Regulator epigenetyczny BRD4 bierze udział w wyzwalanej kadmem odpowiedzi zapalnej w nerce szczura

więcej informacji:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong i inni

Cistanche tubulosa zapobiega chorobom nerek, kliknij tutaj, aby uzyskać informacjeprodukty i Cistanche DHT

ABSTRAKCYJNY

Kadm (Cd) został opisany jako potencjalny induktor stanu zapalnego, podczas gdy coraz więcej dowodów wskazuje, że niewłaściwe zapalenie jest czynnikiem przyczyniającym się douszkodzenie nerek. Dlatego też badania nad odpowiedzią zapalną wywołaną przez Cd mają duże znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmu nefrotoksyczności indukowanej przez Cd. Zawierający bromodomenę 4(BRD4) jest ważnym regulatorem epigenetycznym zaangażowanym w rozwój wielu chorób zapalnych, ale pełni rolę regulatorową wzapalnyodpowiedź pozostaje do wyjaśnienia. Tutaj stwierdziliśmy, że leczenie Cd u szczurów Sprague-Dawley (2 mg/kg masy ciała, ip, 5 kolejnych dni) i u szczurówkomórka nerkowalinia (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) indukowała transkrypcję cytokin zapalnych, która mogła być redukowana przez JQ1 (inhibitor BRD4, 25 mg/kg mc, ip , 3 kolejne dni in vivo; 0,5 µM, 12 godz. in vitro) lub mały interferujący RNA BRD4 (siRNA, in vitro), co sugeruje, że BRD4 uczestniczy w wywołanej przez Cd odpowiedzi zapalnej. Następnie nasze badanie wyjaśniło rolę BRD4 w odpowiedzi zapalnej wywołanej przez Cd. Hamowanie BRD4 zmniejszało translokację jądrową NF-κB promowaną przez Cd i aktywację in vivo i in vitro. Cd zwiększał poziom acetylacji RelA K310 i wzmacniał wiązanie BRD4 z acetylowanym NF-κB RelA in vivo i in vitro, co zostało zniesione przez hamowanie BRD4. Podsumowując, nasze badanie sugeruje, że BRD4 bierze udział w wyzwalanej przez Cd transkrypcji cytokin zapalnych poprzez pośredniczenie w aktywacji szlaku sygnałowego NF-κB i zwiększenie wiązania się z acetylowanym NF-κB RelA u szczuranerka,dlatego BRD4 może być potencjalnym celem terapeutycznym dla chorób nerek wywołanych przez Cd.

Słowa kluczowe: BRD4KadmZapalenie nerekcytokiny NF-κB JQ1

1. Wstęp

Kadm (Cd) jest zanieczyszczeniem metalami ciężkimi o wysokiej toksyczności i długim okresie półtrwania. Wraz z rozwojem produkcji przemysłowej, rosnące zagrożenie zanieczyszczeniami kadmowymi dla bezpieczeństwa środowiska i zdrowia ludzi budzi niepokój (Wang i in., 2020; Horiguchi i Oguma, 2016). Cd po wchłonięciu przez organizm powoduje uszkodzenia wielonarządowe inerkajest głównym narządem docelowym (Fernando i in., 2020; Zhao i in., 2021). Wcześniej systematycznie weryfikowaliśmy, że hamowanie autofagii, stres oksydacyjny i apoptoza synergicznie przyczyniają się do nefrotoksyczności wywołanej przez Cd u szczurów (Liu i wsp., 2017; Wang i wsp., 2017). Zapalenie jest odpowiedzią fizjologiczną, która działa jako reakcja obronna przeciwko infekcji lub urazowi, ale niekontrolowane i nieodpowiednie reakcje zapalne wywołane przez Cd mogą powodować szkody, takie jak uszkodzenie normalnej tkanki postronnej osoby postronnej i promowanie chorób autoimmunologicznych (Hossein-Khannazer i wsp., 2020; Zhang i al., 2020). Odpowiedź zapalna wywołana przez Cd zaostrzyła choroby sercowo-naczyniowe i uszkodzenie wątroby, co sugeruje, że stan zapalny może odgrywać ważną rolę wnerkaprocesy patologiczne (Fagerberg i in., 2017; Almeer i in., 2019).

