. Szlak sygnałowy PI3K-Akt ma różnorodny wpływ na metabolizm komórkowy poprzez bezpośrednią regulację transporterów składników odżywczych i enzymów metabolicznych lub kontrolę czynników transkrypcyjnych regulujących ekspresję kluczowych elementów szlaków metabolicznych [38, 39], w tym metabolizm glukozy, biosynteza makrocząsteczek i utrzymanie równowagi redoks. Doniesiono, że wyciszanie PDGFRB hamowało aktywację i proliferację komórek gwiaździstych wątroby oraz łagodziło zwłóknienie wątroby [40]. Oczekuje się, że wspólne hamowanie CSF1R i FGFR2 wzmocni działanie przeciwnowotworowe poprzez ukierunkowanie na unikanie odporności i angiogenezę w mikrośrodowisku guza [41]. Uśpienie ITGB4 zahamowało glikolizę w fibroblastach związanych z rakiem [42]. Genetyczne knockdown PCK1 zapobiegało indukowanemu kwasami tłuszczowymi wzrostowi strumienia oksydacyjnego, stresu oksydacyjnego i stanu zapalnego [43], co było również skorelowane ze szlakami sygnałowymi zarządzanymi przez insulinę [44]. Wykazano, że nadekspresja jądrowego CREB3L3 indukowała lipolizę układową, ketogenezę wątrobową oraz wrażliwość na insulinę ze zwiększonym wydatkowaniem energii [45]. Inhibicja CREB3L1 podobno blokowała inwazję raka i przerzuty [46]. NFkB jest kluczowym regulatorem rozwoju odporności, odpowiedzi immunologicznych, stanu zapalnego i raka [47]. Udowodniono, że tłumienie NFkB przekazuje sygnały przeciwzapalne i zmniejsza stan zapalny [48]. W ścieżce sygnałowej PI3K-Akt nasze wyniki wykazały, że naringenina znacząco obniżyła ekspresję mRNA PDGFRB, PCK1, CREB3L1 i NFkB1 z powiązanymi miRNA (has-miR-1306-5p i hsa-miR{{40} }p) są znacznie ograniczone. Dlatego nasze dane sugerują, że naringenina może odgrywać zbawienną rolę w działaniu przeciwzapalnym, stresie antyoksydacyjnym i łagodzącym metabolizm poprzez hamowanie szlaku sygnałowego PI3K-Akt.

To badanie było pierwszym, które zintegrowało analizę mRNA-seq i miRNA-seq w wątrobie w odpowiedzi na naringeninę i zapewniło perspektywę metabolizmu w regulacji naringeniny. Jeśli chodzi o metabolizm i szlak sygnałowy PI3K-Akt, 11 par DEM, 30 DEG i 20 par miRNA-mRNA wymaga dalszych badań nad aktywnością naringeniny. Istnieją pewne ograniczenia tych badań; na przykład zależny od dawki i zależny od czasu wpływ naringeniny na interakcje miRNA-mRNA był nadal niejasny. Chociaż dane miRNA analizowane in silico sugerowały zdolności regulacyjne, ich funkcje muszą być dalej certyfikowane w określonym kontekście w żywym systemie. Podsumowując, przedstawiliśmy wstępne badania analizujące ekspresję mRNA i miRNA oraz profilowanie metabolizmu. Mechanizm regulacyjny par miRNA-mRNA może być dodatkowym możliwym dowodem na adnotację wartości nutraceutycznej naringeniny.

4. Materiały i metody

4.1. Chemikalia i odczynniki

Linię komórkową HepaRG pierwotnie zakupiono od Biopredic International (Rennes, Francja). Pożywkę RPMI-1640 i roztwór penicylina-streptomycyna-glutamina otrzymano od Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Surowicę płodową bydlęcą (FBS) zakupiono z Corning (Auckland, Nowa Zelandia). Naringenina i dimetylosulfotlenek (DMSO) pochodziły z Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA). Odczynnik TRIzolTM został dostarczony przez Thermo Fisher (Carlsbad, CA, USA). Ultraczystą wodę oczyszczono za pomocą akademickiego systemu oczyszczania wody Milli-O (Millipore, Bedford, MA, USA). Wszystkie inne odczynniki były produktami komercyjnymi o najwyższej dostępnej klasie analitycznej.