Epigenetyka odnosi się do dziedzicznych modyfikacji w ekspresji genów opartych na zmianach sekwencji innych niż DNA, a odwracalność tych modyfikacji umożliwia odkrycie nowych celów terapeutycznych (Vendetti i Rudin, 2013). Rodzina domen bromodomenowych i domen pozakońcowych (BET) obejmuje bromodomenę 2 (BRD2), BRD3, BRD4 i swoiste dla jąder bromodomenowych (BRDT), które charakteryzują się dwiema bromodomenami i wiążą się z acetylowanymi lizynami histonów i niehistonów ( Lochrin i in., 2014; Chatterjee i Bohmann, 2018). Białka BET działają jako koaktywator transkrypcji wielu genów, regulując w ten sposób cykl komórkowy, odpowiedź zapalną, stres oksydacyjny i inne procesy fizjologiczne w różnych modelach patologicznych (Jiao i wsp., 2020; Wang i wsp., 2019b). BRD4 jest szczególnie dobrze zbadanym członkiem rodziny białek BET, a narastające badania wykazały, że jest nowym celem epigenetycznym w regulacji różnychchoroby nerek, w tym przewlekłe zapalenie nerek, nefropatia cukrzycowa i eksperymentalne uszkodzenie nerek (Zeng i Zhou, 2002; Morgado-Pascual i in., 2019). Potwierdzono, że BRD4 uczestniczy w procesie transkrypcji zależnego od czynnika jądrowego-κB (NF-κB) w celu regulacji odpowiedzi zapalnych w wielu chorobach (Xu i Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez i wsp., 2017). BRD4 może być rekrutowany przez acetylowaną RelA (podjednostkę NF-κB, gen kodujący białko) w lizynie 310 (RelA-K310ac) przez jej bromodomeny, aktywując w ten sposób kinazę zależną od cykliny 9 (CDK9) i fosforylując polimerazę RNA II w celu promowania transkrypcja genów docelowych NF-κB (Hajmirza i wsp., 2018). Ostatnie badania sugerują, że inhibitory BRD4 mogą być potencjalną opcją terapeutyczną w przypadku chorób zapalnych. W szczurzych modelach uszkodzenia rdzenia kręgowego hamowanie BRD4 osłabiało odpowiedź zapalną i sprzyjało funkcjonalnej regeneracji mikrogleju (Dey i wsp., 2019). Również hamowanie BRD4 znosiło eksperymentalne zapalenie nerek w mysich modelach jednostronnej niedrożności moczowodu, przeciwbłonowej podstawowej GN i infuzji angiotensyny II (Suarez-Alvarez i wsp., 2017).

W związku z potencjalnym działaniem prozapalnym Cd i regulacyjnym wpływem BRD4 na stan zapalny, postawiliśmy hipotezę, że BRD4 jest zaangażowany w reakcję zapalną wywołaną przez Cd. Zgodnie z oczekiwaniami, BRD4 pośredniczy w procesie transkrypcji zapalnych cytokin w szczurzych modelach nerek eksponowanych na Cd. Nasze badanie ujawnia potencjalny mechanizm reakcji zapalnej wywoływanej przez Cd i dostarcza nowych informacji na temat terapii nefrotoksyczności indukowanej przez Cd.

2. Materiały i metody

2.1. Chemikalia i przeciwciała

Chlorek kadmu (CdCl2, bezwodny, 439800) zakupiono z Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). (plus)-JQ1 (HY-13030) otrzymano z MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA). Zestaw do ekstrakcji białka jądrowego zakupiono z Beyotime Institute of Biotechnology (Szanghaj, Chiny, P0027). Wydajny zestaw do chemiluminescencji (ECL, 32209) i odczynnik do oznaczania białka kwasu bicynchoninowego (BCA, 23225) uzyskano z Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, USA). Zastosowano przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko następującym białkom: NF-κB p65 (10745-1-AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) zakupiono od Grupa Proteintech (Wuhan, Chiny); -aktynę (3700 s), histon H3 (His3, 4499), sirtuinę 1 (Sirt1, 8469), normalną króliczą IgG (IgG, 4394) zakupiono z Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); Zakupiono BRD4 (ab128874), acetylotransferazę K (lizyny) 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (acetyl K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488 – skoniugowany osioł anty-króliczy (ab150073) z Abcam (Cambridge, Wielka Brytania). Drugie przeciwciała: kozie anty-mysie IgG (H plus L) (115-035-003) i kozie anty-królicze IgG (H plus L) (111-035-003) zakupiono od Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA ).

2.2. Zwierzęta i eksperymenty

Dwadzieścia cztery szczury Sprague-Dawley (samce, w wieku 6 tygodni, 110-120 g) zakupiono z Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, Chiny). Szczury miały swobodny dostęp do pożywienia i wody w pomieszczeniu o kontrolowanym środowisku (24 ± 5 ​​stopni, 12 godzinny cykl światło/ciemność). Procedury doświadczalne miały zastosowanie do dyrektywy Rady Wspólnot Europejskich 2010/63/UE w odniesieniu do doświadczeń na zwierzętach, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Yangzhou. Po tygodniu aklimatyzacji szczury losowo podzielono na cztery grupy: (1) Grupa kontrolna: wstrzyknięto dootrzewnowo odpowiedni rozpuszczalnik (sól fizjologiczna lub roztwór 2-hydroksypropylo- -cyklodekstryny). (2) Grupa Cd: CdCl2 (2 mg/kg masy ciała, rozpuszczony w soli fizjologicznej) wstrzykiwany dootrzewnowo przez 5 kolejnych dni w celu ustalenia modelu zatrucia Cd. (3) Grupa Cd plus JQ1: CdCl2 (2 mg/kg masy ciała) wstrzykiwany dootrzewnowo przez 5 kolejnych dni w celu ustalenia modelu zatrucia Cd oraz JQ1 (25 mg/kg masy ciała, rozpuszczony w 2-hydroksypropylu{{ 25}}roztwór cyklodekstryny) wstrzykiwany dootrzewnowo w 6–8 dniu. (4) Grupa JQ1: JQ1 (25 mg/kg masy ciała) wstrzyknięta dootrzewnowo w dniach 6-8. Statystyki zawartości Cd w surowicy szczurów i tkankach nerek zestawiono w Tabeli S1, odzwierciedlając pomyślne ustanowienie szczurzych modeli eksponowanych na Cd.

Po 8 dniach leczenia szczury uśmiercono przez zwichnięcie szyjki macicy w głębokim znieczuleniu po 12 godzinach na czczo. Tkanki nerki wycięto i 1 g tkanki każdej nerki szybko przechowywano w temperaturze -80 ◦C do późniejszej analizy Western blot i ilościowej analizy PCR (qPCR). Pozostałą ilość tkanki szybko utrwalono w 4% paraformaldehydzie (PFA) do barwienia immunohistochemicznego (IHC).

2.3. Hodowla komórkowa i leczenie

Linię komórkową nerki szczura (NRK{{0}}E) otrzymano z Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences. Komórki NRK-52E hodowano na pożywce Eagle'a zmodyfikowanej przez Dulbecco (DMEM, Gibco, 12800-017) zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, Gibco, 10437-028), penicylinę i streptomycynę (1 00 U/mL) w wilgotnych warunkach 5% CO2 i 95% powietrza przy 37 stopniach . CdCl2 (ultraczysty rozpuszczony w wodzie) i JQ1 (rozpuszczony dimetylosulfotlenek) przechowywano oddzielnie w temperaturze 4 i -20 stopni, a przed użyciem rozcieńczano w roztworach roboczych. Projekt eksperymentu był następujący: (1) Komórki traktowano 0, 2,5, 5, 10 μM Cd przez 12 godzin lub 5 μM Cd przez 0, 6, 12, 24 godziny w celu wykonania kolejnych testów. (2) Komórki traktowano 5 μM Cd i/lub 0,5 μM JQ1 przez 12 godzin w celu wykonania kolejnych testów. (3) Komórki transfekowano siBRD4 i/lub traktowano 5 µM Cd przez kolejne 12 godzin w celu wykonania kolejnych testów.

2.4. Transfekcja małych interferujących RNA

Transfekowaliśmy 20 nM małego interferującego RNA BRD4 (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) do komórek NRK-52E za pomocą odczynnika do transfekcji Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, nr kat. 13778150) przez 24 godziny zgodnie z instrukcją produktu. Zastosowano następujące sensowne siRNA:

siBRD4, o sekwencji docelowej 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (kontrola ujemna siRNA), z sekwencją docelową 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western blotting

Próbki tkanki nerki i komórki NRK-52E poddano lizie w buforze RIPA zawierającym inhibitory proteazy w celu wyekstrahowania całkowitego białka. Białko jądrowe zostało wcześniej przygotowane ze świeżych tkanek i komórek i przechowywane w temperaturze −80 stopni. Próbki białka (20–30 ug na próbkę) rozdzielono metodą elektroforezy SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu (Millipore, ISEQ00010). Błony zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem przez 90 min i inkubowano 12 godzin w 4 stopniach z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi: -aktyna (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Następnie błony płukano TBST i inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (1:10000) przez 90 min w temperaturze pokojowej (RT). Błony inkubowano z elektrochemiluminescencją (ECL, ThermoFisher Scientific) i oznaczono na Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Francja), a gęstość optyczną analizowano przy użyciu ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).