4.2. Hodowla komórek HepaRG

Komórki HepaRG wysiano przy 5 x 10*komórek/cm- na płytkach sześciostudzienkowych i hodowano w pożywce RPMI-1640, hodowano z lub bez 100 μM naringeniny przez 48 godzin i uzupełniono 10% FBS i 1% antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 ug/ml streptomycyny) w temperaturze 37°C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO. CK-1, CK-2, CK-3 i CK-4 odnoszą się do kontrolnej grupy kontrolnej; T-1, T-2, T-3 i T-4 odnoszą się do grupy leczonej 100 μM naringeniną. Liczby 1, 2, 3 i 4 reprezentują próbki z czterech niezależnych powtórzonych eksperymentów.

4.3. Całkowita ekstrakcja RNA

Komórki HepaRG przemyto dwukrotnie lodowatą solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) i zebrano odczynnikiem TRIzol™ zgodnie z zaleceniami producenta. Spektrofotometry Thermo Scientific NanoDropTM2000 c (Wilmington, DE, USA) były używane do pomiaru jakości i ilości RNA każdej próbki zgodnie z protokołem producenta.

4.4.Sekwencjonowanie RNA

mRNA wzbogacono kulkami Oligo(dT), następnie wzbogacono mRNA pofragmentowano i poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA z losowymi starterami za pomocą zestawu do ekstrakcji OiaOuick PCR (Qiagen, Venlo, Holandia). Cząsteczki RNA w zakresie wielkości 18-30 nt wzbogacono metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Dodano adaptery 3' i 5', a następnie wzbogacone RNA poddano odwrotnej transkrypcji za pomocą zestawu do ekstrakcji QiaQuick PCR, zgodnie z instrukcjami producenta (Qiagen, Venlo, Holandia). Produkty ligacji selekcjonowano pod względem wielkości za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. W grupie naringeniny były cztery próbki, aw grupie kontrolnej cztery. Każda próbka wygenerowała dwie biblioteki cDNA: jedną dla mRNA-seq, a drugą dla miRNA-seg. Produkty zamplifikowane metodą PCR wzbogacono, aby odpowiednio wygenerować 16 bibliotek cDNA i zsekwencjonowano przy użyciu Ⅲlumina HiSeq2500 firmy Genedenovo Biotechnology Co. (Guangzhou, Chiny). Dane dotyczące sekwencjonowania RNA i małych RNA zostały zdeponowane w archiwum odczytów sekwencji NCBI (numery dostępu od SRR13675952 do SRR13675963).

4.5. qPCR w czasie rzeczywistym

Transkrypcję mRNA do cDNA przeprowadzono za pomocą systemu odwróconej transkrypcji GoScript™ (Promega, Madison, WI, USA) z 3 μg całkowitego RNA, zgodnie z instrukcjami producenta. Do analizy miRNA, syntezę cDNA przeprowadzono z użyciem miRNA First Strand cDNA Synthesis (Tailing Reaction, Sangon Biotech, Szanghaj, Chiny) z 2 ug całkowitego RNA.

z GoTaq® qPCR Master Mix（Promega, Madison, WI, USA) na LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Niemcy), zgodnie z zaleceniami producenta. Procedurę cykli termicznych rozpoczęto od początkowej denaturacji w 95°C przez 10 min. Następnie nastąpiło 45 cykli denaturacji przez 10 s w 95 stopniach , wiązanie startera przez 20 s w 60 stopniach i elongacja przez 20 s 72 stopnie . Procedura zakończyła się końcową amplifikacją w 95 stopni przez 5s, 65 stopni C przez 1 min, dodaniem etapu krzywej dysocjacji i etapem chłodzenia. Startery zakupiono w firmie Sangon Biotech (Szanghaj, Chiny). Sekwencje par starterów stosowane do walidacji sygnatury opisano w Tabelach 3 i 4. Wartości Ct obliczono w odniesieniu do -aktyny lub U6.