2.6. Barwienie immunofluorescencyjne (IF)

Komórki NRK{{0}}E wysiane na płytce 24-studzienkowej hodowano do około 60 procent konfluencji. Komórki traktowano 5 μM Cd i/lub 0,5 μM JQ1 przez 12 godzin, następnie utrwalano PFA (4 procent, 10 min), permeabilizowano za pomocą Triton X- 100 (0,1%, 15 min), blokowano BSA (2 procent, 90 min) w RT i inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem (NF-κB p65, rozcieńczenie 1:50) przez noc w 4 stopniach. Po trzykrotnym przemyciu PBS komórki inkubowano z przeciwciałem drugorzędowym (rozcieńczenie 1:500) przez 90 min i DAPI przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie komórki obserwowano pod mikroskopem konfokalnym. Translokację jądrową NF-κB analizowano w trzech niezależnych badaniach.

2.7. qPCR

Całkowite RNA tkanek nerek i komórek NRK-52E wyekstrahowano zestawem RNAiso Plus (Takara Bio, Shiga, Japonia). 1 ug całkowitego RNA użyto do zsyntetyzowania 1-łańcuchowego cDNA zgodnie z instrukcją producenta (Roche, Bazylea, Szwajcaria). Pobrano 2 µl komplementarnego DNA (cDNA) na studzienkę w celu wykrycia względnych poziomów mRNA przy użyciu LightCycler® 96 Real-Time PCR System (Roche). Oblicz względne poziomy mRNA zgodnie z równaniem 2-△△CT. Startery wymieniono w Tabeli S2. -aktyna była szczurzym genem referencyjnym.

2.8. Koimmunoprecypitacja (Co-IP)

Tkanki nerek i komórki NRK-52E poddano lizie w świeżo przygotowanym buforze do lizy komórek (20 mM HEPES–KOH pH 7,5, 150 mmol/l NaCl, 2 mmol/l EDTA, 1% Triton X{{8} }) zawierający PMSF. Kulki białka G (100 µl na próbkę, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) zmieszano z 2 ug przeciwciała BRD4, RelA-K310ac lub IgG na próbkę i obracano przez 10 min w temperaturze pokojowej. Następnie całkowite lizaty białkowe inkubowano z kompleksem kulki-przeciwciało przez noc w 4 stopniach. Po trzykrotnym przemyciu buforem do lizy komórek, immunoprecypitaty ponownie zawieszono w buforze do próbek 1 x SDS PAGE w celu skonfigurowania próbek. Białka docelowe wykrywano metodą western blotting z pierwszorzędowymi przeciwciałami anty-BRD4 i anty-RelA K310ac.

2.9. Analiza statystyczna

Wszystkie dane uzyskano z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów i wyrażono jako średnia ± SEM, o ile nie zaznaczono inaczej. Grupy eksperymentalne porównano za pomocą niesparowanego dwustronnego testu t Studenta lub jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) przy użyciu SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Istotność ustalono na p <>

3. Wyniki

3.1. Cd indukuje ekspresję zapalnych cytokin in vivo i in vitro

Udowodniono, że Cd jako zanieczyszczenie środowiska powoduje uszkodzenie nerek poprzez regulację szeregu procesów biologicznych (Wang i in., 2019c). W tym badaniu zbadano zmiany w poziomach transkrypcji cytokin zapalnych po ekspozycji na Cd w celu zbadania, czy zapalenie jest zaangażowane w nefrotoksyczność indukowaną Cd. Dane wykazały, że ekspozycja na Cd znacząco zwiększyła poziom interleukiny (IL)-1 i białka czynnika martwicy nowotworu (TNF) w komórkach NRK-52E (ryc. 1A-B) i tkankach nerek szczura (ryc. 1C -D). Tymczasem, jak pokazano na ryc. 1E-F, ekspozycja na Cd zwiększyła transkrypcyjne poziomy cytokin zapalnych (IL-1 , IL-6, TNF- i (białko chemoatraktantów monocytów-1) MCP -1) in vivo i in vitro. Odkrycia te sugerują, że Cd indukuje ekspresję cytokin zapalnych w nerkach szczurów.

3.2. BRD4 uczestniczy w indukowanym przez Cd procesie transkrypcji cytokin zapalnych

BRD4 to nowo opisany regulator epigenetyczny, który wiąże się z acetylowanymi histonami lub nie-histonami, aby regulować procesy zapalne w wielu chorobach. Tutaj, inhibitor JQ1 BRD4 i BRD4-siRNA zostały użyte do zbadania roli BRD4 w odpowiedzi zapalnej wywołanej przez Cd. Dane wykazały, że poziom Cd IL-1 i białka TNF z podwyższonym poziomem Cd był regulowany w dół przez traktowanie JQ1 in vivo i in vitro (ryc. 2A-D) oraz przez knockdown BRD4 in vitro (ryc. S1A-B). Tymczasem traktowanie JQ1 znacząco hamowało poziomy transkrypcji IL-1, IL-6, TNF- i MCP-1 w komórkach NRK-52E, wzmocnione przez Cd (ryc. 2E) i tkanki nerki szczura (ryc. 2F). Ponadto knockdown BRD4 znacząco obniżył poziom transkrypcji cytokin zapalnych w komórkach NRK-52E (ryc. S1C). Podsumowując, odkrycia te sugerują, że BRD4 jest krytycznym regulatorem wywołanej przez Cd odpowiedzi zapalnej w nerkach szczura.

3.3. Poziomy ekspresji BRD4 pozostają niezmienione po ekspozycji na Cd

Następnie wykryto zmiany w poziomach ekspresji BRD4 po ekspozycji na Cd. Komórki NRK-52E traktowano Cd w gradiencie stężeń, a szczurom wstrzykiwano Cd dootrzewnowo przez 5 dni w celu wyjaśnienia wpływu Cd na ekspresję BRD4 w nerkach in vivo i in vitro. Wyniki wykazały, że poziomy białka BRD4 były niezmienione zarówno w komórkach NRK-52E eksponowanych na Cd (ryc. 3A-B) jak i tkankach nerki szczura (ryc. 3C-D). Również poziomy mRNA BRD4 nie uległy zmianie po ekspozycji na Cd (ryc. 3E-F). Wyniki te wskazują, że BRD4 pośredniczy w wywołanej przez Cd odpowiedzi zapalnej nie zależy od zmian poziomu ekspresji.

3.4. BRD4 reguluje promowaną przez Cd translokację jądrową NF-B

W naszym badaniu zbadano rolę BRD4 w wywołanej przez Cd odpowiedzi zapalnej. Zmiana szlaku sygnalizacji NF-κB jest ściśle związana z transkrypcją cytokin zapalnych (Chi i wsp., 2021). Nasze badanie wykazało, że BRD4 jest zaangażowany w translokację jądrową regulowaną przez Cd i aktywację NF-κB. Najpierw określono subkomórkową lokalizację NF-κB przez barwienie IF i barwienie IHC. Dane na Fig. 4A i D wykazały, że JQ1 hamuje promowaną przez Cd translokację jądrową NF-κB w komórkach NRK-52E i tkankach nerki szczura. Tymczasem wyniki Western blot pokazały, że JQ1 znacząco obniżył poziom białka jądrowego NF-κB w NF-κB w warunkach podwyższonego Cd in vivo (Fig. 4B-C) i in vitro (Fig. 4E-F). Podobnie, knockdown BRD4 również znacząco hamował promowaną przez Cd translokację jądrową NF-κB (ryc. S2A) i zmniejszał poziomy białka jądrowego NF-κB w komórkach NRK-52E. Podsumowując, hamowanie BRD4 może zmniejszyć promowaną przez Cd translokację jądrową NF-κB, co sugeruje, że BRD4 pośredniczy w aktywacji szlaku sygnałowego NF-κB w nerkach po ekspozycji na Cd.

3.5. Cd zwiększa poziom acetylacji RelA K310

Badania potwierdziły, że BRD4 wiąże się z acetylowanym RelA K310 poprzez swoje domeny bromu, aby regulować transkrypcję zależną od NF-κB (Morgado-Pascual i wsp., 2019; Zhong i wsp., 2018). W ten sposób wykryto poziom acetylacji RelA K310 i ekspresję dwóch enzymów. Dane wykazały, że poziomy białka RelA-K310ac i acetylazy Ep300 były stale obniżane wraz ze wzrostem stężenia Cd, podczas gdy poziom białka deacetylazy Sirt1 stopniowo wzrastał w komórkach NRK-52E (ryc. 5A-B) i tkankach nerek szczura (ryc. 5C-D). Również poziomy mRNA Ep300 i Sirt1 wykazywały te same trendy (ryc. 5E-F). Wyniki te sugerują, że Cd promuje poziom acetylacji RelA K310, a zatem BRD4 może być zaangażowany w transkrypcję cytokin zapalnych wyzwalanych przez Cd w nerkach.