4.6.Analiza bioinformatyczna i statystyka

DEG i DEM zostały zidentyfikowane przy użyciu pakietu oprogramowania opartego na R. Wartością progową dla wyboru DEG i DEM była wartość q (skorygowana wartość p) mniejsza lub równa 0.05 i krotna zmiana (FC) większa lub równa 2 lub mniej niż lub równy 0,5. Do analizy DEG i DEM wykorzystano klasyfikację KEGG i GO obejmującą funkcje molekularne, procesy biologiczne i komponenty komórkowe.

Wyniki testu biologicznego przedstawiono w postaci średniej ± SD na podstawie czterech niezależnych eksperymentów w GraphPad Prism 8.

Materiały uzupełniające: Poniższe informacje są dostępne online pod adresem https://www.mdpi.com/1422-0 067/22/5/2292/s1: Tabela S1, Identyfikacja 1037 mRNA o zróżnicowanej ekspresji w odpowiedzi na naringeninę; Tabela S2, Identyfikacja 234 miRNA o zróżnicowanej ekspresji w odpowiedzi na naringeninę; Tabela S3, Identyfikacja 5607 negatywnych par miRNA-mRNA w odpowiedzi na naringeninę, z udziałem łącznie 216 DEM i 681 DEG

Bibliografia

1. Salehi, B.; Fokou, PVT Potencjał terapeutyczny naringeniny: przegląd badań klinicznych. Farmaceutyki 2019, 12, 11. [CrossRef] [PubMed]

2. Bai, Y.; Peng, W.; Yang, C.; Zou, W.; Liu, M.; Wu, H.; Wentylator, L.; Li, P.; Zeng, X.; Su, W. Farmakokinetyka i metabolizm naringiny i aktywnego metabolizmu naringeniny u szczurów, psów, ludzi oraz różnice między gatunkami. Przód. Pharmacol. 2020, 11, 364. [Odsyłacz]

3. Joshi, R.; Kulkarni, YA; Wairkar, S. Aspekty farmakokinetyczne, farmakodynamiczne i formulacyjne naringeniny: aktualizacja. Życie Sci. 2018, 215, 43–56. [Odn.]

4. Hernández-Aquino, E.; Muriel, P. Korzystne działanie naringeniny w chorobach wątroby: Mechanizmy molekularne. Świat J. Gastroenterol. 2018, 24, 1679-1707. [Odn.]

5. Wang, Q.; Ou, Y.; Uścisk.; Wen, C.; Yue, S.; Chen, C.; Xu, L.; Xie, J.; Dai, H.; Xiao, H.; i in. Naringenina łagodzi niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby poprzez regulację w dół szlaku NLRP3/NF-κB u myszy. Fr. J. Pharmacol. 2020, 177, 1806-1821. [Odn.]

6. Khan, TH; Ganaie, MA Naringenin zapobiega toksyczności wywołanej przez doksorubicynę w tkankach nerek poprzez regulację zniewagi oksydacyjnej i zapalnej u szczurów Wistar. Łuk. Fizjol. Biochem. 2020, 126, 300-307. [Odn.]

7. Wang, J.; Ding, Y.; Zhou, W. Albumin samomodyfikowane liposomy do terapii zwłóknienia wątroby poprzez szlaki zależne od SPARC. wewn. J. Pharm. 2020, 574, 118940. [Odn.]

8. Kometsi, L.; gubernator K.; Mofo Mato, PE; Hurchund, R.; Owira, PMO Zmniejszając stres oksydacyjny, naringenina łagodzi wywołaną hiperglikemią regulację w górę białka czynnika 2 związanego z wątrobowym czynnikiem jądrowym erytroid 2-. J. Pharm. Pharmacol. 2020, 72, 1394-1404. [Odsyłacz] [PubMed]

9. Rossino, MG; Casini, G. Nutraceuticals do leczenia retinopatii cukrzycowej. Odżywki 2019, 11, 771. [CrossRef] [PubMed]

10. Hernández-Aquino, E.; Quezada-Ramírez, MA; Silva-Olivares, A.; Casas-Grajales, S.; Ramos-Tovar, E.; Flores-Beltran, RE; Segowia, J.; Shibayama, M.; Muriel, P. Naringenin osłabia progresję zwłóknienia wątroby poprzez inaktywację komórek gwiaździstych wątroby i szlaków profifibrogennych. Eur. J. Pharmacol. 2019, 865, 172730. [CrossRef] [PubMed]