3.6. Cd zwiększa wiązanie BRD4 z RelA-K310ac, aby wzmocnić jego funkcję transkrypcyjną

Wiązanie z miejscami acetylacji jest podstawą regulacji transkrypcji BRD4 (Huang i wsp., 2009). Aby zweryfikować, czy Cd reguluje funkcję BRD4 przez zwiększenie wiązania BRD4 z RelA-K310ac, oddziaływanie między RelA-K310ac i BRD4 wykryto przez Co-IP. Dane na Fig. 6A wykazały, że Cd znacząco wzmocnił interakcję między RelA-K310ac i BRD4 w komórkach NRK-52E, co zostało złagodzone przez traktowanie JQ1 lub knockdown BRD4. Ten sam trend zaobserwowano również w tkankach nerki szczura (fig. 6B). Wyniki te pokazują, że Cd wzmacnia wiązanie BRD4 z RelA-K310ac, co promuje transkrypcję zależną od NF-κB, a następnie przyczynia się do wywołanej przez Cd odpowiedzi zapalnej.

4. Dyskusja

Cd został zgłoszony jako potencjalny wyzwalacz zapalenia ze względu na jego wysoką toksyczność, podczas gdy dokładny mechanizm wciąż nie jest w pełni poznany (Arab-Nozari i in., 2020; Ghosh, 2018). Nasze badanie potwierdziło, że Cd indukuje ekspresję zapalnych cytokin w szczurzych komórkach nerkowych i wykazało, że BRD4, epigenetyczny cel, który pełni krytyczne funkcje w szeregu procesów komórkowych, w tym zapalenia, przyczynia się do wywołanej przez Cd odpowiedzi zapalnej. Dalsze eksperymenty wykazały, że BRD4 jest zaangażowany w aktywację szlaku sygnałowego NF-κB promowanego przez Cd. Ponadto Cd zwiększał poziom acetylacji RelA K310, zwiększając w ten sposób wiązanie BRD4 z acetylowanym NF-κB RelA, aby promować transkrypcję cytokin zapalnych zależnych od NF-κB.

Zapalenie jest jednym z naturalnych mechanizmów obronnych przed egzogennymi chemikaliami, podczas gdy niekontrolowana i nieodpowiednia reakcja zapalna może uszkadzać normalne tkanki i wywoływać choroby autoimmunologiczne (Jian i wsp., 2018). Biologiczne markery zapalenia o podwyższonej zawartości Cd były często związane z różnymi chorobami. Badania wykazały, że zapalenie wywołane Cd bierze udział w miażdżycy (Tinkov et al., 2018). Ponadto Cd promuje ekspresję cytokin zapalnych, które przyczyniają się do uszkodzenia tkanki płuc i jąder oraz indukują hepatotoksyczność (Koopsamy Naidoo i wsp., 2019; Arafa i wsp., 2014). Te szkodliwe efekty są zgodne z naszymi wynikami, że odpowiedź zapalna jest zaangażowana w uszkodzenie nerek wywołane przez Cd. Coraz więcej badań koncentruje się na mechanizmach powstawania zapalenia wywołanego przez Cd. Jako dobrze zbadany członek rodziny białek BET, BRD4 odgrywa kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w stanach zapalnych. W tym przypadku JQ1 (inhibitor BRD4) i siRNA zostały użyte do deregulacji czynnościowej aktywności BRD4 i odkryto, że hamowanie BRD4 zmniejsza indukowaną przez Cd transkrypcję cytokin zapalnych w nerkach szczura, co sugeruje, że BRD4 uczestniczy w wywołanej przez Cd odpowiedzi zapalnej . Ogólnie uważa się, że rozregulowanie ekspresji BRD4 jest kluczowym wydarzeniem w występowaniu odpowiedzi zapalnej. W uszkodzeniu rdzenia kręgowego, patologicznym przeroście serca i innych chorobach związanych z zapaleniem zaburzona ekspresja BRD4 przyczyniła się do ekspresji cytokin zapalnych (Zhu i wsp., 2020; Marazzi i wsp., 2018; Ren i wsp., 2019). Jednak Cd nie miał wpływu na poziomy ekspresji BRD4 w obecnych warunkach eksperymentalnych, co skłoniło nas do rozważenia, czy BRD4 pośredniczy w wywołanej przez Cd odpowiedzi zapalnej poprzez inne szlaki.

NF-κB jest ważnym czynnikiem regulacyjnym w procesach zapalnych i odpowiada za kontrolę ekspresji wielu mediatorów stanu zapalnego (Lawrence, 2009). Badania wykazały, że BRD4 bierze udział w regulacji szlaku sygnałowego NF-κB. Huang i in. (2017) zasugerowali, że BRD4 regulowana przez IKK aktywacja NF-κB za pośrednictwem szlaków p38 i JNK-MAPK. Wang i in. (2019a) stwierdzili, że knockdown BRD4 lub leczenie JQ1 zablokowały szlak sygnalizacyjny NF-κB aktywowany lipopolisacharydem (LPS) w mikrogleju. Meng i in. (2014) wykazali, że leczenie JQ1 blokuje ekspresję cytokin zapalnych poprzez hamowanie aktywacji NF-κB w potraktowanych LPS komórkach RAW 264,7. Raporty te wskazują, że BRD4 pośredniczy w aktywacji NF-κB w wielu modelach zapalenia, podczas gdy hamowanie BRD4 jest skutecznym podejściem terapeutycznym do leczenia przeciwzapalnego. W obecnym badaniu hamowanie BRD4 zablokowało jądrową translokację NF-κB w tkankach nerki szczura eksponowanych na Cd i komórkach NRK-52E, co sugeruje, że BRD4 pośredniczy w szlaku sygnalizacyjnym NF-κB aktywowanym przez Cd.

Zazwyczaj po aktywacji NF-κB przez różne bodźce i translokacji do jądra, BRD4 wiąże się z acetylowanym NF-κB RelA w miejscu K310, co zwiększa jego stabilność i aktywność transkrypcyjną w jądrze (Hajmirza i wsp., 2018). Zatem poziom acetylacji RelA K310 wpływa na funkcję regulacyjną BRD4 w odpowiedzi zapalnej. W neuronach hipokampa deacetylaza Sirt1 pośredniczyła w deacetylacji RelA K310 w celu regulacji ekspresji BACE1, co przyczyniło się do produkcji amyloidu neuronalnego (Flores-Leon i wsp., 2019). W komórkach glejaka stres terapii fotodynamicznej obniżył poziom deacetylazy Sirt1 i aktywował acetylazę Ep300, co zwiększyło poziomy RelA-K310ac i doprowadziło do zwiększonej produkcji tlenku azotu sprzyjającego przeżyciu (Fahey i wsp., 2019). Nasze badanie wykazało, że Cd promuje poziom acetylacji RelA K310 poprzez zwiększenie ekspresji Ep300 i zmniejszenie ekspresji Sirt1, co wskazuje, że Cd wpływa na funkcję regulacyjną BRD4 poprzez zwiększenie poziomu acetylacji RelA K310.

Warto zauważyć, że nasze wyniki wykazały, że leczenie JQ1 było skuteczniejsze niż knockdown BRD4 w łagodzeniu reakcji zapalnej wywołanej przez Cd. JQ1 ma wysokie powinowactwo wiązania z BRD4 i może prawie całkowicie blokować wiązanie BRD4 z chromosomem, podczas gdy siBRD4 może jedynie zakłócać ekspresję białka BRD4 w celu zmniejszenia wiązania BRD4 z miejscem docelowym, co sugeruje, że BRD4 pośredniczy w odpowiedzi zapalnej wywołanej przez Cd może zależeć od wiązanie z acetylowanym NF-κB RelA. Ostatnie badania wykazały podobny mechanizm regulacyjny: po jądrowej translokacji i aktywacji NF-κB, BRD4 wszedł w interakcję z acetylowanym RelA, aby koaktywować transkrypcyjną aktywację NF-κB (Huang i wsp., 2009). RelA-BRD4 był rekrutowany do docelowych promotorów NF-κB w różnych stanach stymulacji zapalnej, podczas gdy leczenie JQ1 działało poprzez zapobieganie wiązaniu BRD4 z acetylowanym NF-κB RelA, zmniejszając w ten sposób aktywność transkrypcyjną NF-κB (Zou i wsp., 2014). Nasze wyniki wykazały, że hamowanie BRD4 blokuje wzmocnioną przez Cd interakcję między BRD4 i RelA-K310ac w nerkach szczurów, potwierdzając powyższe wyniki, że hamowanie BRD4 hamuje aktywność transkrypcyjną NF-κB indukowaną przez Cd, co wskazuje, że Cd wzmacnia wiązanie BRD4 z acetylowanym NF-κB RelA w celu zwiększenia transkrypcji cytokin zapalnych.

Podsumowując, nasze badanie ujawniło mechanizmy regulacyjne BRD4 w wywołanej przez Cd odpowiedzi zapalnej w nerkach szczura: (1) BRD4 pośredniczy w translokacji i aktywacji jądrowej NF-κB indukowanej przez Cd. (2) Cd zwiększa poziom acetylacji RelA K310 i zwiększa wiązanie BRD4 z acetylowanym NF-κB RelA, co promuje transkrypcję cytokin zapalnych zależnych od NF-κB. Ponadto inhibicja BRD4 znacząco złagodziła podniesione przez Cd poziomy cytokin zapalnych, co sugeruje, że ukierunkowany BRD4 może zostać opracowany jako skuteczny środek leczenia chorób zapalnych, w tym zapalenia nerek wywołanego przez Cd.

Oświadczenie o wkładzie autorskim CRediT

Zhongguo Gong: Konceptualizacja, Metodologia, Wizualizacja, Analiza formalna, Walidacja, Badanie, Analiza formalna, Kuracja danych, Pisanie – oryginalny projekt. Gang Liu: Konceptualizacja, Metodologia, Wizualizacja, Kuracja danych, Pisanie – oryginalny projekt, Administracja projektu, Pozyskiwanie finansowania. Wenjing Liu: Oprogramowanie, zasoby, metodologia, analiza formalna. Hui Zou: Administracja projektu, nadzór. Ruilong Song: Oprogramowanie, analiza formalna, nadzór. Hongyan Zhao: oprogramowanie, analiza formalna, nadzór. Yan Yuan: Nadzór. Jianhong Gu: Nadzór. Jianchun Bian: Pozyskiwanie funduszy, nadzór. Jiaqiao Zhu: Pisanie – recenzja i edycja, Nadzór. Zongping Liu: Pisanie – recenzja i edycja, Superwizja,

Administracja projektu, Pozyskiwanie dofinansowania, Konceptualizacja.

Deklaracja Konkurencyjnego Interesu

Autorzy deklarują, że nie znają sprzecznych interesów finansowych ani osobistych relacji, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Potwierdzenie

Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych w Chinach (nr 31872533, 31902329, 32072933), Krajowy Program Badań i Rozwoju Kluczowych Chin (nr 2016YFD0501208) oraz projekt Priorytetowego Programu Rozwoju Akademickiego Jiangsu Higher Education Instytucja (PADP). Manuskrypt został zredagowany pod kątem poprawnego języka angielskiego, gramatyki, interpunkcji, ortografii i ogólnego stylu przez jednego lub więcej wysoko wykwalifikowanych, anglojęzycznych redaktorów w ELIXIGEN.

Bibliografia

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Mleczko pszczele łagodzi nefrotoksyczne działanie kadmu u samców myszy. Nauka. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Wspólna ekspozycja na nietoksyczne poziomy kadmu i fluoru wywołuje hepatotoksyczność u szczurów wyzwalanie mitochondrialnych uszkodzeń oksydacyjnych, apoptozy i szlaków NF-kB. Otaczać. Nauka. Zanieczyszczenia. Res. wewn. 27 (19), 24048-24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Proszek z nasion kozieradki łagodzi wywołane kadmem uszkodzenie jąder i hepatotoksyczność u samców szczurów. Do potęgi. Toksykol. Patol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting na Nrf2: jak sygnalizacja Nrf2 może wpływać na działanie terapeutyczne inhibitorów białek BET. Bioeseje 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Rola selenoproteiny S w tworzeniu pozakomórkowej pułapki neutrofili zależnej od reaktywnych form tlenu indukowanej przez selen- niedoborowe zapalenie tętnic. Redoks Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J. ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 kieruje rozwojem krwiotwórczych komórek macierzystych i moduluje reakcje zapalne makrofagów. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., Born, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Ekspozycja na kadm jest związana z rozpuszczalnym receptorem aktywatora plazminogenu urokinazy, krążącym markerem stanu zapalnego i przyszłej choroby sercowo-naczyniowej. Otaczać. Res. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Zdarzenia sygnalizacyjne w górę prowadzą do zwiększonej produkcji tlenku azotu sprzyjającego przeżyciu w fotodynamicznie prowokowanych komórkach glejaka. Wolna Rada. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Zmienność różnych metabolitów i metali ciężkich w Oryza sativa L., związanych z przewlekłą chorobą nerek o nieznanej etiologii na Sri Lance. Chemosfera 247, 125836.

Flores-Leon,M.,Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Ubytek NAD (plus) wywołany kwasem palmitynowym jest związany ze zmniejszoną funkcją SIRT1 i zwiększoną ekspresją BACE1 w neuronach hipokampa. Neurochem. Res. 44 (7), 1745-1754.

Ghosh, KNI, 2018. Leczenie kadmem wywołuje bąblowicę, uszkodzenie DNA, stan zapalny i apoptozę w tkance sercowej szczurów albinosów Wistar. Otaczać. Toksykol. Pharmacol. 59, 43–52. zapalenie i rak. Biomedycyna 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Ostra ekspozycja na kadm wywołuje przedłużoną neutrofilię wraz z opóźnioną indukcją czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów w wątrobach myszy. Łuk. Toksykol. 90 (12), 3005-3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F.,Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Skutki narażenia na kadm w wywoływaniu stanu zapalnego. Immunofarmakol. Immunotoksykol. 42 (1), 1–8.